CN112410463B - 一种番茄抗青枯病的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种番茄抗青枯病的分子标记。其中所述分子标记为SNP分子标记或dCAPS分子标记，所述SNP分子标记如SEQ ID NO.1所示，所述dCAPS分子标记为基于Bwr6所在QTL区间内的一个只存在于携带Bwr6品种中的特异性SNP分子标记(即SEQ ID NO.1)开发获得的dCAPS连锁分子标记。该dCAPS分子标记具有较好的准确性和特异性，能有效鉴定抗青枯病番茄品种，并在88份商品种进行测试未发现假阳性结果的出现；与最新发表的Bwr6连锁分子标记RsR6‑5相比，本发明开发出的分子标记也显示出了更高的准确性。

Description

一种番茄抗青枯病的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及番茄抗青枯病技术领域，尤其是涉及一种番茄抗青枯病的分子标记及其应用。

背景技术

番茄(Solanumlycopersicum)是一种重要的蔬菜作物，也是世界产量最高的30种农作物之一。番茄青枯病在中国南北各地均有发生，是一种由茄科劳尔氏菌(Raslstoniasolanacearum)引起的细菌性维管束病害，该病害在高温、土壤湿度大的低纬度地区发生尤其严重，主要通过土壤水分传播，由植物伤口及根冠处入侵，能够通过根鞘抵达皮层间隙，最终定殖在植物的导管内并迅速的繁殖，严重阻碍地上部的水分运输，从而使植株呈现缺水的表现。在气温较低的傍晚和清晨蒸发量低时，发病植株可部分恢复正常。青枯菌能在自然环境中长期存活，在无菌水中室温下保存4年之久仍可保持致病力不减，可见其顽强的生存能力，农业生产中，发生青枯病的田块难以根除该病害。

过去的数十年间，遗传和育种学家在栽培番茄的近缘野生种醋栗番茄及栽培番茄变种樱桃番茄中鉴定到了抗性资源，并运用到了抗性遗传机制研究及育种应用中。番茄青枯病抗性材料醋栗番茄PI127805A衍生出的Hawaii7998及Hawaii7996等自交系被广泛运用于抗青枯基因定位研究中，大部分研究表明其抗性主要由分别位于6号和12号染色体的两个主效位点Bwr6及Bwr12控制，其中Bwr6表型变异解释率为11.5–22.2％，定位于番茄第6号染色体37.3Mb至39.3Mb的区间内。到目前为止，这两个抗病主效QTL位点均未克隆到基因，为番茄抗青枯病的分子标记开发及分子标记辅助育种带来了一定困难。关于Bwr6与Bwr12报道的分子标记也较少，2018年报道了一个的Bwr12的HRM分子标记KHU-1(Boyoung Kim etal,Theoretical andApplied Genetics(2018)131:1017–1030)，2020年报道的Bwr6的CAPS分子标记RsR6-5，Bwr12的dCAPS分子标记RsR12-1(Alebel MekuriawAbebe et al,Breeding Science(2020)70:462–473)。

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)是指群体基因组DNA序列中单个碱基的变化，包括单个碱基的插入、缺失和替换。SNP变异位点具有以下优点：数量多，分布广；富有代表性，可通过CAPs(酶切位点多态性标记)、dCAPs(介入性酶切位点多态性标记)、KASP(竞争性等位基因特异性PCR)、AS-PCR(等位基因特异PCR技术)及HRM(高分辨率熔解曲线)等技术转化为分子标记，便于开展分子标记检测。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供了一种与番茄抗青枯病相关的分子标记及其应用。

一方面，本发明提供了一种用于鉴定番茄抗青枯病基因型或用于鉴定番茄抗青枯病品种的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示。其序列如5'-AACAATACTATTGGTCATATAGAAAAGGTAAAGTATCCCTATTTTCTCACCTTTTAATTTCATATTTTTATGGTCTATACAAAATTAATGCCAGGAAAGGCAACAATTACTGTGGCAGTTCCTAGTATGATAGTATACAAAAGAAAGGAAAGAGGGATAAACGTATACATAGCATCTTCAGAATTTGCTGTAAAATCATGCAACTCCAAGCTAGCTATCCATTGCAGTTGATCTTATATAACTTTGGATTTATATGCAGGCATTGCCAATGACATTTCTACTTAAGCATTTTATTGCACCTAGCATTATAAGAGTTTTATTTTTGGGACTGACTATTCAGAACACAGCAAAAGTCAAGCAATCATTCAGATATTCTTGGTGACTAAAAGTTGTTATAAAATAGCTGCTAATTTGTTAGATAGAGTACCCAGTTCCACAAACCTAATAGTTCCTGATAATGTGTTTGGATTTGCCTATTTTACTTGTGTGTTACATCATGAG/AATCATTGTTATTGTAATCCTCACCTTTACTGCAGTTTATTTTCCTTTTTCTTCACATGAGTTATAGTTGGGCTTTCCTGAAATTTGTATTCAGGATCATATTTTACCTAGTGACTACCCAGTAAGATCATATTCATGCGGAGAAAATGTAGCTGTGTCATCTAGGTGACTGAAACTGTAAAATAGCTGCCTGAGAAAAAGACATTTTTATCCAACTTATTAATTATTCATTGAATTTCTTACATTAGGCTCTAGGACCTGAAGGTTACACATCAGGCATATTGAAGACATGTCCAGGTAGAAAGGTAGGAGAGAACTCTATGGGTGATTATACCACCATTGAGCTAATAGGCAGGGATCGTCCAGGCCTTCTATCAGAAATTTCTGCTGTTCTAGCCAATCTTCATTTTAATGTCGCTGCTGCCGAGGTTTGGACTCATAATGGGCGCATAGCATGTGTCCTTTATATCAATGATAATTGTTCATCCCTTGATGAGGATG-3'(SEQ ID NO.1)所示，其中G为参考基因组对应碱基，A为突变碱基。

一方面，本发明提供了一种用于鉴定番茄抗青枯病基因型或用于鉴定番茄抗青枯病品种的dCAPS分子标记Bwr6-specific-M，其特征在于，所述分子标记Bwr6-specific-M是基于Bwr6所在QTL区间内的一个只存在于携带Bwr6品种中的特异性SNP分子标记开发获得的dCAPS连锁分子标记，该特异性SNP分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示。

一方面，本发明提供了一种用于鉴定番茄抗青枯病基因型或用于鉴定番茄抗青枯病品种的特异性扩增引物，其序列为：5'-ACACTGACGACATGGTTCTACATTGGATTTGCCTATTTTACTTGTGTGTTACATCTCGA-3'(SEQ ID NO.5)和5'-GCAGCTATTTTACAGTTTCAGTCACC-3'(SEQ IDNO.6)所示。

一方面，本发明提供了一种番茄抗青枯病的分子标记的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤：

(1)对番茄自然群体中在Bwr6区间内的亲缘关系进行分析，筛选出携带有Bwr6和不携带Bwr6的材料；(2)在Bwr6区间内按如下条件:在携带Bwr6的番茄材料中SNP类型均为突变型，在不携带Bwr6的材料中SNP类型为野生型，进行Bwr6特异SNP的鉴定；(3)得到Bwr6特异SNP后，将其以dCAPS的形式转化成分子标记，进而获得特异性强的Bwr6连锁标记。

具体而言，本发明的分子标记的筛选方法具体是：

(1)将GVM网站中的包含当前已发表番茄自然群体的SNP基因型数据在Bwr6区间内(SL2.50h06:37378747-39346684)的所有SNP调取出来，构建进化树分析所有材料与携带Bwr6位点的材料TS-4(Hawaii7998)的亲缘关系，将自然群体中的材料分为携带Bwr6与不携带Bwr6两类群体；(2)获得两类含有Bwr6和不含Bwr6位点的群体之后，按规则：Bwr6群体内基因型为AA，即：突变型；非Bwr6群体内基因型为RR，即：非突变型，并筛选出Bwr6特异的SNP；(3)将上述SNP设计以CAPS或者dCAPS的方式转化为分子标记，用已知含有Bwr6和不含Bwr6位点的材料进行初步测试，验证使用效果。

一方面，本发明的筛选方法还包括选用不含Bwr6位点的商品种对初步开发的Bwr6分子标记的假阳性进行测试，以确定初步开发的Bwr6的分子标记的可靠性的步骤。

一方面，本发明还提供了基于特异性SNP分子标记开发分子dCAPS分子标记的具体方法，其特征在于，选取SL2.50ch06_37710298_G_A并将其转化为dCAPS分子标记Bwr6-specific-M。其中，dCAPS分子标记的正向引物SEQ ID NO.5是根据SEQ ID NO.1所示SNP的位点附近序列，即：5'-TTGGATTTGCCTATTTTACTTGTGTGTTACATCATGAG/AATCATTGTTATTGTAATCCTCACCTTTACTGCAGTT-3'设计获得。具体是将G/A突变位点附近的序列改造为XhoI酶切位点，即CTCGAG(XhoI酶在该酶切位点的第一个碱基C与第二个碱基T处切开DNA片段)，将下划线部分的AT改为TC，同时在5'端再增加22bp随机序列5'-ACACTGACGACATGGTTCTACA-3'，增加酶切后的片段大小差异，以提高在琼脂糖凝胶电泳上的分辨率(普通的琼脂糖电泳难以区分低于40bp的条带大小差异)。根据该方法获得的正向引物序列为5'-ACACTGACGACATGGTTCTACATTGGATTTGCCTATTTTACTTGTGTGTTACATCTCGA-3'(SEQ ID NO.5)所示。反向引物的设计无特殊考虑，只要求选取其做反向引物后，其与正向引物间序列除了SNP位置外没有额外的XhoI酶切位点，反向引物序列可以是5'-GCAGCTATTTTACAGTTTCAGTCACC-3'(SEQ IDNO.6)所示。

利用开发的dCAPS分子标记Bwr6-specific-M进行品种基因型鉴定的原理是基于：

(1)感病品种在此处SNP为G时，则用这对引物扩增后其产物序列为：5'-ACACTGACGACATGGTTCTACATTGGATTTGCCTATTTTACTTGTGTGTTACATCTCGAGATCATTGTTATTGTAATCCTCACCTTTACTGCAGTTTATTTTCCTTTTTCTTCACATGAGTTATAGTTGGGCTTTCCTGAAATTTGTATTCAGGATCATATTTTACCTAGTGACTACCCAGTAAGATCATATTCATGCGGAGAAAATGTAGCTGTGTCATCTAGGTGACTGAAACTGTAAAATAGCTGC-3'(SEQ ID NO.7)。此时，该SNP位点G处为XhoI酶切位点，加入XhoI酶切后，PCR产物变为5'-ACACTGACGACATGGTTCTACATTGGATTTGCCTATTTTACTTGTGTGTTACATC-3'(SEQID NO.8)与5'-TCGAGATCATTGTTATTGTAATCCTCACCTTTACTGCAGTTTATTTTCCTTTTTCTTCACATGAGTTATAGTTGGGCTTTCCTGAAATTTGTATTCAGGATCATATTTTACCTAGTGACTACCCAGTAAGATCATATTCATGCGGAGAAAATGTAGCTGTGTCATCTAGGTGACTGAAACTGTAAAATAGCTGC-3'(SEQ ID NO.9)，即55bp与194bp两个片段；

(2)抗病品种在此处SNP为A，则用这对引物扩增后其产物序列为：5'-ACACTGACGACATGGTTCTACATTGGATTTGCCTATTTTACTTGTGTGTTACATCTCGAAATCATTGTTATTGTAATCCTCACCTTTACTGCAGTTTATTTTCCTTTTTCTTCACATGAGTTATAGTTGGGCTTTCCTGAAATTTGTATTCAGGATCATATTTTACCTAGTGACTACCCAGTAAGATCATATTCATGCGGAGAAAATGTAGCTGTGTCATCTAGGTGACTGAAACTGTAAAATAGCTGC-3'(SEQ ID NO.10)，此时，该SNP位点A处不是XhoI酶切位点，在整个序列内其它处也没有XhoI酶切位点，因此加入XhoI酶切后，PCR产物无法被酶切开，仍为249bp。

一方面，本发明还提供了一种鉴定抗青枯病番茄品种基因型或用于鉴定抗青枯病番茄品种的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)提取待测番茄样本的总DNA；(2)以该待测番茄的总DNA作为模板，利用SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示引物对进行PCR扩增反应；(3)对PCR扩增产物进行酶切、胶电泳检测；(4)根据电泳结果判定抗青枯病番茄品种的基因型或根据电泳结果判定待测番茄样本是否为抗青枯病番茄品种。

一方面，本发明还提供了PCR反应体系为总体积10μL，具体包括10XEasy Taqbuffer 1.0μL，dNTP(10mM)0.2μL，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示引物各0.2μL(10mM)，DNA模板2μL(100-200ng/μL)，Easy Taq酶(5U/μL)0.1μL，ddH₂O 6.3μL。

一方面，本发明还提供了PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，72℃延伸5min，4℃保存10min。

一方面，本发明还提供了酶切体系：10μLPCR产物，0.2μL(10U/μL)的XhoI限制性内切酶，1.25ul的10X酶切buffer，1.05μL的ddH₂O,上述各组分混匀，37℃酶切3个小时。

一方面，本发明还提供了胶电泳检测：酶切产物用3％琼脂糖在110V压条件下电泳30min，最终结果在凝胶成像系统上显示。

一方面，本发明还提供了结果的判断标准：具有249bp大小带型的为抗病基因型，具有194+55bp带型的为感病基因型，三种带型均有的为杂合基因型；其中抗病基因型和杂合基因型均是抗青枯病番茄品种。

一方面，本发明还提供了一种用于鉴定抗青枯病番茄基因型或鉴定抗青枯病番茄品种的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示引物对。

一方面，本发明提供的试剂盒还包括10X Easy Taqbuffer、dNTP、Easy Taq酶、XhoI限制性内切酶、10X酶切buffer和ddH₂O。

另一方面，本发明还提供了所述分子标记或试剂盒在筛选或鉴定抗青枯病番茄品种或鉴定抗青枯病番茄基因型或辅助番茄育种方面的应用；

本发明的有益效果是：本发明开发的分子标记Bwr6-specific-M具有极强特异性，在88份商品种进行测试未发现假阳性结果的出现，同时与2020年最新发表的Bwr6分子标记RsR6-5比较，对RsR6-5鉴定为抗病而我们的dCAPS分子标记Bwr6-specific-M鉴定为感病的品种进行青枯病接病鉴定，结果显示这些品种均为感病品种，这表明本发明开发的标记准确性优于RsR6-5。

附图说明

图1是基于Bwr6内SNP构建的TS-4与重测序材料的亲缘关系，其中，TS-231与TS-4为已知携带Bwr6的抗性材料；

图2是所述分子标记Bwr6-specific-M验证结果：泳道1-8为已知Bwr6纯合材料GX-16，GX-22，GX-31，GX-39，GX-40，GX-53，勇士1号，Hawaii7996；泳道9为浙砧7号；泳道10-11为阳性与阴性对照TS-4，AC；

图3是所述分子标记Bwr6-specific-M在88份商业品种中的检测结果：每排12-13泳道分别为阳性和阴性对照，最右侧为标尺；

图4是分子标记Bwr6-specific-M的跑胶结果：其中，a为Bwr6-specific-M的跑胶结果；b为RsR6-5的跑胶结果；泳道1-13分别为TOM-3号、TOM-6号、TOM-14号、TOM-16号、TOM-25号、TOM-28号、TOM-30号、TOM-52号、TOM-54号、TOM-63号、TOM-67号、TOM-81号、TOM-92号；泳道14为阴性对照A57；泳道15-16分别为抗青枯阳性对照浙砧7号和Hawaii7996；泳道17-23分别为TOM-1号、TOM-12号、TOM-23号、TOM-39号、TOM-49号、TOM-74号、TOM-56号；

图5是Bwr6-specific-M与RsR6-5标记结果矛盾的植株接病照片。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语均属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1、番茄抗青枯病的分子标记的筛选方法

番茄抗青枯病的分子标记的筛选方法包括如下步骤：

(1)对番茄自然群体中在Bwr6区间内的亲缘关系进行分析，筛选出携带有Bwr6和不携带Bwr6的材料；(2)在Bwr6区间内按如下条件:在携带Bwr6的番茄材料中SNP类型均为突变型，在不携带Bwr6的材料中SNP类型为野生型，进行Bwr6特异SNP的鉴定；(3)得到Bwr6特异SNP后，将其以dCAPS的形式转化成分子标记，进而获得特异性强的Bwr6连锁标记。

具体而言，所述分子标记的筛选方法具体是：

(1)将GVM网站中的包含当前已发表番茄自然群体的SNP基因型数据在Bwr6区间内(SL2.50h06:37378747-39346684)的所有SNP调取出来，构建进化树分析所有材料与携带Bwr6位点的材料TS-4(Hawaii7998)的亲缘关系，将自然群体中的材料分为携带Bwr6与不携带Bwr6两类群体；(2)获得两类含有Bwr6和不含Bwr6位点的群体之后，按规则：Bwr6群体内基因型为AA，即：突变型；非Bwr6群体内基因型为RR，即：非突变型，并筛选出Bwr6特异的SNP；(3)将上述SNP设计以CAPS或者dCAPS的方式转化为分子标记，用已知含有Bwr6和不含Bwr6位点的材料进行初步测试，验证使用效果。所述筛选方法还包括(4)选用不含Bwr6位点的商品种对初步开发的Bwr6分子标记的假阳性进行测试，以确定初步开发的Bwr6的分子标记的可靠性的步骤。

结果显示：根据自然群体中的进化树分析结果表明(图1)，自然群体中TS-231与TS-4(Hawii7998)在Bwr6区间内的亲缘关系最近。查阅原始信息发现TS-231即为L285，L285在六号染色体上Bwr6对应区间同样存在一个抗青枯的位点，因此将TS-231与TS-4归为Bwr6群体，其它材料归为非Bwr6群体。按照Bwr6群体内SNP基因型为突变型，非Bwr6群体内SNP基因型为野生型的原则，共获取Bwr6区间内的特异性SNP四个(SNP命名格式为基因组版本_染色体号_物理坐标_参考基因组碱基_突变碱基):SL2.50ch06_37710298_G_A，该SNP在参考基因组上下游500bp序列为5'-AACAATACTATTGGTCATATAGAAAAGGTAAAGTATCCCTATTTTCTCACCTTTTAATTTCATATTTTTATGGTCTATACAAAATTAATGCCAGGAAAGGCAACAATTACTGTGGCAGTTCCTAGTATGATAGTATACAAAAGAAAGGAAAGAGGGATAAACGTATACATAGCATCTTCAGAATTTGCTGTAAAATCATGCAACTCCAAGCTAGCTATCCATTGCAGTTGATCTTATATAACTTTGGATTTATATGCAGGCATTGCCAATGACATTTCTACTTAAGCATTTTATTGCACCTAGCATTATAAGAGTTTTATTTTTGGGACTGACTATTCAGAACACAGCAAAAGTCAAGCAATCATTCAGATATTCTTGGTGACTAAAAGTTGTTATAAAATAGCTGCTAATTTGTTAGATAGAGTACCCAGTTCCACAAACCTAATAGTTCCTGATAATGTGTTTGGATTTGCCTATTTTACTTGTGTGTTACATCATGAG/AATCATTGTTATTGTAATCCTCACCTTTACTGCAGTTTATTTTCCTTTTTCTTCACATGAGTTATAGTTGGGCTTTCCTGAAATTTGTATTCAGGATCATATTTTACCTAGTGACTACCCAGTAAGATCATATTCATGCGGAGAAAATGTAGCTGTGTCATCTAGGTGACTGAAACTGTAAAATAGCTGCCTGAGAAAAAGACATTTTTATCCAACTTATTAATTATTCATTGAATTTCTTACATTAGGCTCTAGGACCTGAAGGTTACACATCAGGCATATTGAAGACATGTCCAGGTAGAAAGGTAGGAGAGAACTCTATGGGTGATTATACCACCATTGAGCTAATAGGCAGGGATCGTCCAGGCCTTCTATCAGAAATTTCTGCTGTTCTAGCCAATCTTCATTTTAATGTCGCTGCTGCCGAGGTTTGGACTCATAATGGGCGCATAGCATGTGTCCTTTATATCAATGATAATTGTTCATCCCTTGATGAGGATG-3'(SEQ ID NO.1)。SL2.50ch06_37605811_G_T，该SNP在参考基因组上下游500bp序列为5'-AAAAAAATGTTAACTTAATTATTTTTTTCCTAATATTGATAACTACTTTTTAAAGAAAAAGTTTCACAAACAATTTTACTTAAAAGATTAACTCATTAAAAAAATGAAAGAAGAAAATACCAGATGAATAGTATTTGTAAATAAAATAATATATTGTTATGAGTATGACATAATAATTTTTTTTATAAAATATTAATCATCTATATAATGTTTAGAATCTTGATTTAATTAATTAAATATTAGCCGTTAATTTTTTCTTTTGTTATGAGTTTTCAATTCAAGTAAAAACTTAAGAAAATGGAGAGGGAGTTGGATCCAAAAATAAATAAATAATAAAAATTTACAATATTTTTTTTATATGAAGAAATCGGGGTCTTGAAGAAGTATAATGTTTTGATTTGGTTAAATAATGATAAATAATCTAATTAAGGTGGGTTCTTTATACTACACATAATAAATTTTTAAAAAATAAAAAATAAAGAGAAAATTGTTAATTTCAAG/TAATATAAGTGAGCGAAAAAGATGAATAAAAGAATTTTTTAGATCAAAAGATGAACTAAGGATAATATTTTTGATATTTTACCTTTTTTTTAATTATAACGTTGTTAAGATACTCAAAGGACCAATTATAAGAAAACCACCCAAAGGTTTCATGAAAAGATTGAAAAAACCATCAAACAACGCAATACAACTGCTCAACTAGAATCAACATAACAAAAAAATATACTTAATGAGATCATTTATAACCTAAATTATAACCCCTCCGTGCACTTTCATTTATCATGTTATATTTTACGCAAGTCAATTTGATTCATTTTAAAAGTTAAATGAGATTATATTAATTTAATATTTTAAATAAAATTTTCAGATATTTAAAAATTATATGAAAAGTATCATGAATTGTAGTTTTTTTTTGCATATATGAAAAAATACATTATAAATATTAGTCAATTTTTTTATAATTTGACTCTAAATATGAAAAAAAATGACAATTAAAAATAG-3'(SEQ IDNO.2)。SL2.50ch06_37702499_C_A，该SNP在参考基因组上下游500bp序列为5'-AAGCTATTCTATTAATCTTTAACACCCTAGCTGCCCGGCCCCTTCTCTTTCCTATTCCATTTTTGTAAAAGACCTAGGTTCTTTTTCACTTTGCTCAATTTTAATTAGTCCCTTTTTTTATTTGTAAAAATCAAGAAAAAAGTATTTTAAATTTATTATATCCTTAATTATTTAGAGAGTTAATATTTTTGAAAAAAAGTAAAATCTTTTAATGAGTAAATTTATTTTGTGATTCTATCAATTAATATGGATAAAATGATAAATTTATGATGTCAATTTTTTTAATATGCATGTCAAATAAAAATGGACAAGTATAACTTTTTGAAGTTCTAAGAGCAGGCTATAAATTGAGAAAAATACGTACTCGTACCAAACATATATTTACTCTCAAGTTTGAAACAGGTAATTATTTAACCTACGTTGGTTTAAATAAAATATATTTCACTTAGTTACTAAAATATAAAAGGGGCAAATTTACGTTCATTTGTTTGGTGTAAACAC/AAAGTCCAACTAAAAGGTATATGGGAGTAAAATTGGACCACTTTGATCACCTTATCTTAGAAACTAAAATGGATGATATGAGTGTATTGTTAATTAGATATGCATTTTAAATATTTGTAAAAAATTTAAAAAACCAATTTTTTTTAAAAAAATATGTTTCTTTAAAATAAAAAAGATAAATTTTCGTGAAAGCAGAAAAAATAAATTCTTACAAATAACATTTTATATTGATTGTATATCCAAACTATCACTTCTTCTTAACCACACCTACATAATCCCATCCCCACCACACTACCCTTATAACCCCACCCCATCCCCAAAAATAGTGTTTGCCTAGATATATACAAATATTTGGATGATAGAGGTTCATTCAAATAAGTACTATATATCTTATATATCTAGTGATGTAATTTCATTCCATGCGATATTTAATCACATCATATTCATAATTCCTTTAAAAGGGGTAGGCAAACATAAGAATCAAGAGTTAAAATTTTCACG-3'(SEQ ID NO.3)。SL2.50ch06_38358672_G_C，该SNP在参考基因组上下游500bp序列为5'-TAGTATTTCCTACGTAGCATTCCCTGAAAAACAAAAAAAAATTACTCTTCTGGTGTGTAATTTTATATATATAAATATATATCTAAATGCTAACTGAGAAGTTGTTATTTGTGATAAATACACTTCTTGTTTCCCCTATTTCTATCAGCTAATTAACCAAGTTGTTGTGTACCTTTCTTTGTTTATGCTCAAATGCTTGTATCATGCGTTAGCTAAATGGTGCCTTTTTGGTAAAACAAATCTCTTGGCTGAATACTTAACACGGAGTATATGAGACAGTTATAGTCTTATAGATGGATTTTTTTTGTTGGATGAAGGGAAAAAATCAACCAAAAGTGCATCTTAGGGTGTGTTTGGTGTGAAAAAATCAACACCCCCTCCCAACTTCGACATGGGACCTAACTCCTGACCCCAGACTTTTGATCTCGACTTGAGACTCAACTACTTGACTCTACCCAACTATTGTGTTAGATTTTCACACCTAAGAGTCATTCTTCCTTG/CTGGTGAATGAACATAGGGCTGTTTGAAGTTAAAATACCTTCAGGGACATGGTTTGTGTAAGGAAAGAGTGAGCACATTGCTCATTTTGGTATATGGGCATTACGTATATAGCAAAAGTTTGGAGTGTGGATGAAAGGCAAATAAAAAATTTGGTATCGGAAGTATCTAAATGGTACATTCGACAAAAGTGAAATGAAACATTTCTGTGTAATTCTCTTCTATAGGGCAAAACAAAAACCAAATCTAAGCCAATCCGGAGCAGGGGATGGAAGGTAAAATAAATAAGTTGAATAAAAGATCCTGAATTCGATTTTACCTAAACAGTAATTAGACAACAATGAACGGTTCGTTTCTTCTATACCAAACTTTTAGCCAGTTCATGTTTCGAGTACACCCGACATTAGACTTTATCCTCTAATTTCTCGTTTACTAGAGGGACAAACTCCATACTTTTTCTGGGGGTCCGTGGTGTTCGGGGAGTGCCTGGTGTTTGTTGTGAG-3'(SEQ ID NO.4)。

实施例2、基于特异性SNP标记开发分子dCAPS分子标记

根据实施例1筛选的四个特异性SNP，开发dCAPS分子标记，综合内切酶的切割效率及设计后的PCR扩增效果，仅有SL2.50ch06_37710298_G_A转化的dCAPS分子标记Bwr6-specific-M验证成功。其中，dCAPS分子标记的正向引物SEQ ID NO.5是根据SEQ ID NO.1所示SNP的位点附近序列，即：5'-TTGGATTTGCCTATTTTACTTGTGTGTTACATCATGAG/AATCATTGTTATTGTAATCCTCACCTTTACTGCAGTT-3'设计获得。

具体是将G/A突变位点附近的序列改造为XhoI酶切位点(CTCGAG，在第一个碱基C与第二个碱基T处切开)变异，将下划线部分的AT改为TC，同时在5'端再增加22bp随机序列5'-ACACTGACGACATGGTTCTACA-3'，增加酶切后的片段序列差异。根据该方法获得的正向引物序列为5'-ACACTGACGACATGGTTCTACATTGGATTTGCCTATTTTACTTGTGTGTTACATCTCGA-3'(SEQID NO.5)所示。反向引物的设计无特殊考虑，只要求选取其做方向引物后，其与正向引物间序列除了SNP位置外没有额外的XhoI酶切位点，反向引物序列可以是5'-GCAGCTATTTTACAGTTTCAGTCACC-3'(SEQ ID NO.6)所示。

利用开发的dCAPS分子标记Bwr6-specific-M进行品种基因型鉴定，具体是：(1)感病品种在此处SNP为G时，则用这对引物扩增后其产物序列为：5'-ACACTGACGACATGGTTCTACATTGGATTTGCCTATTTTACTTGTGTGTTACATCTCGAGATCATTGTTATTGTAATCCTCACCTTTACTGCAGTTTATTTTCCTTTTTCTTCACATGAGTTATAGTTGGGCTTTCCTGAAATTTGTATTCAGGATCATATTTTACCTAGTGACTACCCAGTAAGATCATATTCATGCGGAGAAAATGTAGCTGTGTCATCTAGGTGACTGAAACTGTAAAATAGCTGC-3'(SEQ ID NO.7)。此时，该SNP位点G处为XhoI酶切位点，加入XhoI酶切后，PCR产物变为5'-ACACTGACGACATGGTTCTACATTGGATTTGCCTATTTTACTTGTGTGTTACATC-3'(SEQ ID NO.8)与5'-TCGAGATCATTGTTATTGTAATCCTCACCTTTACTGCAGTTTATTTTCCTTTTTCTTCACATGAGTTATAGTTGGGCTTTCCTGAAATTTGTATTCAGGATCATATTTTACCTAGTGACTACCCAGTAAGATCATATTCATGCGGAGAAAATGTAGCTGTGTCATCTAGGTGACTGAAACTGTAAAATAGCTGC-3'(SEQ ID NO.9)，即55bp与194bp两个片段。

(2)抗病品种在此处SNP为A，则用这对引物扩增后其产物序列为：5'-ACACTGACGACATGGTTCTACATTGGATTTGCCTATTTTACTTGTGTGTTACATCTCGAAATCATTGTTATTGTAATCCTCACCTTTACTGCAGTTTATTTTCCTTTTTCTTCACATGAGTTATAGTTGGGCTTTCCTGAAATTTGTATTCAGGATCATATTTTACCTAGTGACTACCCAGTAAGATCATATTCATGCGGAGAAAATGTAGCTGTGTCATCTAGGTGACTGAAACTGTAAAATAGCTGC-3'(SEQ ID NO.10)，此时，该SNP位点A处不是XhoI酶切位点，在整个序列内其它处也没有XhoI酶切位点，因此加入XhoI酶切后，PCR产物无法被酶切开，仍为249bp。

实施例3、鉴定抗青枯病番茄品种或鉴定抗青枯病番茄品种的基因型的方法

鉴定抗青枯病番茄品种或鉴定抗青枯病番茄品种的基因型的方法包括如下步骤：(1)提取待测番茄样本的总DNA；(2)以该待测番茄的总DNA作为模板，利用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示引物对进行PCR扩增反应；PCR反应体系为总体积10μL，具体包括10X EasyTaq buffer 1.0μL，dNTP(10mM)0.2μL，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示引物各0.2μL(10mM)，DNA模板2μL(100-200ng/μL)，EasyTaq酶(5U/μL)0.1μL，ddH₂O 6.3μL。PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，72℃延伸5min，4℃保存10min。(3)对PCR扩增产物进行酶切、胶电泳检测；酶切体系：10μLPCR产物，0.2μL(10U/μL)的XhoI限制性内切酶，1.25ul的10X酶切buffer，1.05μL的ddH2O,上述各组分混匀，37℃酶切3个小时。胶电泳检测：酶切产物用3％琼脂糖在110V压条件下电泳30min，最终结果在凝胶成像系统上显示。(4)根据电泳结果判定待测番茄样本是否为抗青枯病番茄品种，具体是具有249bp大小带型的为抗病基因型番茄品种，具有194+55bp带型的为感病基因型番茄品种，三种带型均有的为杂合基因型番茄品种；其中抗病基因型和杂合基因型均是抗青枯病番茄品种。

实施例4、利用已知基因型材料验证该分子标记的准确性

已知的Bwr6纯合材料为GX-16，GX-22，GX-31，GX-39，GX-40，GX-53，勇士1号，TS-4，Hawaii7996；Bwr6杂合材料为浙砧7号；感病材料为AC。选择上述已知基因型的品种验证该分子标记的准确性，采用实施例2公开的方法进行验证，结果如附图2所示(泳道1-11为GX-16，GX-22，GX-31，GX-39，GX-40，GX-53，勇士1号，TS-4，Hawaii7996，浙砧7号，AC)，所有Bwr6纯合材料的带型全部为249bp，杂合材料为249+194+55bp带型，感病材料为194+55bp带型。也即，利用本发明的分子标记可以实现100％准确性鉴定番茄是否为抗青枯病品种以及其基因型。

实施例5、利用感病商品材料测试该分子标记的假阳性

购买88份感病商品品种，并采用实施例2公开的方法进行假阳性检测，结果如图3所示(泳道12为Bwr6纯合抗病对照TS-4)，88份商品种中未检测到含有Bwr6的材料存在，表明所述分子标记具有良好的特异性。

实施例6、与已报道的Bwr6分子标记比较

通过查阅文献，搜集到Bwr-6已报道的最新分子标记RsR6-5，将RsR6-5与我们开发的dCAPS分子标记做对比试验。试验材料从大果番茄(S.lycopersicum)和樱桃番茄(S.lycopersicumvarcerasiforme)中选取，总共选取23个材料作为对比材料，其中大果番茄3个，樱桃番茄20个。顺序为TOM-3号、TOM-6号、TOM-14号、TOM-16号、TOM-25号、TOM-28号、TOM-30号、TOM-52号、TOM-54号、TOM-63号、TOM-67号、TOM-81号、TOM-92号、A57、浙砧7号、Hawaii7996、TOM-1号、TOM-12号、TOM-23号、TOM-39号、TOM-49号、TOM-74号、TOM-56号。已知阳性对照为Hawaii7996，阴性对照A57，杂合为浙砧7号。参考文献报道的RsR6-5的反应体条件，以及标记的酶切条件。其中，RsR6-5引物序列(正向引物：5'-CTCAGAAACTGGATAAACTCGAAG-3'；反向引物：5'-AAAAATGGCTGGCTGCTTTCTCC-3')，使用的限制性核酸内切酶：HinfI。抗病条带为129+75bp，感病条带为204bp。本发明开发的dCAPS分子标记的反应条件见实施例3。

在RsR6-5的胶图4b结果中，抗病带型、感病带型和杂抗带型十分清楚而且稳定，但是TOM-1号、TOM-12号、TOM-23号、TOM-39号、TOM-49号、TOM-74号、TOM-56号(16、17、18、19、20、21、22、23泳道)结果和开发的Bwr6-specific-M标记跑胶结果有出入，如下表所示。

表1本发明开发的分子标记与RsR6-5的鉴定结果(R为纯合抗病，S为纯合感病，H为杂合)

通过田间接种鉴定分析上述差异情况，具体而言是选取已知基因型材料A57、浙砧7号、TS-4(Hawaii7996)作为对照，以及Bwr6-specific-M与RsR6-5的结果有出入的TOM-1号、TOM-12号、TOM-23号、TOM-39号、TOM-49号、TOM-74号、TOM-56号进行青枯病接种鉴定。取保存的青枯菌在培养基上划线，挑取青枯菌单菌落摇菌40h，培养菌液浓度约为OD600下Abs为0.4-0.5。3000r/min离心12分钟后去上清，使用灭菌水初步稀释溶解沉淀菌体并测定Abs，进一步稀释原始菌液至OD600 Abs为0.1，菌液浓度约为10⁸cfu/mL，接种浓度使用5x10⁷(约等0.05Abs)，伤根接种时使用无菌手术刀伤根接种，确保每株植物根系尽可能被伤，伤根程度相对均一。接种完成后将植株置于温室(温度＝30℃，相对湿度＝70％，光照时长＝16h/d)，接种14天后观察植株发病情况。发病0级，无症状；发病1级，1-2的叶片萎蔫；发病2级，3-5叶片萎蔫；发病3级，50％以上叶片萎蔫，植株未死；发病4级，叶片全部萎蔫，整株死亡。

对RsR6-5鉴定为抗病而我们的dCAPS分子标记Bwr6-specific-M鉴定为感病的品种进行青枯病接病鉴定，结果如图5与表2显示这些品种均为感病品种，这表明本发明开发的标记准确性优于RsR6-5，确认了本发明开发的Bwr6-specific-M标记的准确性。

表2接种14天后观察植株发病情况统计

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种番茄抗青枯病的分子标记及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequence)

<400> 1

aacaatacta ttggtcatat agaaaaggta aagtatccct attttctcac cttttaattt 60

catattttta tggtctatac aaaattaatg ccaggaaagg caacaattac tgtggcagtt 120

cctagtatga tagtatacaa aagaaaggaa agagggataa acgtatacat agcatcttca 180

gaatttgctg taaaatcatg caactccaag ctagctatcc attgcagttg atcttatata 240

actttggatt tatatgcagg cattgccaat gacatttcta cttaagcatt ttattgcacc 300

tagcattata agagttttat ttttgggact gactattcag aacacagcaa aagtcaagca 360

atcattcaga tattcttggt gactaaaagt tgttataaaa tagctgctaa tttgttagat 420

agagtaccca gttccacaaa cctaatagtt cctgataatg tgtttggatt tgcctatttt 480

acttgtgtgt tacatcatga aatcattgtt attgtaatcc tcacctttac tgcagtttat 540

tttccttttt cttcacatga gttatagttg ggctttcctg aaatttgtat tcaggatcat 600

attttaccta gtgactaccc agtaagatca tattcatgcg gagaaaatgt agctgtgtca 660

tctaggtgac tgaaactgta aaatagctgc ctgagaaaaa gacattttta tccaacttat 720

taattattca ttgaatttct tacattaggc tctaggacct gaaggttaca catcaggcat 780

attgaagaca tgtccaggta gaaaggtagg agagaactct atgggtgatt ataccaccat 840

tgagctaata ggcagggatc gtccaggcct tctatcagaa atttctgctg ttctagccaa 900

tcttcatttt aatgtcgctg ctgccgaggt ttggactcat aatgggcgca tagcatgtgt 960

cctttatatc aatgataatt gttcatccct tgatgaggat g 1001

<210> 2

<211> 1001

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequence)

<400> 2

aaaaaaatgt taacttaatt atttttttcc taatattgat aactactttt taaagaaaaa 60

gtttcacaaa caattttact taaaagatta actcattaaa aaaatgaaag aagaaaatac 120

cagatgaata gtatttgtaa ataaaataat atattgttat gagtatgaca taataatttt 180

ttttataaaa tattaatcat ctatataatg tttagaatct tgatttaatt aattaaatat 240

tagccgttaa ttttttcttt tgttatgagt tttcaattca agtaaaaact taagaaaatg 300

gagagggagt tggatccaaa aataaataaa taataaaaat ttacaatatt ttttttatat 360

gaagaaatcg gggtcttgaa gaagtataat gttttgattt ggttaaataa tgataaataa 420

tctaattaag gtgggttctt tatactacac ataataaatt tttaaaaaat aaaaaataaa 480

gagaaaattg ttaatttcaa taatataagt gagcgaaaaa gatgaataaa agaatttttt 540

agatcaaaag atgaactaag gataatattt ttgatatttt accttttttt taattataac 600

gttgttaaga tactcaaagg accaattata agaaaaccac ccaaaggttt catgaaaaga 660

ttgaaaaaac catcaaacaa cgcaatacaa ctgctcaact agaatcaaca taacaaaaaa 720

atatacttaa tgagatcatt tataacctaa attataaccc ctccgtgcac tttcatttat 780

catgttatat tttacgcaag tcaatttgat tcattttaaa agttaaatga gattatatta 840

atttaatatt ttaaataaaa ttttcagata tttaaaaatt atatgaaaag tatcatgaat 900

tgtagttttt ttttgcatat atgaaaaaat acattataaa tattagtcaa tttttttata 960

atttgactct aaatatgaaa aaaaatgaca attaaaaata g 1001

<210> 3

<211> 1001

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequence)

<400> 3

aagctattct attaatcttt aacaccctag ctgcccggcc ccttctcttt cctattccat 60

ttttgtaaaa gacctaggtt ctttttcact ttgctcaatt ttaattagtc ccttttttta 120

tttgtaaaaa tcaagaaaaa agtattttaa atttattata tccttaatta tttagagagt 180

taatattttt gaaaaaaagt aaaatctttt aatgagtaaa tttattttgt gattctatca 240

attaatatgg ataaaatgat aaatttatga tgtcaatttt tttaatatgc atgtcaaata 300

aaaatggaca agtataactt tttgaagttc taagagcagg ctataaattg agaaaaatac 360

gtactcgtac caaacatata tttactctca agtttgaaac aggtaattat ttaacctacg 420

ttggtttaaa taaaatatat ttcacttagt tactaaaata taaaaggggc aaatttacgt 480

tcatttgttt ggtgtaaaca aaagtccaac taaaaggtat atgggagtaa aattggacca 540

ctttgatcac cttatcttag aaactaaaat ggatgatatg agtgtattgt taattagata 600

tgcattttaa atatttgtaa aaaatttaaa aaaccaattt tttttaaaaa aatatgtttc 660

tttaaaataa aaaagataaa ttttcgtgaa agcagaaaaa ataaattctt acaaataaca 720

ttttatattg attgtatatc caaactatca cttcttctta accacaccta cataatccca 780

tccccaccac actaccctta taaccccacc ccatccccaa aaatagtgtt tgcctagata 840

tatacaaata tttggatgat agaggttcat tcaaataagt actatatatc ttatatatct 900

agtgatgtaa tttcattcca tgcgatattt aatcacatca tattcataat tcctttaaaa 960

ggggtaggca aacataagaa tcaagagtta aaattttcac g 1001

<210> 4

<211> 1001

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequence)

<400> 4

tagtatttcc tacgtagcat tccctgaaaa acaaaaaaaa attactcttc tggtgtgtaa 60

ttttatatat ataaatatat atctaaatgc taactgagaa gttgttattt gtgataaata 120

cacttcttgt ttcccctatt tctatcagct aattaaccaa gttgttgtgt acctttcttt 180

gtttatgctc aaatgcttgt atcatgcgtt agctaaatgg tgcctttttg gtaaaacaaa 240

tctcttggct gaatacttaa cacggagtat atgagacagt tatagtctta tagatggatt 300

ttttttgttg gatgaaggga aaaaatcaac caaaagtgca tcttagggtg tgtttggtgt 360

gaaaaaatca acaccccctc ccaacttcga catgggacct aactcctgac cccagacttt 420

tgatctcgac ttgagactca actacttgac tctacccaac tattgtgtta gattttcaca 480

cctaagagtc attcttcctt ctggtgaatg aacatagggc tgtttgaagt taaaatacct 540

tcagggacat ggtttgtgta aggaaagagt gagcacattg ctcattttgg tatatgggca 600

ttacgtatat agcaaaagtt tggagtgtgg atgaaaggca aataaaaaat ttggtatcgg 660

aagtatctaa atggtacatt cgacaaaagt gaaatgaaac atttctgtgt aattctcttc 720

tatagggcaa aacaaaaacc aaatctaagc caatccggag caggggatgg aaggtaaaat 780

aaataagttg aataaaagat cctgaattcg attttaccta aacagtaatt agacaacaat 840

gaacggttcg tttcttctat accaaacttt tagccagttc atgtttcgag tacacccgac 900

attagacttt atcctctaat ttctcgttta ctagagggac aaactccata ctttttctgg 960

gggtccgtgg tgttcgggga gtgcctggtg tttgttgtga g 1001

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequence)

<400> 5

acactgacga catggttcta cattggattt gcctatttta cttgtgtgtt acatctcga 59

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequence)

<400> 6

gcagctattt tacagtttca gtcacc 26

<210> 7

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequence)

<400> 7

acactgacga catggttcta cattggattt gcctatttta cttgtgtgtt acatctcgag 60

atcattgtta ttgtaatcct cacctttact gcagtttatt ttcctttttc ttcacatgag 120

ttatagttgg gctttcctga aatttgtatt caggatcata ttttacctag tgactaccca 180

gtaagatcat attcatgcgg agaaaatgta gctgtgtcat ctaggtgact gaaactgtaa 240

aatagctgc 249

<210> 8

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequence)

<400> 8

acactgacga catggttcta cattggattt gcctatttta cttgtgtgtt acatc 55

<210> 9

<211> 194

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequence)

<400> 9

tcgagatcat tgttattgta atcctcacct ttactgcagt ttattttcct ttttcttcac 60

atgagttata gttgggcttt cctgaaattt gtattcagga tcatatttta cctagtgact 120

acccagtaag atcatattca tgcggagaaa atgtagctgt gtcatctagg tgactgaaac 180

tgtaaaatag ctgc 194

<210> 10

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifical Sequence)

<400> 10

acactgacga catggttcta cattggattt gcctatttta cttgtgtgtt acatctcgaa 60

atcattgtta ttgtaatcct cacctttact gcagtttatt ttcctttttc ttcacatgag 120

ttatagttgg gctttcctga aatttgtatt caggatcata ttttacctag tgactaccca 180

gtaagatcat attcatgcgg agaaaatgta gctgtgtcat ctaggtgact gaaactgtaa 240

aatagctgc 249

Claims (2)

1.一种用于鉴定抗青枯病番茄品种基因型或鉴定抗青枯病番茄品种的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)提取待测番茄样本的总DNA；(2)以该待测番茄的总DNA作为模板，以序列如SEQ ID NO.1所示的SNP分子标记作为检查靶标，如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的特异性引物对进行PCR扩增反应；(3)对PCR扩增产物进行XhoI酶切、凝胶电泳检测；(4)根据电泳结果判定抗青枯病番茄品种的基因型或根据电泳结果判定待测番茄样本是否为抗青枯病番茄品种，结果判定标准为：具有249bp大小带型的为抗病基因型，具有194+55bp带型的为感病基因型，三种带型均有的为杂合基因型；其中抗病基因型和杂合基因型均是抗青枯病番茄品种。

2.用于鉴定抗青枯病番茄基因型或鉴定抗青枯病番茄品种的特异性引物对或包含该特异性引物对的试剂盒在筛选或鉴定抗青枯病番茄品种或鉴定抗青枯病番茄基因型或辅助番茄育种方面的应用，引物对序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

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