CN116970734B - 一种棉花多心室控制基因GaMV连锁的SNP位点及其应用 - Google Patents

一种棉花多心室控制基因GaMV连锁的SNP位点及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116970734B
CN116970734B CN202311226925.3A CN202311226925A CN116970734B CN 116970734 B CN116970734 B CN 116970734B CN 202311226925 A CN202311226925 A CN 202311226925A CN 116970734 B CN116970734 B CN 116970734B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cotton
sequence
gamv
snp
ventricles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202311226925.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116970734A (zh
Inventor
魏云晓
张锐
孟志刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biotechnology Research Institute of CAAS
Original Assignee
Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotechnology Research Institute of CAAS filed Critical Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority to CN202311226925.3A priority Critical patent/CN116970734B/zh
Publication of CN116970734A publication Critical patent/CN116970734A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116970734B publication Critical patent/CN116970734B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
    • A01H1/045—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection using molecular markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于棉花多心室品种选育技术领域，涉及一种棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点及其应用。本发明SNP位点位于棉花参考基因组Gossypiumarboreum/A2_HAU的3号染色体第112281318位核苷酸，棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点的碱基为T或A。利用该SNP标记进行棉花心室品种初期筛选，达到分子辅助育种的目的，可大大缩短育种周期提高育种效率，实现将多心室优异资源用于主载品种分子改良的目标。

Description

一种棉花多心室控制基因GaMV连锁的SNP位点及其应用
技术领域
本发明涉及一种棉花品种选育技术领域，特别涉及一种与控制棉花心室数目基因GaMV连锁的SNP分子标记及其应用。
背景技术
棉花是重要的经济作物之一，不仅是纺织工业原料，更是重要的战略物资，在国民经济发展中占有重要地位，中国是最大的原棉生产国和消费国。棉花全基因组序列的发布，极大促进了棉花分子生物学研究，为分子设计辅助育种提供了坚实的基础。进一步明确基因功能，寻找控制棉花重要性状的关键基因，是目前棉花分子生物学的首要内容。
近年来，随着棉花种质资源遗传多样性日渐狭窄，中国棉花单位面积产量增加缓慢，限制了棉花种植产业的健康持续发展。产量是植棉效益的基础，在目前耕地数量有限的情况下，高产仍是育种家进行棉花育种的重要目标之一。棉铃心室数目是控制棉花产量的重要因素，目前生产上棉花有4个栽培种，分别为二倍体的亚洲棉（Gossypiumarboreum,AA, 3心室）和草棉（Gossypiumherbaceum, AA, 3心室）、四倍体的陆地棉（Gossypiumhirsutum, AADD, 4-5心室）和海岛棉（Gossypiumbarbadense, AADD, 3心室）。其中，陆地棉（4-5心室）心室数目多，产量高，其产量约占世界棉花产量的95%以上，而海岛棉品质优良。但是棉花多心室相关研究鲜有报道，缺乏心室性状基因克隆研究及可应用的筛选标记的应用，严重阻碍了多心室棉花育种进程。通过鉴定棉花心室性状基因，开发其紧密连锁的分子标记进行品种初期筛选，达到分子辅助育种的目的，可大大缩短育种周期提高育种效率，实现将多心室优异资源用于主载品种分子改良的目标。因此，棉花育种领域的科研和实践中需要提出一种棉花心室控制基因GaMV连锁SNP位点及dCAPS标记。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种棉花多心室控制基因GaMV及其连锁的SNP位点。
根据该SNP位点，本发明的目的之二在于提供用于检测上述SNP位点的多态性或基因型的引物对。
本发明的目的之三在于提供用于检测棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点的多态性或基因型的物质。
本发明的目的之四在于提供上述棉花多心室控制基因GaMV、SNP位点、引物对和物质的用途。
本发明的目的之五在于提供一种鉴定或辅助鉴定棉花心室个数的方法。
本发明所述棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点位于棉花参考基因组Gossypiumarboreum/A2_HAU（https://www.cottongen.org/species/Gossypiumarboreum/A2_HAU）的3号染色体第112281318位核苷酸（ Chr3G：112281318），所述棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点的碱基为T或A。针对该SNP位点，本发明提供了如下几个技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于检测棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点的多态性或基因型的引物对，所述棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点位于棉花参考基因组Gossypiumarboreum/A2_HAU（ https://www.cottongen.org/species/Gossypium_arboretum/A2_HAU）的3号染色体第112281318位核苷酸（或者说，位于序列表中序列3所示的核苷酸序列的第1289位），所述棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点的碱基为T或A。
进一步地，所述引物对包括：
上游引物MV-F，其核苷酸序列为如下（1）或（2）：
（1）如序列表中序列1所示（序列1为TTGGAGGCATTCCACCTGAGTATGGGTTCT），
（2）序列1中的一个或几个核苷酸经取代、缺失或增加后获得的与序列1具有相同功能的序列；
下游引物MV-R，其核苷酸序列为如下（3）或（4）：
（3）如序列表中序列2所示（序列2为GCCATGTCGAGAAGTTCGAGTTGACTT），
（4）序列2中的一个或几个核苷酸经取代、缺失或增加后获得的与序列2具有相同功能的序列。
上游引物MV-F中的（2）所要表达的是，序列1的核苷酸序列中有1、2或3个被其它核苷酸取代或者缺失，或者序列1中增加了1、2或3个核苷酸后得到的新的序列仍然可以用于扩增上述SNP位点。
下游引物MV-R中的（2）所要表达的是，序列2的核苷酸序列中有1、2或3个被其它核苷酸取代或者缺失，或者序列1中增加了1、2或3个核苷酸后得到的新的序列仍然可以用于扩增上述SNP位点。
第二方面，本发明提供一种用于检测棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点的多态性或基因型的物质，所述物质包括：
上述引物对，以及XbaI限制性内切酶；
所述棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点位于棉花参考基因组Gossypiumarboreum/A2_HAU的3号染色体第112281318位核苷酸，所述棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点的碱基为T或A。
第三方面，本发明提供了上述引物对或者上述物质在如下方面之一中的应用：
（a）鉴定或辅助鉴定棉花心室个数中的应用；
（b）制备用于鉴定或辅助鉴定棉花心室个数的产品中的应用；
（c）在棉花多心室育种中的应用。
在第三方面的应用中，所述产品典型非限定性地可以为含有引物对或物质的试剂或试剂盒，还可以含有其它PCR或酶切的常用试剂。
第四方面，本发明提供了棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点在鉴定或辅助鉴定棉花心室个数中的应用或者在棉花多心室育种中的应用，所述棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点位于棉花参考基因组Gossypiumarboreum/A2_HAU的3号染色体第112281318位核苷酸，所述棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点的碱基为T或A。
在上述第三方面和第四方面的应用中，进一步地，所述棉花心室个数为3个或5个。
在上述第四方面的应用中，用第一方面的引物对或者第二方面的物质检测棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点的基因型来鉴定或辅助鉴定棉花心室个数，当SNP位点的基因型为T:T时，棉花心室个数为3个，当SNP位点的基因型为A:A时，棉花心室个数为5个，当SNP位点的基因型为A:T时，棉花心室个数为3个。
第五方面，本发明提供一种鉴定或辅助鉴定棉花心室个数的方法，包括如下步骤：
检测待测棉花基因组中SNP位点的基因型，当SNP位点的基因型为T:T时，棉花心室个数为3个，当SNP位点的基因型为A:A时，棉花心室个数为5个，当SNP位点的基因型为A:T时，棉花心室个数为3个，其中SNP位点位于棉花参考基因组Gossypiumarboreum/A2_HAU的3号染色体第112281318位核苷酸。
在第五方面的方法中，进一步地，所述检测待测棉花基因组中SNP位点的基因型的方法包括如下（1）或（2）：
（1）直接测序，
（2）以待测棉花基因组为模板、用能扩增SNP位点的引物对进行PCR扩增，得到的扩增产物，然后采用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，分析酶切产物的大小，根据酶切产物的大小来确定待测棉花基因组中SNP位点的基因型。
更进一步地，所述能扩增SNP位点的引物对为第一方面的所述引物对，所述限制性内切酶为XbaI限制性内切酶。
更进一步地，当酶切产物大小为316bp时，待测棉花基因组中SNP位点的基因型为T:T，棉花心室数为3个；当酶切产物大小为289bp时，待测棉花基因组中SNP位点的基因型为A:A，棉花心室数为5个；当酶切产物大小为289bp、316bp时，待测棉花基因组中SNP位点的基因型为A:T，棉花心室数为3个。
优选地，所述PCR扩增的条件依次为：94℃预变性15分钟；在 94℃下变性 30 s，60℃下退火 30 s，72℃下延伸 35s，重复35次；72℃保持4min，使产物延伸完整。
第六方面，本发明提供一种棉花多心室控制基因GaMV，棉花多心室控制基因GaMV的核苷酸序列如序列表中序列3或序列4所示。其中，序列3所示的基因控制的性状为棉花具有3个心室，序列4所示的基因控制的性状为棉花具有5个心室。
第七方面，棉花多心室控制基因GaMV在鉴定或辅助鉴定棉花心室个数中的应用或者在棉花多心室育种中的应用，其中，棉花多心室控制基因GaMV的核苷酸序列如序列表中序列3或序列4所示。
本发明的待测棉花可以是任意品种的棉花，特别是亚洲棉突变体材料MT和与其他品种的杂交种，更特别是亚洲棉突变体材料MT和亚洲棉对照材料SXY1的杂交后代。
本发明的有益效果：
本发明利用亚洲棉突变体材料MT‘5-6心室’和亚洲棉对照材料SXY1‘3心室’为亲本，构建F2分离群体，通过BSA-seq对棉铃心室数目性状初定位，后结合突变体材料三代测序、转录组分析及亚洲棉重测序数据，筛选定位到控制棉花心室的候选基因，命名为GaMV；并获得了SNP位点，根据突变体材料和野生型SNP差异设计dCAPS标记（TTAA），该标记可区分3心室及5心室材料，为棉花多心室材料筛选奠定分子基础。本发明通过筛选定位棉花心室性状基因，开发其紧密连锁的分子标记，利用该SNP标记进行棉花心室品种初期筛选，达到分子辅助育种的目的，可大大缩短育种周期提高育种效率，实现将多心室优异资源用于主载品种分子改良的目标。
附图说明
图1是棉花多心室控制基因GaMV的筛选定位过程图，其中：A为3号染色体ΔSNP-index值；B：候选基因筛选；C：候选基因功能注释。
图2是部分待测棉花的PCR产物经酶切后的电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进或应用的基础，并不以任何方式构成对本发明的具体限制。
下述实施例中的实验方法中，如无特殊说明，均为常规方法，可按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。
本发明中所使用的棉花品种的来源：
亚洲棉突变体材料MT（5心室）为本实验室通过2%浓度的EMS处理亚洲棉 SXY1种子，时间为2小时，然后将种子按照常规程序种植于田间，通过肉眼筛选出具有5心室的突变体材料MT。
亚洲棉对照材料SXY1来源于中国农业科学院棉花研究所种质资源库。
以下实施例中涉及的DNA提取均采用天根植物基因组DNA提取试剂盒进行提取。
通过肉眼观测待测棉花品种的心室个数。
实施例1棉花多心室控制基因GaMV以及紧密连锁的分子标记的获得
一、棉花多心室控制基因GaMV的筛选定位方法
以亚洲棉多心室材料MT和对照材料SXY1为亲本构建的F2分离群体为材料，选取5心室和3心室单株各30株，提取基因组DNA等量混合，构建基因池，进行BSA-seq，发现第03号染色体上的候选区域Δ（SNP-index）≥0.6，参见图1A。为进一步缩小区间，实验对亚洲棉多心室材料进行三代denovo测序，对亚洲棉多心室材料MT及对照材料SXY1进行转录组测序，综合三代测序结果、转录组分析结果、BSA测序结果及公开发表的66个亚洲棉重测序数据，根据筛选条件为：5心室混池的ref_read数量为0；3心室混池的alt_read数量不为0；突变体材料三代测序数据的alt_read数量为0；重测序表型为0/0（位点没有变异的样本数大于等于45）；重测序表型中无输出样本；在突变体材料中差异表达的有6个候选基因，参见图1B。基因功能注释（图1C）表明，Garb_03G018680编码富含亮氨酸受体样蛋白激酶家族蛋白Leucine-rich receptor-like protein kinase family protein（CLV1），具有细胞外富含亮氨酸结构域的推定受体激酶。控制茎和花分生组织的大小，并有助于建立和维持花分生茎的特性，由KAPP（激酶相关蛋白磷酸酶）负调控，且研究表明CLV3肽直接结合CLV1胞外域。其他基因功能注释为：突触结合蛋白、丝氨酸、细胞色素b、支架蛋白等，均与细胞分裂无关。综上结果，实验表明亚洲棉多心室性状候选基因为Garb_03G018680，命名为GaMV。
二、棉花多心室控制基因GaMV全长DNA以及紧密连锁的分子标记的获取
棉花基因组DNA的提取采用CTAB法，以供试5心室（MT）/3心室(SXY1)棉花材料基因组DNA为模板，利用GaMV基因全长扩增上下游引物分别进行基因全长PCR扩增，得到GaMV基因在5心室（MT）/3心室(SXY1)材料上的基因全长，全长均计3728bp，3心室(SXY1)材料的GaMV基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示，5心室（MT）材料的GaMV基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示（序列4相对于序列3仅是第1289位的碱基由T变为A）。利用DNAMAN软件对5心室/3心室材料的GaMV基因全长进行比对分析，发现在5心室（MT）/3心室(SXY1)材料间GaMV基因的第1289位存在一个SNP，3心室材料中碱基为T，而5心室材料中碱基为A，造成基因表达提前终止。该SNP可作为心室材料紧密连锁的分子标记，应用于棉花心室材料育种。其中上述PCR扩增时使用的两组引物对如下：
用于3心室(SXY1) 材料/5心室（MT）材料GaMV基因扩增的引物对为：
F1:GCGTCTGACAGTAATGCAGTGG（序列5），
R1:TCGCCTACGAATGACGGTATC（序列6）；
PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，共35个循环。
F2:CGGACAGTTTCTCTGCTTTGAA（序列7），
R2:TCACCCTTTATGGCAGGTTAGT（序列8）。
PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，共35个循环。
采用上述两组引物对进行PCR扩增反应的反应体系(20μL)中含有：25ng模板DNA，0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，0.2mM的dNTP mix；0.5U Taq DNA聚合酶，1×PCR Buffer(Fermentas)2μL，ddH2O补足到20μL。
三、棉花多心室控制基因GaMV的cDNA和蛋白质序列鉴定分析
利用5心室（MT）/3心室(SXY1)棉花材料，分别选取幼嫩叶片组织提取总RNA，进行反转录合成mRNA的第一链(cDNA)，以该mRNA第一链为模板利用GaMV基因的全长设计的引物对进行PCR扩增，分别获取5心室（MT）/3心室(SXY1)突变体材料中的cDNA(mRNA)序列全长，总长度2943 bp，3心室(SXY1)棉花材料的cDNA核苷酸序列如序列表中序列9所示，该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列10所示，5心室（MT）棉花材料的cDNA核苷酸序列相对于序列9，仅是将序列9中第719bp位碱基由T变为A。利用DNAMAN软件对5心室（MT）/3心室(SXY1)棉花材料的GaMV基因全长进行比对分析，发现该基因在5心室（MT）/3心室(SXY1)棉花材料中均有两个外显子，一个内含子，但是在cDNA序列的719bp的位置3心室材料的碱基为T，5心室材料的碱基为A，正是由于在5心室（MT）/3心室(SXY1)材料中这一处碱基的差别，从而导致氨基酸编码的差异，由此导致5心室材料基因在该处表达终止，进而导致心室性状发生变化。
用于PCR扩增的引物对为：
F3:ATGAGAAGCTTTTACAGTT（序列11），
R3:TCAAAAGGTGAGGAGGTTTGG（序列12）。
PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃30s，60℃30s，72℃3min，共35个循环。
实施例2棉花多心室控制基因GaMV的功能验证
待测材料：以在5心室（MT）/3心室(SXY1)材料为亲本，构建F2遗传群体，从中随机选取213个单株进行棉花心室数量鉴定。将上述待测材料的种子种植于河北廊坊农科院基地，采用CTAB法从幼苗期叶片中提取各待测材料的基因组DNA，并以各基因组DNA为模板，利用上下游引物F:CCAAGGCAGTTTCCCTGGAGAA（序列13），R:TCGCCTACGAATGACGGTATC（序列6）进行GaMV基因PCR扩增，然后将PCR产物测序。待现蕾后检测各个待测材料的心室数。最终确认上述213份待测材料中有48株幼苗具有MT材料所示的GaMV基因即序列4所示的核苷酸序列，且该48株材料在田间的表型为5心室。因此，基因水平的鉴定和田间表型一致，证明序列4所示的GaMV基因控制棉花的心室数量为5个。本实施例的所述PCR扩增体系中各成分用量参见实施例1第二部分，PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃30s，65℃30s，72℃30s，共35个循环。
实施例3 SNP位点和dCAPS标记在鉴定棉花心室个数上的应用
对实施例1开发的分子标记，进行进一步的群体验证。
依据dCAPs引物在线设计网站http://helix .wustl .edu/dcaps/dcaps .html，开发设计与GaMV基因紧密连锁的 d C A P s 分子标记，其中正向和反向扩增引物分别如序列表中序列1和序列2所示。
选取实施例1中的F2群体中213份棉花及20份由MT回交转育的5心室棉花材料为验证材料，应用上述序列1和序列2所示的引物进行PCR扩增，并对扩增产物进行XbaI限制性内切酶酶切，酶切产物电泳后根据电泳结果确定待测棉花品种的SNP位点的基因分型，从而对棉花多心室控制基因GaMV连锁的SNP分子标记应用于鉴定棉花心室个数或者辅助育种的准确性进行验证。
PCR反应在Hydrocycler水浴PCR仪上进行。
PCR扩增的体系为：25ng模板DNA，0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，0.2mM的dNTPmix；0.5U Taq DNA聚合酶，1×PCR Buffer(Fermentas)2μL，ddH2O补足到20μL。
扩增条件依次为：先于94℃保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度57°，保持30秒钟，使引物与模板充分退火；在72℃保持1分钟（扩增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环35次，使扩增的DNA片段大量累积。最后，在72℃保持4min，使产物延伸完整，4℃保存。
PCR扩增产物的酶切方法：酶切体系(30μL)中含有：PCR扩增产物10μL，10×Buffer R(购自Thermo公司)2μL，XbaI (购自Thermo公司)1 .0μL，灭菌双蒸水补足到30μl。所述的酶切反应程序为：阶段1：65℃温育10h；阶段2：80℃ 20min失活；阶段3：4℃保存。
将得到的各材料的基因分型结果与实测的棉花心室数量进行对比，当酶切产物大小为316bp时，待测棉花基因组中SNP位点的基因型为T:T，如果棉花心室数为3个，则表示检测结果准确，否则认为鉴定结果不准确；当酶切产物大小为289bp时，待测棉花基因组中SNP位点的基因型为A:A，如果棉花心室数为5个，则表示检测结果准确，否则认为鉴定结果不准确；当酶切产物大小为316bp 、和289bp时，待测棉花基因组中SNP位点的基因型为A:T，棉花心室数为3个，则表示检测结果准确，否则认为鉴定结果不准确。
部分材料的电泳结果参见图2，部分材料的酶切产物大小见表1，基因分型结果见表1。
将得到的各材料的基因分型结果与实测的棉花心室数量进行对比，二者一致率为100%，表明本发明的SNP分子标记检测的准确率为100%，可以应用于棉花分子标记辅助选择育种。
表1 其中24份测试材料的基因分型结果和实测的棉花心室数量
。

Claims (9)

1.用于检测棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点的多态性或基因型的引物对，其特征在于，所述棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点位于棉花参考基因组Gossypiumarboreum/A2_HAU的3号染色体第112281318位核苷酸，所述棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点的碱基为T或A。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对包括：
上游引物MV-F，其核苷酸序列为如下（1）或（2）：
（1）如序列表中序列1所示，
（2）序列1中的一个或几个核苷酸经取代、缺失或增加后获得的与序列1具有相同功能的序列；
下游引物MV-R，其核苷酸序列为如下（3）或（4）：
（3）如序列表中序列2所示，
（4）序列2中的一个或几个核苷酸经取代、缺失或增加后获得的与序列2具有相同功能的序列。
3.用于检测棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点的多态性或基因型的物质，其特征在于，所述物质包括：
权利要求1或2所述的引物对，以及XbaI限制性内切酶；
所述棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点位于棉花参考基因组Gossypiumarboreum/A2_HAU的3号染色体第112281318位核苷酸，所述棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点的碱基为T或A。
4.权利要求1或2所述的引物对或者权利要求3所述的物质在如下方面之一中的应用：
（a）鉴定或辅助鉴定棉花心室个数中的应用；
（b）制备用于鉴定或辅助鉴定棉花心室个数的产品中的应用；
（c）在棉花多心室育种中的应用；
所述棉花心室个数为3个或5个。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，用权利要求1或2所述的引物对或者权利要求3所述的物质检测棉花多心室控制基因GaMV连锁SNP位点的基因型来鉴定或辅助鉴定棉花心室个数，当SNP位点的基因型为T:T时，棉花心室个数为3个，当SNP位点的基因型为A:A时，棉花心室个数为5个，当SNP位点的基因型杂合为A:T时，棉花心室个数为3个。
6.一种鉴定或辅助鉴定棉花心室个数的方法，其特征在于，包括如下步骤：
检测待测棉花基因组中SNP位点的基因型，当SNP位点的基因型为T:T时，棉花心室个数为3个，当SNP位点的基因型为A:A时，棉花心室个数为5个，当SNP位点的基因型杂合为A:T时，棉花心室个数为3个，其中SNP位点位于棉花参考基因组Gossypiumarboreum/A2_HAU的3号染色体第112281318位核苷酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测待测棉花基因组中SNP位点的基因型的方法包括如下（1）或（2）：
（1）直接测序，
（2）以待测棉花基因组为模板、用能扩增SNP位点的引物对进行PCR扩增，得到扩增产物，然后采用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，分析酶切产物的大小，根据酶切产物的大小来确定待测棉花基因组中SNP位点的基因型。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述能扩增SNP位点的引物对为权利要求2中所述引物对，所述限制性内切酶为XbaI限制性内切酶；
当酶切产物大小为316bp时，待测棉花基因组中SNP位点的基因型为T:T，棉花心室数为3个；当酶切产物大小为289bp时，待测棉花基因组中SNP位点的基因型为A:A，棉花心室数为5个；当酶切产物大小为316bp和289p时，待测棉花基因组中SNP位点的基因型杂合为A:T，棉花心室数为3个。
9.用于检测棉花多心室控制基因GaMV的物质在鉴定或辅助鉴定棉花心室个数中的应用或者在棉花多心室育种中的应用，其中，棉花多心室控制基因GaMV的核苷酸序列如序列表中序列3或序列4所示，3心室SXY1材料的GaMV基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示，5心室MT材料的GaMV基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示，序列4相对于序列3仅是第1289位的碱基由T变为A。
CN202311226925.3A 2023-09-22 2023-09-22 一种棉花多心室控制基因GaMV连锁的SNP位点及其应用 Active CN116970734B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311226925.3A CN116970734B (zh) 2023-09-22 2023-09-22 一种棉花多心室控制基因GaMV连锁的SNP位点及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311226925.3A CN116970734B (zh) 2023-09-22 2023-09-22 一种棉花多心室控制基因GaMV连锁的SNP位点及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116970734A CN116970734A (zh) 2023-10-31
CN116970734B true CN116970734B (zh) 2024-02-02

Family

ID=88473343

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311226925.3A Active CN116970734B (zh) 2023-09-22 2023-09-22 一种棉花多心室控制基因GaMV连锁的SNP位点及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116970734B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1528912A (zh) * 2003-10-21 2004-09-15 南京农业大学 棉花高强纤维基因主效基因位点及其分子标记
CN107043775A (zh) * 2017-04-24 2017-08-15 中国农业科学院生物技术研究所 一种能促进棉花侧根发育的sgRNA及其应用
WO2020139756A1 (en) * 2018-12-27 2020-07-02 Dow Agrosciences Llc Methods and compositions to select and/or predict cotton plants resistant to fusarium race-4- resistance in cotton
CN113151532A (zh) * 2021-01-20 2021-07-23 南京农业大学 一个与黄瓜果实多心室性状紧密连锁的分子标记Indel-LNT-36

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1528912A (zh) * 2003-10-21 2004-09-15 南京农业大学 棉花高强纤维基因主效基因位点及其分子标记
CN107043775A (zh) * 2017-04-24 2017-08-15 中国农业科学院生物技术研究所 一种能促进棉花侧根发育的sgRNA及其应用
WO2020139756A1 (en) * 2018-12-27 2020-07-02 Dow Agrosciences Llc Methods and compositions to select and/or predict cotton plants resistant to fusarium race-4- resistance in cotton
CN113151532A (zh) * 2021-01-20 2021-07-23 南京农业大学 一个与黄瓜果实多心室性状紧密连锁的分子标记Indel-LNT-36

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Transcriptome, Ectopic Expression and Genetic Population Analysis Identify Candidate Genes for Fiber Quality Improvement in Cotton;Zhengwen Liu等;《Int. J. Mol. Sci.》;第24卷;第1-20页 *
基于单拷贝SNP标记的棉花杂交种纯度高通量检测技术;匡猛等;《棉花学报》;第28卷(第3期);第227-233页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116970734A (zh) 2023-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105695478B (zh) 调节植物株型和产量的基因及其应用
Galli et al. High-resolution genetic map of the Rvi15 (Vr2) apple scab resistance locus
US8809623B2 (en) Genetic loci associated with resistance to tropical rust in maize
CN111961746B (zh) 与陆地棉枯萎病抗病相关的snp分子标记及其应用
CN107227373B (zh) 一种粳稻抗倒伏基因的snp功能分子标记及应用
CN111321241B (zh) 一种小麦千粒重和粒长基因TaGS3-4A的分子标记及其应用
CN111172294A (zh) 一种与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性SSR标记及其应用
CN114736979B (zh) 与西瓜全缘叶形基因ClLL紧密连锁的分子标记及应用
CN110499389B (zh) 与烟草抗斑萎病位点rtsw紧密连锁的共显性标记引物、鉴别方法及其应用
CN117126962B (zh) 棉花皱叶控制基因GhZY、连锁SNP位点及其应用
CN112522290B (zh) 一个海岛棉纤维品质关联的类钙调磷酸酶b互作蛋白激酶基因
RU2717017C2 (ru) Молекулярные маркеры гена rlm2 резистентности к черной ножке brassica napus и способы их применения
CN107338293B (zh) 与玉米粗缩病抗性相关的kasp分子标记及其应用
CN117683927A (zh) 水稻抗稻瘟病基因的功能性kasp分子标记及其应用
KR102154701B1 (ko) 수박 왜성 개체 선발용 신규 유전자 마커 및 이의 이용
CN112210616B (zh) 一种与水稻籽粒长度性状相关的InDel分子标记引物及其应用
CN116200528B (zh) 与小麦抗条锈病基因QYr.sicau.-2BL连锁的SNP分子标记及应用
CN111334597A (zh) 用于检测西瓜白粉病抗性的snp位点、kasp标记及其应用
CN116970734B (zh) 一种棉花多心室控制基因GaMV连锁的SNP位点及其应用
CN115786564A (zh) 一种水稻Pi-ta和Ptr显性功能分子标记及其应用
CN107937409A (zh) 水稻分蘖角度基因tac3的克隆和应用
KR101817463B1 (ko) 수박 탄저병 저항성 개체 선발용 분자마커 및 이의 이용
Xie et al. OsBLS6. 2: A rice bacterial leaf streak resistance gene identified by GWAS and RNA-seq
CN112094940B (zh) 与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记及其引物、试剂盒与应用
CN116218887B (zh) 酰胺酶蛋白基因OsAMID在提高水稻产量中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant