KR101817463B1 - 수박 탄저병 저항성 개체 선발용 분자마커 및 이의 이용 - Google Patents

수박 탄저병 저항성 개체 선발용 분자마커 및 이의 이용 Download PDF

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KR101817463B1
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이긍표
장윤정
이선주
한밝음
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중앙대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하기 위한 분자마커 및 이의 이용에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물, 프라이머 세트, 및 키트와 이를 이용하여 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 탄저병 저항성 분자마커의 제공으로 탄저병 저항성 계통 및 품종 개발시 직접 병을 접종하지 않아도 어린 식물체 또는 종자의 DNA를 추출하여 바로 저항성 유무를 확인하여 수박 탄저병 저항성을 나타내는 수박 품종을 효율적으로 판별 및 육성할 수 있으므로, 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 방법으로 선별한 탄저병 저항성 수박 품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 수박 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.

Description

수박 탄저병 저항성 개체 선발용 분자마커 및 이의 이용 {Molecular marker to select anthrocnose resistance of watermelon and use thereof}
본 발명은 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하기 위한 분자마커 및 이의 이용에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하기 위한 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커 조성물, 프라이머 세트, 및 키트와 이를 이용하여 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하는 방법에 관한 것이다.
수박은 아시아(82.4%), 유럽(5.8%), 오세아니아(0.1%), 아프리카(5.3%), 아메리카(6.3%) 전세계적으로 생산되고 있으며, 아시아 중에서도 중국(약 5천만 톤)에서 가장 많은 수박을 생산하고 있다. 우리나라에서도 수박은 여름뿐만이 아니라 연중내내 소비되는 과채류이다. 그러나 지구 온난화에 따른 이상기후 현상에 의해 재배지의 온도가 상승하고 과습한 기후 조건이 조성됨에 따라 수박 재배지에서 탄저병, 덩굴마름병, 역병 등이 빈번하게 발생하고 있다.
최근 차세대 염기서열 분석법의 발달에 따라 염기서열 분석 비용이 절감되어 식물의 염기서열 분석 또한 빠르게 진행되고 있으며, 박과 식물의 경우 오이(2009년), 멜론(2012년), 수박(2013년)의 전장 염기서열이 공개되었다. 수박의 경우 최근 게놈의 서열분석을 통한 게놈서열 기반 고밀도 유전자지도가 작성되고 있으며, 이를 기반으로한 다량의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 정보의 결과로 다양한 식물 계통, 품종의 구분뿐만 아니라, 분자마커로서의 활용도가 증가되고 있다. 과거 전통육종에서는 원하는 형질의 게놈부위를 교배육종을 통해 형질도입을 하였는데, 이를 확인하기 위해서 해당 표현형까지 관찰하기까지 노동력과 시간이 많이 걸리는 문제점이 있었다. 이를 해결하기 위해 원하는 형질과 연관된 분자마커의 개발이 이루어 지고 있으며, 나아가 개발된 마커로 유묘기때 개체를 선발하여 노동력 절감, 육종효율 증진, 및 육종기간 단축을 위한 연구 개발이 이루어 지고 있다. 이와 같이 분자마커를 이용하여 특정 질병 저항성 작물을 판별하는 방법에 관하여 한국공개특허 제10-2016-0056219에서 개시하고 있다.
한편, 탄저병은 활물기생균으로 수박을 비롯한 박과식물에 빈발하고 발병시 작물에 따라 증상이 다소 차이가 있으나, 잎에서는 담갈색 또는 갈색의 유원형 병반을, 과실 등에서는 갈색 또는 암갈색의 움푹 패인 원형 병반을 만들고, 후에 병반 표면에 분홍색의 특징이 있는 점질물(분생포자의 덩어리)이 생성되어 작물, 즉 수박의 재배와 생산의 감소에 막대한 영향을 주고 있다.
현재까지 이러한 탄저병 방제는 주로 화학 농약에 의존하여 왔으나, 이러한 화학 농약의 사용은 점진적으로 탄저병의 약제 저항성을 증대시켜 농약의 효율성을 떨어뜨리게 되며, 결국 방제를 위해 과다한 화학 농약 살포를 필요로 하게 된다. 이로 인해, 과실에 높은 잔류 농약이 검출되고 화학 농약을 기피하는 소비자들에게 농약 사용 과채류가 기피되고 있는 실정이다.
이에, 탄저병 저항성 수박의 육종이 시급한 상황이며, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나 아직 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하기 위한 SNP 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하기 위한 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하는 방법을 제공하는데 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
서열번호 1의 염기서열 내에서 751번째 염기에 위치하는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
서열번호 2의 염기서열 내에서 751번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
서열번호 3의 염기서열 내에서 661번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
서열번호 4의 염기서열 내에서 751번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
서열번호 5의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개로 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
서열번호 6의 염기서열 내에서 751번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개로 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 751번째 염기, 서열번호2의 751번째 염기, 서열번호 3의 661번째 염기, 서열번호 4의 751번째 염기, 서열번호 5의 501번째 염기, 또는 서열번호 6의 751번째 염기를 포함하는 8-100개의 연속된 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는, 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 7 및 8으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 17 및 18로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하는 방법을 제공한다.
(a) 판별하고자 하는 수박 품종으로부터 게놈(genomic) DNA를 얻는 단계;
(b)상기 게놈 DNA에서 서열번호 1의 751번째 염기, 서열번호2의 751번째 염기, 서열번호 3의 661번째 염기, 서열번호 4의 751번째 염기, 서열번호 5의 501번째 염기, 또는 서열번호 6의 751번째 염기 타입을 검출하는 단계; 및
(c)상기 검출한 염기 타입으로부터 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 단계 (b)는 상기 프라이머 세트를 사용한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 단계 (c)는 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔-전기영동, 서열분석, 방사선 측정, 형광 측정, 및 인광 측정으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 탄저병 저항성 분자마커의 제공으로, 탄저병 저항성 계통 및 품종 개발시 직접 병을 접종하지 않아도 어린 식물체 또는 종자의 DNA를 추출하여 바로 저항성 유무를 확인하여, 수박 탄저병 저항성을 나타내는 수박 품종을 효율적으로 판별 및 육성할 수 있으므로, 육종에 소요되는 시간, 비용, 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다.
또한, 본 발명의 방법으로 선별한 탄저병 저항성 수박 품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 수박 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.
도 1은 판별기주를 이용한 탄저 병원균 CL14-27 접종원의 Race를 나타낸 것이다.
도 2는 탄저병 Race1을 이용한 탄저병 저항성 계통 판별시 내병성 지표에 따른 식물체 병징의 사진이다.
도 3은 탄저병 저항성 계통 DrHs7250, 탄저병 감수성 계통 oto949, 및 상기 양 계통을 양친으로 하는 F1 및 F2에 탄저병원균 CL14-27을 접종한 후 병리검증을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 탄저병 저항성 연관유전자 선발을 위한 delta-SNP index 분석결과를 나타낸 것이다.
도 5는 HRM 마커를 이용한 유전자형 판별 결과를 나타낸 것이다. 각 그래프는 유전자형을 나타내며, 적색그래프는 탄저병 감수성인 개체들, 청색그래프는 저항성인 개체들, 노란색그래프는 헤테로(H=R+S)를 나타낸다.
도 6은 서열번호 1의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치 및 프라이머 세트의 위치를 나타낸 것이다.
도 7은 서열번호 2의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치 및 프라이머 세트의 위치를 나타낸 것이다.
도 8은 서열번호 3의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치 및 프라이머 세트의 위치를 나타낸 것이다.
도 9는 서열번호 4의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치 및 프라이머 세트의 위치를 나타낸 것이다.
도 10은 서열번호 5의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치 및 프라이머 세트의 위치를 나타낸 것이다.
도 11은 서열번호 6의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치 및 프라이머 세트의 위치를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 수박 탄저병에 대한 저항성 및 감수성과 연관된 유의미한 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 발굴하고, 상기 단일염기다형성을 이용한 분자마커를 사용하여 탄저병에 대한 저항성을 갖는 수박 품종을 선별하기 위한 판별방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 구체적으로, 탄저병 Race 1 저항성 계통인 DrHS7250과 탄저병 Race 1 감수성 계통인 Oto949을 양친으로 하는 F2 분리집단에서 표현형의 차이가 확실히 구분되는 양극단의 개체들을 선발하고 상기 F2 분리집단의 DNA를 추출(pooling) 후 동량으로 DNA를 혼합하였으며, 양극성의 표현형으로 나타난 개체들 중 저항성으로 판단되는 개체들의 혼합DNA를 CL14-27 R, 감수성으로 판단되는 혼합DNA를 CL14-27 S라고 명명하였다. 각 추출된 DNA를 Illumina 사의 Nextseq500을 사용하여 염기서열 데이타를 생산하였으며, Bowtie 2 프로그램을 사용하여 상기 생산된 염기서열들을 참조서열(reference sequence)와 비교하여 BAM파일을 생산하고, 상기 BAM파일을 토대로 참조서열과 다른 SNP를 발굴하기 위해 VCF(Variant Call Format)을 생산하여 SNP의 차이값(SNP index)을 계산하여 비교분석하는 방법(delta-SNP index)을 적용하였다. 그 결과, 수박 탄저병에 대한 저항성 및 감수성과 연관된 SNP를 확인하였고, 이에 따라 해당 SNP를 확인할 수 있는 프라이머 세트를 개발하여 F2 및 F3 분리집단에서 검정한 결과 모든 개체에서 수박 탄저병에 대한 저항성 및 감수성 여부를 정확하게 판별할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 수박 탄저병 저항성 유전자좌에서 특이적으로 차별화되어 나타나는 단일염기다형성 마커 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 SNP 마커 조성물은 수박에 적용되나, 이에 한정되지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “수박(Citrullus lanatus, watermelon)”은 한반도에서 재배되거나 혹은 품종 개량을 목적으로 육종된 수박을 의미하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열 내에서 751번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 2의 염기서열 내에서 751번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 3의 염기서열 내에서 661번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 4의 염기서열 내에서 751번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 5의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개로 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 6의 염기서열 내에서 751번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개로 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 서열번호 1 내지 서열번호 6의 염기서열은 수박의 8번 염색체에 존재하는 염기서열일 수 있으며, 바람직하게는 2.5Mb ~ 3.2Mb 또는 10Mb ~ 12.8 Mb 영역일 수 있다.
본 발명에 따른 SNP 마커는, 서열번호 1의 염기서열 내에서 751번째 염기에 위치하는 염기가 (C->T)이거나, 서열번호 2의 염기서열 내에서 751번째 염기가 (T->C)이거나, 서열번호 3의 염기서열 내에서 661번째 염기가 (T->C)이거나, 서열번호 4의 염기서열 내에서 751번째 염기가 (A->G)이거나, 서열번호 5의 염기서열 내에서 501번재 염기가 (T->C)이거나, 서열번호 6의 염기서열 내에서 751번째 염기가 (C->T)인 경우, 수박 탄저병에 대한 저항성이 있는 개체인 것으로 판별할 수 있는바, 상기 SNP 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 분자마커로 사용함으로써 품종 개발시 직접 병을 접종하지 않아도 어린 식물체 또는 종자의 DNA를 추출하여 바로 저항성 유무를 확인할 수 있다.
이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공하며, 바람직하게는, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 7 및 8으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 17 및 18로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “뉴클레오타이드” 또는 “폴리뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥의 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 특별히 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 (폴리)뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건(4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도, 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15bp 내지 30bp의 길이로서 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야 한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 6개의 프라이머 세트를 이용하여 F2 분리집단의 각 개체를 대상으로 유전자형 및 표현형 검정을 수행하였고, 그 결과 서열번호 1 내지 4 의 경우 개발된 마커와 표현형 결과가 약 96% 일치하는 경향을 보였으며, 서열번호 5 및 6 의 경우 개발된 마커와 표현형 결과가 약 99%일치하는 결과를 나타냄을 확인하였다(실시예 5-2 및 표 6 참조).
상기와 같이, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 HRM(High resolution melting) 분석을 통하여 염기 서열에서의 변이를 확인하는데 사용될 수 있는바, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하기 위한 HRM 분석용 PCR 키트를 제공한다(실시예 5-2 참조).
본 발명에서 “HRM”은 PCR 영역 내에 존재하는 DNA 상의 SNP에 따라서, 형광시약과 결합한 증폭산물 DNA를 약 60℃에서 90℃까지 온도를 변화시키며 단일가닥의 DNA로 변성될 때의 형광강도 변화를 측정하는 방법을 의미한다.
또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 (a)판별하고자 하는 수박 품종으로부터 게놈(genomic) DNA를 얻는 단계; (b)상기 게놈 DNA에서 서열번호 1의 751번째 염기, 서열번호2의 751번째 염기, 서열번호 3의 661번째 염기, 서열번호 4의 751번째 염기, 서열번호 5의 501번째 염기, 또는 서열번호 6의 751번째 염기 타입을 검출하는 단계; 및 (c)상기 검출한 염기 타입으로부터 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하는 단계를 포함하는 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하는 방법을 포함할 수 있다. 상기 (b)단계는 본 발명이 제공하는 프라이머 세트를 사용한 PCR을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다(표 5 참조). 또한, 상기 (c)단계는 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔-전기영동, 서열분석, 방사선 측정, 형광 측정, 및 인광 측정으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 탄저병(Anthracnose disease)균 확보 및 동정
1-1. 최적 수집균주 및 접종농도 확립
탄저병원균 CL14-27는 병원균의 포자형성(sporulation) 및 탄저병 발병효율이 높아 탄저병 저항성 품종 육종 및 SNP 마커 분석에 적합하다. 따라서 본 실험에서는 CL14-27 균주를 자체적으로 수집하여 사용하였으며, 최적의 접종환경에서 상기 CL14-27 균주의 “최적의 접종농도”를 확인한 결과 0.5 x 106 cornidia/mL으로 확인되었다. 이하 “최적의 접종환경”이란, 90-100%의 상대습도를 유지하기 위해 초기 접종 후 48시간 동안 비닐로 4면을 모두 막은 상태에 두고, 48시간 이후 비닐을 걷어내는 것을 말한다.
1-2. 수집 탄저병원균 CL14-27의 병징 확인
수집균주 CL14-27은 수박에서 전형적인 자엽과 잎에 부정형 결각의 괴사(necrosis) 병반 및 전형적인 “shot-hole”을 나타내었으며, 감염이 진행되어 접종 후 약 3일이면 감수성 개체들에서 하배축의 수침현상이 시작되었고 5일째에는 damping off 현상이 시작되었다.
실시예 2. 판별기주를 이용한 탄저 병원균 CL14-27 접종원의 Race 확인
판별기주는 Charleston Gray, Congo, Fairfax, Garrison, New Hampshire Midget, 및 Butternut squash로 나누었으며, 각 판별기주에 탄저병원균 CL14-27을 0.5 x 106 cornidia/mL의 농도로 접종하였다. 하기 표 3과 같은 판별지표를 수립하고, 접종 후 탄저병에 대한 각 판별기주의 반응을 평가하여 표 1에 나타내었다.
판별기주 Seedling
race1 race2 race3
Charleston Gray R S R
Congo R S R
Fairfax R S R
Garrison S S S
New Hampshire Midget S S S
Butternut squash MR ? R
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 수집된 탄저병원균 CL14-27을 이용하여 Race를 검정하였을 때 Race 1으로 판별되었다. 구체적으로, New Hampshire Midget의 경우 접종한 모든 개체에서 감수성을 보였으며, Congo에서는 10개체 중 3개체가 감수성으로 나타냈고, 나머지 7개체는 저항성을 보였다. Fairfax의 경우 본엽 및 엽병에 접종흔이 관찰되어 완전한 저항성이 아니라 중도저항성으로 판단되었고, Charleston gray의 경우 모든 개체에서 저항성을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 탄저병 Race 1 저항성 계통 선발 및 내병성 지표 확립
판별기주를 통하여 Race 1으로 확인된 탄저병 병원균 CL14-27을 접종원으로 사용하여 탄저병 저항성 계통 선발을 진행하였다. 하기에 표 2는 탄저병 저항성 계통을 선발하기 위해 다양한 수박 계통에 CL14-27을 접종하여 그 표현형을 확인한 결과이다. 탄저병 저항성 및 감수성의 판별은 하기에 표 3에 따라 수행하였으며, 그 결과 Charleston Gray, DrHS4105, 및 DrHS7250 계통이 탄저병원균 CL14-27에 저항성을 갖는 것으로 확인되었다.
계통명 표현형 검정
216A MR
Charleston Gray R
Charleston Gray 133 R
Congo MR
Fairfax R~MR
New Hampshier Midget S
PI189225 S
Arka Manic MR
PI296341-FR S
Td108 MR
Tdf100 MR
BH4X415(2X) S
DrHS4105 R
DrHS7250 R
SN3615(2X) S
PMTd108(76) MR
PMTdf100(88) MR
잎/하배축
(Rating)		 저항성/감수성 판정 병징지표(Disease index)
0 / 0 R(저항성) 본엽 1매 : 병징 없음,
본엽 2매 : 병징 극소(necrotic spot 1~2개)
하배축 : 병징 없음
1 / 0 R(저항성) 본엽 1매 : 병징 극소(necrotic spot 1~2개)
본엽 2매 : 신초 포함하여, 병징 5% 진전
하배축 : 병징 없음
2 / 0 MR(중도 저항성) 본엽 1매 : 병징극소
본엽 2매 : 전반적인 병징이 20~30% 진전
하배축 : 병징 없음
3 / 1 MR(중도 저항성) 본엽 1매 : 병징 5~10%
본엽 2매 : 병징 30~40%
신초 : 약간 위조
하배축 : 접종 흔적 관찰
(최종적으로 14~21dpi까지 하배축에 수침 및 신초가 위조 되지 않아야 함)
4 / 2 S(감수성) 하배축 수침 발생 시작
본엽 1매 : 병징 10~20%
본엽 2매 : 병징 50~70%
신초 : 심하게 위조
하배축 : 수침 발생
5 / 3 S(감수성) 탄저병이 식물 전체에 발병하여, 하배축, 잎, 신초 모두 고사.
추후 선발된 저항성 계통을 공동연구하고 있는 파트너 종묘에 의뢰하여 분리집단을 확보하여 유전분석을 실시하기로 하였다. 수박의 경우, 탄저병 접종 후 감수성 계통에서는 3dpi에서부터 초기 감염증상이 보여지며, 5dpi에서부터 하배축에 수침현상이 관찰되며, 본엽 1,2매에서는 불규칙적인 형태로 갈변되고 고사되는 현상을 확인하였다. 또한 5dpi에서부터 저항성 계통과 감수성계통을 확실히 구분할 수 있으며, 저항성 계통의 경우 5dpi 이후에도 본엽 1,2매 및 하배축 모두 감염성을 보이지 않음을 확인하였다.
실시예 4. 수박 탄저병 저항성 유전양상 분석
본 실험에서는 유전분석을 위해 저항성계통 DrHs7250, 감수성계통 Oto949, DrHs7250 x Oto949 F1, reciprocal F1, BC1P1, 및 BC1P2 계통을 이용하였으며, DrHs7250 탄저병 저항성 계통의 분리집단은 파트너종묘에서 분양받아 사용하였다. 탄저병원균 CL14-27를 감자 포도당 한천배지(potato dextrose agar배지)에 계대하여 28℃의 생육온도에서 광주기를 16시간으로 하고 암주기를 8시간으로 하여 7일간 배양한 후, 멸균수로 현탁하고, 최적의 접종농도 0.5 x 106 cornidia/mL로 희석하였다. 상기 수박 계통 식물의 본엽 2매가 전개 되었을 때 최적의 접종환경에서 상기 최적의 접종농도로 희석된 탄저병원균 CL14-27을 스프레이로 분무하여 접종을 진행하였다. 그 후 각 표현형 결과를 토대로 적합도 검정을 실시하였다. 추가적으로 접종 환경에 따라 scale의 차이가 생길 수 있기 때문에 F2 및 F3에 접종 시 severity scale을 다시 한번 확인 하였으며, 탄저병 개체별 scoring을 수행하였다(도 2 참조).
그 결과, 하기 표 4 및 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 모부본 계통들의 표현형이 분리되지 않았다. 구체적으로, BC1P1의 경우 탄저병 Race1에 저항성을 보였고, BC1P2의 경우 접종 개체에서의 기대 분리비가 1:1이며 표현형 결과 해당 분리비에 근접하게 결과를 확인할 수 있었다. 따라서 본 분리집단에서 수박 탄저병 Race 1의 경우 단인자 우성으로 유전됨을 확인할 수 있다. 탄저병 접종을 통한 유전분석 결과를 토대로 탄저병 Race 1의 경우 단인자 우성으로 유전됨을 확인할 수 있었으며, 추가적으로 분리집단 F2 및 F3을 대상으로 검정한 결과 탄저병 저항성의 경우 F2 및 F3에서도 단인자 우성 유전되는 것을 확인할 수 있었다.
집단 세대 개체수 관측 표현형 기대 표현형 자유도 카이제곱 P-value
R S R S
DrHs 7250 P1 25 25 0
Oto 949 P2 25 0 25
DrHs 7250 x Oto 949 F1 8 8 0
Oto 949 x DrHs 7250 F1 25 25 0
DrHs 7250 x Oto 949 x DrHs7250 BC1P1 25 25 0 25 0 1 0 1
DrHs 7250 x Oto 949 x Oto 949 BC2P2 25 17 8 12.5 12.5 1 3.24 0.07186
DrHs 7250 x Oto 949 F2 119 85 34 89.25 29.75 1 0.80952 0.3683
DrHs 7250 x Oto 949 F3 190 132 55 140.25 46.75 1 1.9412 0.1635
실시예 5. 탄저병 저항성 연관 분자마커의 개발
5-1. 수박 탄저병 저항성 유전자의 탐색 및 수박 게놈(genome) 상의 위치 확인
DrHs7250 x Oto949 F2집단에서 탄저병원균 CL14-27 접종 후 표현형이 명확한 개체들을 이용하였으며, 30개의 저항성 개체 및 30개의 감수성 개체의 DNA를 각각 추출하고, 동량으로 혼합하여 Illumina Hiseq 2500을 이용한 Whole genome resequencing을 수행하였다. 상기 결과를 이용하여 수박 97103 참조게놈(reference genome)을 이용하여 각 염색체별 VCF(Variant Calling Format)를 생산하고, 이후 delta SNP-index를 구하여 발굴된 SNP와 표현형과의 연관성을 파악하여 탄저병 저항성 양적형질 유전자좌 (quantitative trait loci; QTL) 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 다른 염색체상에는 유의미한 피크(peak)가 도출되지 않은 반면 8번 염색체의 2.5Mb~3.2Mb과 10Mb~12.8Mb 지역에서 유의미한 피크가 도출되었는바 8번 염색체의 상기 지역을 후보 유전자좌로 결정하였다.
5- 2. 프라이머 세트 제작 및 HRM 마커 분석
실시예 5-1을 통해 확인된 저항성 게놈영역 내에서 SNP를 좀더 구체적으로 비교하기 위하여, 후보 유전자좌 지역에서 6개의 프라이머 세트를 개발하여 F2분리집단에서 HRM 마커 검정을 실시하였다. 상기 6개의 프라이머 세트의 구체적인 정보는 하기 표 5에 나타내었고, HRM 검정 결과는 하기 표 6에 나타내었다. 표 6에서 표현형 결과와 유전자형 결과가 일치하지 않는 개체들은 두꺼운 글씨로 밑줄 표시하였다.
탄저병 Race 1 저항성 판별을 위한 HRM 마커 정보
Primer SNP Sequence mer
Set 1 CL14-27-7 F C->T TGCTCTCACAAACCATTGACA 21
CL14-27-7 R GAAGTCATTTCAGTTCGTAGCTGT 24
Set 2 CL14-27-9 F T->C TTTCCAAAATAAAACGCAGTTG 22
CL14-27-9 R TGAAGCCAAAAGAAAATTACGTG 23
Set 3 CL14-27-40 F T->C TGGTTTTCATTTGGTTTTTGG 21
CL14-27-40 R TTCAAATTTTGGCGTGGTTTA 21
Set 4 CL14-27-50 F A->G TTACTGAAAGGGCTGCCAGA 20
CL14-27-50 R AGTTTACTCGATGGCCAGAGC 21
Set 5 CL14-27-54 F T->C TCAAAAACTAAATTGGAGGGAGAA 24
CL14-27-54 R GCAATTGTTTAGGCTTTCAATCA 23
Set 6 CL14-27-60 F C->T AGATTTTGGGCCTAGCTCTCA 21
CL14-27-60 R TGAAGGGCTTGATACCTCATTG 22
F2표현형 검정결과 및 HRM marker 분석결과
F2 개체번호 평균
스코어		 F2 표현형 CL14-27-7
SNPid :
2,889,773		 CL14-27-9
SNPid :
3,084,239		 CL14-27-40
SNPid :
3,140,620		 CL14-27-50
SNPid :
10,763,286		 CL14-27-54
SNPid :
11,827,553		 CL14-27-60
SNPid :
12,811,726
1 0.5 R MR MR MR MR MR MR
2 0.5 R MR MR S MR MR MR
3 0 R MR MR MR MR MR MR
6 1 MR MR MR MR MR MR MR
7 4 S S S S S S S
8 4 S S S S S S S
9 1.5 MR MR MR MR MR MR MR
10 0.75 MR MR MR MR MR MR MR
11 4 S S S S S S S
12 2.25 MR MR MR MR MR MR MR
13 3.5 S S S S S S S
15 1 MR MR MR MR MR MR MR
16 3.5 S S S S S S S
17 1 MR MR MR MR MR MR MR
18 4 S S S S S S S
20 4 S S S S S S S
22 1 MR R R R R R R
23 0.5 R R R R R R MR
25 1 MR MR MR MR MR MR MR
26 1 MR MR MR MR MR MR MR
27 1.25 MR R R R MR R R
28 1.75 MR R R MR R R R
29 1.75 MR MR MR MR MR MR MR
30 1.25 MR MR MR MR MR MR MR
31 1 MR R R R MR MR MR
32 1.45 MR MR MR MR MR MR MR
33 4 S S S S MR S S
34 2.5 MR MR MR MR MR MR MR
36 1.75 MR S S S MR MR MR
37 0 R R R R R R R
38 4 S S S S S S S
40 4 S S S S S S S
41 4 S S S S S S S
42 1.25 MR MR MR MR MR MR MR
43 2 MR S S S MR MR MR
44 4 S S S S S S S
46 2.25 MR MR MR MR MR MR MR
47 2 MR MR MR MR MR MR MR
48 3.5 S S S S S S S
50 4 S S S S S S S
51 1.75 MR MR MR MR MR MR MR
52 0.75 MR MR MR MR MR MR MR
53 1.5 MR MR MR MR MR MR MR
55 0.75 R MR MR MR MR MR MR
56 0 R MR MR MR MR MR MR
57 0.5 R MR MR MR S MR MR
58 0.75 R MR MR MR MR MR MR
59 1 MR MR MR MR MR MR MR
60 1 MR MR MR MR MR MR MR
61 4 S S S S S S S
62 1 MR R R R R R R
63 4 S S S S S S S
64 1.5 MR MR MR MR S MR MR
65 4 S S S S S S S
66 0.5 R MR MR MR MR MR MR
67 4 S S S S S S S
69 4 S S S S S S S
70 3.25 S MR MR MR R R R
71 0.5 R R R R R R R
72 1.75 MR MR MR MR MR MR MR
73 0.5 R R R R R R R
74 4 S S S S S S S
75 1 MR R R R R R R
76 0 R MR MR MR MR MR MR
77 0 R R R R R R R
78 0.5 R MR MR MR MR MR MR
79 0.5 R MR MR MR MR MR MR
80 0.5 R MR MR MR MR MR MR
81 0 R MR MR MR MR MR MR
82 0 R R R R R R R
83 1 MR MR MR MR MR MR MR
84 3.5 S S S S S S S
85 1 MR MR MR MR MR MR MR
86 1.25 MR MR MR MR MR MR MR
87 1.75 MR MR MR MR MR MR MR
88 4 S S S S S S S
89 1 MR MR MR MR MR MR MR
90 4 S S S S S S S
91 0.75 R MR MR MR MR MR MR
92 1 MR R R R MR R R
93 0 R R R R R R R
95 1 MR R R R R R R
96 0.75 R MR MR MR MR MR MR
98 1 MR R R R MR R R
99 1.25 MR MR MR MR MR MR MR
100 0.75 R MR MR MR MR MR MR
101 1 MR MR MR MR MR MR MR
102 2.25 MR MR MR MR MR MR MR
103 1 MR MR MR MR MR MR MR
104 0.5 R R R R R R R
105 1.25 MR R R R R R R
106 0.75 R MR MR MR MR MR MR
107 1.5 MR R R R MR MR MR
108 1 MR R R R R R R
109 1.5 MR MR MR MR MR MR MR
110 4 S S S S S S S
111 1.5 MR MR MR MR MR MR MR
112 0.5 R MR MR MR MR MR MR
113 0.5 R MR MR MR MR MR MR
114 0.5 R R R R R R R
115 4 S MR MR MR S S S
116 0.5 R MR MR MR MR MR MR
117 0.5 R R R R R R R
118 0.5 R R R R R R R
119 0.5 R MR MR MR R MR MR
120 0 R R R R R R R
구체적으로, 표 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 프라이머 세트 CL14-27-7, 9, 40, 및 50의 경우 전제 106개 중에 4개 개체가 표현형과 유전자형이 일치하지 않아, HRM 마커 적용율이 약 96% 로 확인되었고, 프라이머 세트 CL14-27-54 및 60의 경우 106개 중에 1개 개체가 표현형과 유전자형이 일치하지 않아, HRM 마커 적용율이 약 99% 로 확인되었다. 따라서 프라이머 세트 CL14-27-60의 지역 8번 염색체의 12,811,726bp 위치의 SNP가 수박 탄저병 개체 판별에 가장 효과적이라고 판단되는바, 이하 실시예에서 F3 집단에서의 프라이머 세트 CL14-27-60의 적용성 검증을 실시하였다.
5-3. HRM 마커의 적용성 검증
실시예 5-2를 통해 제작된 프라이머 세트를 이용하여 F3분석을 실시하여 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다. F3의 경우 F2:F3 집단을 양성하기 어려운 관계로 Muller(1923)와 Sedcole(1977)에 의해 도출된 최소집단의 크기(minimum population size)를 구하는 공식(N=log(1-P)/log(1-f), N은 최소집단의 크기, P는 도출된 집단을 반영할 수 있는 확률, f는 발생빈도수)를 통해 F3 10개체가 F2의 유전자형을 반영 할 수 있는 개수를 구하였고, 이 수치를 기반으로 F3 계통당 10개체씩 동량으로 본엽을 추출하고, 각각을 구분하여 DNA를 추출하여 HRM 분석을 진행하였다.
그 결과, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이, F3 181개체 중 1개체를 제외한 모든 개체에서 표현형과 HRM 마커로 검정한 유전자형이 일치하였다. 이는 상기 QTL 결과가 매우 정확하였으며, 동시에 시험에 사용된 프라이머 세트가 탄저병 저항성 진단에 성공적으로 사용될 수 있음을 시사한다.
F3 분리집단의 표현형 검정 및 HRM을 통한 유전자형 검정
　 표현형 검정 유전자형 검정
F3 분리집단 평균 스코어 표현형 　CL14-27-60
SNPid :
12,811,726
F3-003 0.49 R R
F3-004 0.42 R R
F3-005 0.68 R R
F3-009 1.52 MR MR
F3-010 1.63 MR MR
F3-011 3.67 S S
F3-012 3.66 S S
F3-014 0.63 R R
F3-015 3.67 S S
F3-018 3.67 S S
F3-021 3.67 S S
F3-023 1.97 MR MR
F3-025 2.29 MR MR
F3-026 0.52 R S
F3-028 3.64 S S
F3-033 1.04 MR MR
F3-034 0.58 R R
F3-040 1.10 MR MR
F3-041 0.30 R R
F3-044 0.51 R R
F3-045 2.22 MR MR
F3-047 1.72 MR MR
F3-050 2.06 MR MR
F3-054 0.81 R MR
F3-055 3.67 S S
F3-056 3.62 S S
F3-057 3.66 S S
F3-061 0.26 R R
F3-064 0.44 R R
F3-067 1.84 MR MR
F3-075 1.60 MR MR
F3-076 1.46 MR MR
F3-080 1.56 MR MR
F3-084 1.54 MR MR
F3-086 3.66 S S
F3-087 1.71 MR MR
F3-088 3.35 S S
F3-089 0.73 MR R
F3-090 2.10 MR MR
F3-092 1.29 MR MR
F3-095 1.38 MR MR
F3-097 0.53 R R
F3-099 0.69 R R
F3-100 1.65 MR MR
F3-101 3.61 S S
F3-102 3.61 S S
F3-108 1.08 MR MR
F3-110 0.54 R R
F3-115 0.18 R R
F3-122 3.67 S S
F3-123 1.94 MR MR
F3-124 3.67 S S
F3-132 1.68 MR MR
F3-139 2.02 MR MR
F3-143 2.15 MR MR
F3-144 0.83 MR R
F3-146 2.17 MR MR
F3-147 3.65 S S
F3-148 1.80 MR MR
F3-151 3.67 S S
F3-153 1.95 MR MR
F3-156 3.66 S S
F3-159 1.61 MR MR
F3-166 1.76 MR MR
F3-167 1.76 MR MR
F3-170 1.79 MR MR
F3-172 3.67 S S
F3-174 3.67 S S
F3-175 3.67 S S
F3-176 3.36 S S
F3-181 2.11 MR MR
F3-182 2.23 MR MR
F3-183 0.81 R MR
F3-186 0.15 R R
F3-187 0.77 MR R
F3-189 1.79 MR MR
F3-190 3.60 S S
F3-191 0.09 R R
F3-192 3.66 S S
F3-195 1.29 MR MR
F3-197 1.95 MR MR
F3-200 3.67 S S
F3-203 3.67 S S
F3-208 3.57 S S
F3-209 3.66 S S
F3-211 1.74 MR MR
F3-214 1.55 MR MR
F3-217 1.49 MR MR
F3-218 0.53 R R
F3-222 1.91 MR MR
F3-223 1.66 MR MR
F3-237 0.27 R R
F3-241 1.14 MR MR
F3-245 0.47 R R
F3-246 2.00 MR MR
F3-250 1.54 MR MR
F3-253 3.58 S S
F3-255 3.61 S S
F3-256 1.22 R MR
F3-258 2.81 S S
F3-260 3.43 S S
F3-261 0.56 R MR
F3-263 1.54 MR MR
F3-264 0.32 R R
F3-265 2.97 S S
F3-266 1.00 R MR
F3-269 3.08 S S
F3-273 1.08 R MR
F3-274 1.31 MR MR
F3-275 1.12 MR MR
F3-277 1.81 MR MR
F3-278 3.55 S S
F3-281 0.58 R R
F3-283 1.54 MR MR
F3-284 3.64 S S
F3-285 0.41 R R
F3-286 2.42 MR MR
F3-287 1.31 MR MR
F3-301 3.65 S S
F3-302 1.73 MR MR
F3-303 1.54 MR MR
F3-304 0.73 R R
F3-307 1.55 MR MR
F3-308 3.67 S S
F3-310 0.97 MR R
F3-311 2.44 MR MR
F3-312 0.86 MR R
F3-314 3.67 S S
F3-315 0.52 R R
F3-318 2.30 MR MR
F3-319 3.67 S S
F3-320 3.67 S S
F3-321 0.59 R R
F3-322 0.90 MR R
F3-323 1.79 MR MR
F3-324 0.57 R R
F3-326 3.67 S S
F3-327 3.67 S S
F3-328 3.67 S S
F3-330 0.48 R R
F3-333 2.27 MR MR
F3-334 2.39 MR MR
F3-335 0.65 R R
F3-338 1.92 MR MR
F3-340 1.81 MR MR
F3-341 3.66 S S
F3-343 3.65 S S
F3-344 0.44 R R
F3-347 3.67 S S
F3-348 2.20 MR MR
F3-349 3.65 S S
F3-351 1.88 MR MR
F3-353 1.21 MR MR
F3-355 0.66 R R
F3-357 2.16 MR MR
F3-358 0.99 MR R
F3-361 2.51 MR MR
F3-362 0.71 R R
F3-367 1.81 MR MR
F3-368 0.93 MR R
F3-369 1.84 MR MR
F3-370 3.65 S S
F3-372 0.74 R R
F3-377 1.42 MR MR
F3-380 1.13 MR MR
F3-383 1.28 MR MR
F3-384 3.66 S S
F3-385 1.69 MR MR
F3-386 1.43 MR MR
F3-389 2.30 MR MR
F3-390 1.82 MR MR
F3-393 2.25 MR MR
F3-395 0.43 R R
F3-399 3.66 S S
F3-400 3.65 S S
F3-401 3.67 S S
F3-402 1.04 MR MR
F3-404 1.16 R MR
F3-405 0.60 R R
F3-406 1.84 MR MR
F3-407 1.27 MR MR
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Molecular marker to select anthrocnose resistance of watermelon and use thereof <130> MP17-078 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1501 <212> DNA <213> Citrullus vulgaris <400> 1 caaactttta agttcccaaa aaaccatgtc caggaggcat cattttctaa atctgctata 60 ctaaaagcaa gaggaaaaat attactatta ccttccatcg tcaagacagt cagtaaggtt 120 ccaccaaatt tacattttaa aaatgtccca tcaactaaat tatttcgcct acagtatctc 180 taaccttcaa ttgatgaccc catagccatg aagcaatatt taaaatgacc atttgaatct 240 aattcatatt cagtaaattg accctaaaaa ataagagaaa aaattaataa gtatataaat 300 cagctgatta ctaacaaatt actataaaat tgatcaatga aatactaaaa taagtgaaaa 360 aaaacttgga ttcatttctt ttaacttcca aaaaaacttg ggaatcaaag cataagaatc 420 accaacatct cctttcaaca acttcaaaat ggattctttt ggcctccaag cttaataata 480 gccaacatta accccataat tcatctgcat ataatgtcta atatcttttg gtgttaaatg 540 atcatagcta tatcttaaat tttcaaccat acaatggcta ataaactgtg aagatatttg 600 cttgtgtgaa gcacaaacca tcatagagca attatgctca ctaatatact tttgaatcat 660 ccataattca ctccttttat aacgtgatgc tctcacaaac cattgacaat catcttgact 720 acattccaac tcaatagatt ttgaatttga cctcaaagct ctaaactcaa aattattctt 780 tacagctacg aactgaaatg acttcaacaa aatttcctta ctagcaaaca agtccttctt 840 aaaaaacaat gcagaagaca tattgttaat atgaaaatct ctaaaaactt ctagttcacc 900 ttcacaatca acctcaatta caaaagaaga tgaagcaact aaaacctcta aaagtgtatt 960 cacaacatga gcaattaaag gatatttcat aaattgatca ttaaccacag acaaaaacca 1020 acatacatct ttatcttaaa gaatcttaac aatatgttga acaccgatat tacctaagtc 1080 caataaaact gacagttcaa tagatgaatc aacttgagtt tcctttcgta tgaggttaac 1140 aaaaggctca aaaggcatcg cttcatcaac caaaacacca atagttttgt aacctacgta 1200 gcattgtcga tcatcccatt aaccactatg gaaaacgact aatggaagtt taaccatatc 1260 tataaaatac tatacaaaat actacaaaaa tataaaaata aaataagata taagtttgaa 1320 cttaccagga tagaaatcaa atgacaattg gttagcaata aaataacaat caagatatac 1380 tattcaatca ccgaccaaaa tatgatctaa gaatactcat atcagatgaa tctccattcc 1440 tcatctaaaa aaaaccactc aataaaaaac aagaagataa atcaaacaca aatttaaaca 1500 c 1501 <210> 2 <211> 1501 <212> DNA <213> Citrullus vulgaris <400> 2 gtcccataaa agagattttt cctctgatct taaatgacga tctatcttct ttacaagtgg 60 gacatgcttg ataacctttg gtactccatc ctgacaagtc cccgtatgca ggaaagtcat 120 taatggtcca taacaaacat gcatgtaatt gaaaatattg cccactcatg caatcataag 180 tacgaacgtc aggagtccac aactctttca actcttcaat caacggttgt aagtacacat 240 caatttcttt tccaggagac tttggtcctg gtataagtaa agacatgaaa aaattagatt 300 ccttcatgca cttccacggt ggcaaattat aaggaacaag aaccacgggc cacatgttgt 360 acacagtact tatattccca aatggattaa agccatctga agctagggtt aaccgaacat 420 tccttgggtc taaagcaaat cgaggaaact ctctatcaac acatttccac ccttcagcat 480 cagctggatg tctcaacaca ccatcagttt caacccgttt atccttatgc catcgcatct 540 cagtagcaat gtgtcttgat gaaaacaatc gcttcaacct cgatattaat ggaaaatgac 600 ataaaatttt gtttggaatc ttcttacttg ttccatcctt cattttgtat caagacttgc 660 cacacacttg acaattttga caattagaat atcttttcca aaataaaacg cagttgtact 720 tgcaagcatg aatagactcg tatcatagtc ttaagtcacg taattttctt ttggcttcat 780 aaaaagaact aggtatatag gatccaacta gaaagacatc tttcaacagg tctagtagca 840 tatcaaagga tttgttactc caattattga gaaccttaat atgcatcaac ctcaccaaga 900 agttaaatga gaaaaatttt gtacaaccag ggtacaacgg gttacgtgct tcatccatca 960 actcctcaaa aatgtttgaa gtatcacttt gttcaatgtt attaggcatt tcatccccaa 1020 aattcttctt catcttcatc atattccatt tctctcatcg gtccttgcaa atcatttaaa 1080 agatctaaca actcattgtc atcattctga gcaataggtt cttcccttaa tccatcatct 1140 actaaagaag ctaaaggagt cattgtcaca ccccctccca gattaccctt actactcagg 1200 gagtgagtac gaaccagcac acacctgtat tctaaaataa ctatctaaca atcaactact 1260 gttcattcaa tcttatctat atgtcatatg atctcataga ataataagac ttatcaagat 1320 aagtgttctc tatatgcatt cagaaaccaa aacccactac aatccaaata acatgtttga 1380 aaaaatgaaa catgtacaaa tactgtgtat ttacaactat cccagaggac tggtccaaaa 1440 taaacccaga cgaggatctc ctgtaggcta gacgtcccgg acatgctcgc tacccgaaac 1500 a 1501 <210> 3 <211> 1501 <212> DNA <213> Citrullus vulgaris <400> 3 aaaacattat tatgaatttt tattacaatt tttcgaagtt agaaactcga ttcttgcacc 60 ctgctccatg ttaaaaaaaa aaaagaaatt aaaagattat tgttattact attatttttc 120 atgctactat caccttaaac tttgatattg tgtctttaaa caaagtctat tataacgttg 180 aattcaataa agttttgtga cttattagtt agacatgttt taagaagtcg tggatgtaat 240 agaagtaaaa ttgaaaggtt atagttttgt tggacacaaa gatcaaatgt gtgacggaaa 300 atacgtgaaa tttacaaatt ttcaaatatg ttaaagacct ataaaccata taattgactt 360 ttaaaaacac tcttaaaaag tagctataaa ataaagaaat taataggtag aagtgctgtt 420 aaactatttg atttttagtt tcttattttt ttagaaaaat taagtttata aaccctgatt 480 ccacatctga atttctttat tttgttgatt attttttaag cgtgttttca aatcaaagcc 540 taagttttaa aaaactaaaa atatgcaact ttaaaaaaca tgtttctatt ttggaatttg 600 gcttaatttc taatatttat ggaaatataa aagtttttgt gagaaaatag aaaacaaaca 660 caattttcaa aaattaaaag ctaaaaatag gcgtcttgtg gttttcattt ggtttttggt 720 ttttattttt gaaaattaag tctacaaaca ctacttccac ctccaatttc ttcatttgtt 780 atatattttt taccaaatgg ttttaaacca cgccaaaatt tgaaaactaa ataaagtagt 840 ttgtaaaaac ttctttttgt ttttgaaatt tggttaaaaa ttcaaccatt gtacctaaaa 900 aatatggaaa cattgtaaaa atgggaagaa atagatttaa ttttcaaaaa taaaaaataa 960 aaaataaaat gattaccaaa cgagacctaa atgatcatct aactctgcac ttataacaca 1020 tttaaaaatt tagaatccca atcaaatgtt aagtaactag gctcataatt atttattttt 1080 tgtttttctt ttgtttttaa tatgaatttg taataactaa atattacaaa atttgctttt 1140 atgaaacttt agtttttcta aatgaaaaag atcttttgtt ttaaaaaaaa atgtttttat 1200 attatattat aatatatatt tggaaagata tgcatgcgtg atttaggcca tcgctttgca 1260 ataattatta attatatgat ttagttcgac cattttattc gattttgtcc ctaattaata 1320 tatttaggat tatttttgtt tagtaatatc atttatagtt gcaaattatt ttattcatac 1380 atatgtcaat catgttctat tgtatttttt caggtaaagt gtctcaattt ggattatgta 1440 tctttacaaa tacaaaaaga aaaatggaat taggtatata tcttttttaa aaaaaaatta 1500 a 1501 <210> 4 <211> 1501 <212> DNA <213> Citrullus vulgaris <400> 4 atcaaattaa atatctaacc tatcaaacat tgattgtaag ccctactttt atctttggga 60 gaaggcaagc aaagtaggcg ggcggttgag agataggtgg tcgagagcct ttgttatggg 120 tgatgtgtgt ggccggcaag aagatgggct aggttgaaga ccttgggtag tcgagcccca 180 agtgagtgtg tgatgcgttg tcttagtgag gcatgcgtcc atgagtttaa gcataggtgg 240 tggttgttgc attgcttgtt gggcaagtgg gctaggcatg caacaagctt tgcgttggtt 300 gaggttagtg agagggatgc gtcagggagc tatgcgtcca agaggaccta tggggctggc 360 acatggtgct atgcgttcaa gctaaaccgg ccaacgggct gcgtgcatag gtagccaaga 420 aaagcagcca actaacctta aaaggatgcg tggaggaggt cttgcacaag gatgcgtcca 480 ccattccttc ttggttgagc aaagcctatg cttaagtgat aagcaagcca gattaagtgt 540 caaattgagg ctaagtgtgg cgtggacatg catgtaagca tgaggtggcg ggataggagt 600 ttgcatgcag atttctggaa agtctataaa taagggtccg gtagaagagg ttggtgtgta 660 caaaccactt gggcgaactg tgattttctt caaccaaact atcccaaatt gagtctactt 720 ttactgaaag ggctgccaga cagaaactct atgaggaaga actcagattt catcaaaaac 780 tcaagcttgc tctggccatc gagtaaactg gagcagatca gaaatacttg aatatatctg 840 gtagtagaaa aataattgga agctgaaatt ttgaagtaag ctagccaagg catttattta 900 caactttgta acagaaaaaa aaatctaatt cttgctagaa atattacttt tgatagctag 960 aagtaagagt tgtatgatta aggttgttga gtgagtttta gagtggtcgt gcatgcagtg 1020 tggcttgggc cgtgaccgga aggaggaacc atttgagttt attttgacaa gttatggatg 1080 ccactagcaa cacaaaggtg agtgagaaat gctgctgatc gtgtacaggt tgtgggggcg 1140 agacgggtct cgctggtggc gttgtgtgca tgtagaattt gatcaagacg aatctcgttg 1200 gtctcattga ggcacacgac actcattcca ctgaggattc aattgtgaaa gtttaagtta 1260 cttagctatt ctagaatcaa atcaatttta tttgacgatt ggaattcaag ttgtgaattt 1320 tggaaagtaa aactaaataa ggaaagcaat aaaataagaa acacaagagt caaagagagt 1380 tctagggtaa tgaatccttg tttacttcat catgcaatat tctagggttc atggatttta 1440 ttgcaattct tatgcttaag tctagaaact taaatctagg ttattttctc taaaaaacaa 1500 c 1501 <210> 5 <211> 1501 <212> DNA <213> Citrullus vulgaris <400> 5 aaaagtccgt ttggtaacaa ttttattttt gtttttggtc tttgaaaatc aaggctatgt 60 cctttttaat tgtttatcat gatttctacc tttatggaat aaaagagttg aattcttaat 120 taaattttaa aaatacaaac aagttttaaa aactattttt ttttttcaaa atttggcttg 180 gttttttttt taaaaaaata ttggtagaaa gtagataaca aaagcaaaaa aatttaaagg 240 tgaaatgagt gtttatatgt ttaattttca aaaactaaaa ataaaaaagc aaggctctgt 300 tggttaacca tttcgttttt tatttttagt tgttgaaaat gaagtttatt ccctctcaat 360 cgagttctta caatgatttg catttttcct aaatacagta gttgattctt aaccaaattt 420 caaaaacaaa aacaaaatta tttttaaaaa ctattttttt agttttcaaa atttgacttg 480 atttttttaa actaatggta aaaagtagat aacaaagaga aaaatttaga agtaggagta 540 gtgtctataa gtttaatttt caaaaacaaa aaggaaaaaa aaatcaaata gttatcaaac 600 gagacccaaa tagttaacga acgaaaacct aaaataatta tcaaacgata cttaaataac 660 ataatttcaa caaaaatcat ctatggaatt cacaattcac caagaacttg gataactata 720 attcaaaaac taaattggag ggagaaaaac ttcttatcat atatatatat atattaaaaa 780 gaaaaagaga gatatacccg aaaagaagaa gatgatgatt gaaagcctaa acaattgcat 840 ttgaaacgcc atattggatc caaattctct ttgtaaaatt gtattttttg gaagctgttt 900 ctcttcgtgt gaatattgat tgatatgaat atttgtgtga agcgaagact attatatagc 960 caattccttt ggattaaaaa aggtattata attaaggata atgatggatt tagcattgtg 1020 ttaattaact gataattttg taataagtag gataagtcca ccctaacctc tcctttttac 1080 tcatcaaccc aaccataaat gctcaaaaat agcctctaac ttttctctta acctttctct 1140 ttctaccatt ctttcttttc tttttctctc atcttccaaa aattttccct ctaggatcca 1200 tttaggaaga aatttcattt ttttgtcact taactacttt tgttaagttg ttaattttag 1260 gcttcttttt ataagcattt ggtttttttt ttttttttta tattttcaaa tattaagtgt 1320 gtataaattt tagaagtgtt ttaaacaccg attccaaatg attattaaaa ggagttttgt 1380 tggcttttag tttttgaaaa ttaagtctat atacgcaaat tctacctcta aaatccttac 1440 tctattattt actttctacc aaatatttta aaaaacaagg ctaagttttg aaaaataaaa 1500 a 1501 <210> 6 <211> 1501 <212> DNA <213> Citrullus vulgaris <400> 6 aaaaaattat catttttccc ctttcccatt cttcctcctt cctccatttc tctcattccc 60 ttcatcttct tccctctctc ctcttcttca tacttcttcc tctatttcct cactttctca 120 tttcaaattc ccttacaaag ttcaactctc aacctccaca ctcccctata aattgatggg 180 gattcacaat gggaaagggg cagaaaacac agtggaggag agatgattat agatattgaa 240 gaaaaaggag agtgtaggtg aagacgtaga gaaaaagagt tgggaggaag tttattgttc 300 ctaaaaaatc cggtgagcat acattaattc tgacacctca cacaacctca tttcatcgaa 360 tacttcacta catccctcta gcaaagaccc aaaccaagtc cccatgcgat ctagacctct 420 agcgagcaac ttgacgtccg atggatgaaa actcgattct gacaacaaac ctatagtaat 480 ccaactctcc atcaaccatt gaagaagaag ttgagagggt gaagaacaag gtggattgtg 540 aaaagaaaga aggagaggaa gaaaactttg gcagagttgg tgggtcctaa attaaacttc 600 aatttaattt cttttgaaat ctcccaaaag agtttaaatt aatttcaatg catatttatt 660 ggaattttaa aacaatatca agtttgtttc cttattaatt tttagattgg atttaattag 720 attttgggcc tagctctcat acagtccctc caaattttat cttaatctaa tttcaatttg 780 gagttttaaa atataattcc aatatcaatg aggtatcaag cccttcaatt taatttaatg 840 agtttcaaat ttgtttcaat ttaaagcttt ctaaaaatgg catttcaaga cacgttaatt 900 tttcatgaat ggttttaaac ttggttttaa tccaacattt ttaattgatt ttcaatttca 960 ttcaaatttg ggtgttttaa ataaaatttc aattttattt tcaccttgat ttacgaaatg 1020 aatttcaatc ttcttttgaa gtgcttacac cactcataag ggttgatttt catattttac 1080 ttctaaaata tgagttgatc tacatgagac attccttaaa ttatcatgct aatcctacaa 1140 cggagttgag attttcagat gtctcaaatt cttgaagtaa atgttttctc taactagaga 1200 tttcaaacat taacatgata atggatgttt gtttgttcac aaaatgtgac tctactttag 1260 tcttaaagtt agagtgagat ttagtgagac attgttcaaa ttcaatttga acatttaagt 1320 gttaattaat tttttccatt tcaattgaat ttataatata aaaataaagt ttgactatga 1380 attttaaata aaattgtcta taagcaatag ttttgtctag gttggggtac ttaaaatgat 1440 tgtaagggaa taactctact tgggaactat taagttagtc atattttatt ttttttaata 1500 a 1501 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL14-27-7 F <400> 7 tgctctcaca aaccattgac a 21 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL14-27-7 R <400> 8 gaagtcattt cagttcgtag ctgt 24 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL14-27-9 R <400> 9 tttccaaaat aaaacgcagt tg 22 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL14-27-9 R <400> 10 tgaagccaaa agaaaattac gtg 23 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL14-27-40 F <400> 11 tggttttcat ttggtttttg g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL14-27-40 R <400> 12 ttcaaatttt ggcgtggttt a 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL14-27-50 F <400> 13 ttactgaaag ggctgccaga 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL14-27-50 R <400> 14 agtttactcg atggccagag c 21 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL14-27-54 F <400> 15 tcaaaaacta aattggaggg agaa 24 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL14-27-54 R <400> 16 gcaattgttt aggctttcaa tca 23 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL14-27-60 F <400> 17 agattttggg cctagctctc a 21 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL14-27-60 R <400> 18 tgaagggctt gatacctcat tg 22

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 염기서열 내에서 751번째 염기에 위치하는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
    서열번호 2의 염기서열 내에서 751번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
    서열번호 3의 염기서열 내에서 661번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
    서열번호 4의 염기서열 내에서 751번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
    서열번호 5의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개로 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
    서열번호 6의 염기서열 내에서 751번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개로 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물.
  2. 서열번호 1의 751번째 염기, 서열번호2의 751번째 염기, 서열번호 3의 661번째 염기, 서열번호 4의 751번째 염기, 서열번호 5의 501번째 염기, 또는 서열번호 6의 751번째 염기를 포함하는 8-100개의 연속된 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는, 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는, 서열번호 7 및 8으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 17 및 18로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트.
  4. 제 2항의 프라이머 세트를 포함하는, 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하기 위한 키트.
  5. 다음의 단계를 포함하는, 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하는 방법:
    (a) 판별하고자 하는 수박 품종으로부터 게놈(genomic) DNA를 얻는 단계;
    (b) 상기 게놈 DNA에서 서열번호 1의 751번째 염기, 서열번호2의 751번째 염기, 서열번호 3의 661번째 염기, 서열번호 4의 751번째 염기, 서열번호 5의 501번째 염기, 또는 서열번호 6의 751번째 염기 타입을 검출하는 단계; 및
    (c) 상기 검출한 염기 타입으로부터 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하는 단계.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 제 2항의 프라이머 세트를 사용한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하는 방법.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 단계 (c)는 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔-전기영동, 서열분석, 방사선 측정, 형광 측정, 및 인광 측정으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 수박 탄저병 저항성 개체를 판별하는 방법.
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