CN112522254A - 一种检测番茄青枯病抗性位点Bwr12的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测番茄青枯病抗性位点Bwr12的分子标记及应用，检测番茄青枯病的分子标记的引物对包括一个正向引物及两个反向引物，其中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；两个所述反向引物分别为第一反向引物及第二反向引物，所述第一反向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示。与现有的分子标记相比，本发明分子标记准确率高且检测成本低。

Description

一种检测番茄青枯病抗性位点Bwr12的分子标记及应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种检测番茄青枯病抗性位点Bwr12的分子标记及应用。

背景技术

番茄青枯病是番茄种植上最严重的病害之一，严重威胁热带及亚热带地区的番茄生产，也是番茄生产中最为常见、最具破坏力的细菌性土传病害之一，该病极易在高温多雨时期发生，其爆发猛烈，传播迅速，寄主广，病原变种多，防止难度极大，目前尚未有有效的农药能应对番茄青枯病。

番茄抗青枯病相关的QTLs目前仍处于基因定位阶段，尚未有基因克隆，育种工作中亦没有检测效果较好的分子标记可以利用。番茄抗青枯病基因目前已鉴定到两个主效位点，分别为Bwr12与Bwr6，解释率分别为17.9～56.1％与11.5～22.2％，分别定位于番茄第12号染色体2.81Mb～3.15Mb的区间和第6号染色体37.3Mb至39.3Mb的区间内。其中Bwr12呈现显性遗传规律，是抗青枯病番茄品种中主要利用的抗病位点。Bwr12目前报道了两个分子标记，Kim等报道了一个Bwr12主效位点的连锁标记KHU-1(Kim et al 2018)，但该标记为基于HRM的分子标记，该类标记主要基于荧光信号的检测，成本昂贵，KHU-1标记将一份公认的感病材料Ailsa Craig鉴定为抗病，表明其准确性上存在明显不足。另外一个公开在的Bwr12的分子标记RsR12-1(Alebel et al 2020)，在具体使用过程中发现其有假阳性存在。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种检测番茄青枯病抗性位点Bwr12的分子标记及应用。

具体技术方案如下：

一种检测番茄青枯病抗性的SCAR分子标记，其不同之处在于，所述检测番茄青枯病抗性的SCAR的分子标记的特异性片段序列如SEQ ID NO.1所示。

与现有技术相比，本发明SCAR分子标记检测番茄青枯病抗性方便快捷，准确性高。

一种检测番茄青枯病抗性的SCAR分子标记的引物对，其不同之处在于，所述检测番茄青枯病的分子标记的引物对包括一个正向引物及两个反向引物，其中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；两个所述反向引物分别为第一反向引物及第二反向引物，所述第一反向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：通过对番茄青枯病抗性基因型分析，设计出了多重PCR扩增体系，可方便、快捷检测番茄出是否携带Bwr12抗病基因。

一种检测番茄青枯病抗性的试剂盒，其不同之处在于，所述检测番茄青枯病抗性的试剂盒包括上述分子标记的引物对。

一种检测番茄青枯病抗性的方法，其不同之处在于，所述检测番茄青枯病抗性的方法包括：

步骤S1:以待测番茄为材料，提取样品DNA；

步骤S2:以所述样品DNA为模板，采用上述分子标记的引物对进行PCR反应，得到扩增产物；

步骤S3：判断所述扩增产物是否有特异性片段或包含所述特异性片段的基因片段，所述特异性片段的序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述步骤S2中，PCR扩增体系为：总体积20μL。10X Easy Taq buffer 2.0μL，dNTP(10mM)0.4μL，Bwr12-CG-F 0.4μL(10mM)，Bwr12-CG-R1 0.4μL(10mM)，Bwr12-CG-R20.4μL(10mM)，DNA模板2μL(100-200ng/μL)，Easy Taq酶(5U/μL)0.2μL，ddH₂O 14.2μL。

进一步，所述步骤S2中，PCR反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，72℃延伸5min，4℃保存10min。

进一步，所述步骤S3中，若扩增产物包括475bp大小的扩增带，则携带Bwr12抗病基因。

进一步，若扩增产物为550bp或315bp大小的扩增带，则不携带Bwr12。

进一步，番茄青枯病呈抗性的扩增产物带型包括：475bp大小纯合带型，475bp+550bp杂合带型或475bp+315bp杂合带型。

进一步，所述步骤S3中，采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

与现有技术相比，本发明检测番茄青枯病抗性的方法通过分子标记引物对扩增番茄DNA，对其扩增产物检测，检测出特异性扩增带，即为携带BWR12抗病基因，方便，快捷。

上述分子标记、检测上述分子标记的引物对、含分子标记的试剂盒或上述方法在鉴定番茄青枯病抗性或选育抗性青枯病番茄上的应用。

上述分子标记、检测上述分子标记的引物对、含分子标记的试剂盒或上述方法在检测Bwr12基因的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：对Bwr12基因的检测更为准确。

进一步，检测上述分子标记的引物对、含分子标记的试剂盒或上述方法上述分子标记、检测上述分子标记的引物对、含分子标记的试剂盒或上述方法在检测Solyc12g009770基因型上的应用。

申请人研究团队，在研究番茄青枯病抗性时，发现青枯病抗性番茄品种与青枯病非抗性番茄品种的Solyc12g009770基因的表达差异，进一步针对抗病与感病材料在该基因内的序列变异设计出分子标记，通过判断出Solyc12g009770基因的基因型，确认番茄对青枯病的抗性。

进一步，若Solyc12g009770基因如SEQ ID NO.5所示时，番茄对青枯病呈抗性。

附图说明

图1为实施例1中自然群体中的进化树分析结果；

图2为实施例1中关联分析结果；

图3为实施例1中Solyc12g009770的表达量分析结果；

图4为实施例1中qPCR实证结果；

图5为实施例1中分子标记Bwr12-CG引物序列设计的示意图；

图6为实施例1分子标记Bwr12-CG初步测试结果；

图7为实施例2中分子标记Bwr12-CG检测结果图；

图8为实施例3中本发明分子标记Bwr12-CG的检测结果图；

图9为实施例3中分子标记RsR12-1测试结果图；

图10为阳性对照接病种植图；

图11为阴性对照接病种植图；

图12为TM-15接病种植图；

图13为TM-17接病种植图；

图14为TM-28接病种植图；

图15为TM-30接病种植图；

图16为TM-50接病种植图；

图17为TM-86接病种植图；

图18为TM-94接病种植图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

1.1全基因组关联分析确定初步候选抗病关联基因

Bwr12位点抗病基因的关联群体构成:

1)抗病类群

由26份已知携带Bwr12的品种；

已发表的(Zhu et al 2018)自然群体中携带Bwr12的品系。

2)感病类群

已发表的(Zhu et al 2018)自然群体中不携带Bwr12的品系。

通过在Bwr12区间内对自然群体构建进化树来区别具体品系是否携带Bwr12。进化树分析结果表明，与TS-4(即Hawaii7998，种质来源美国Davis大学番茄种质资源中心，TGRC)在Bwr12区间内的亲缘关系最近的材料为HG64(华中农业大学培育抗青枯病杂交品种华番12号的抗病亲本)(见附图1)，这个材料为一个已知的抗性亲本，而自然群体内的其它品系均未能与TS-4聚到一类中去，说明自然群体中的其它品系均不携带Bwr12。

对26份已知携带Bwr12的品种进行重测序获取基因型，与自然群体一起进行关联分析(见附图2)。结果显示，最显著的关联信号正位于Bwr12区间内，与此同时，在最高关联信号的下游22kp处存在一个LRR-RLP基因簇(表1)，在植物研究中，多数已报道的抗病基因为LRR-RLP基因。

表1最高关联信号上下游10Kb内的基因

表1中，solyc12g009690,solyc12g009720,solyc12g009730,solyc12g009740,solyc12g009743,solyc12g009745,solyc12g009780均属于LRR-RLP基因簇。

1.2候选基因的锁定

基于1.1的结果，与Bwr12关联的抗病基因最有可能位于上述基因簇中，因此我们通过转录组分析近一步了解该基因簇中具体基因与抗病的关联性：用于转录组差异表达分析的数据来自于利用抗病材料Hawaii7996与感病材料Wv70构建的青枯菌诱导表达谱(French et al 2018)，为了尽可能挖掘出潜在的候选基因，本研究不再以原文中采用的log₂FPKM这种较严苛的标准判断差异表达，而直接以FPKM值衡量差异表达并辅以qPCR实证。

1.2.1表达量分析

将原文中Hawaii7996与Wv700接病后0h、24h、48h的RNA-seq数据下载后用软件STAR比对，用软件Stringtie计算出FPKM值，按照规则：

1)差异表达基因位于Bwr12区间内；

2)接病后三个时间点Hawaii7996的FPKM值显著上升；

3)接病后三个时间点Hawaii7996的FPKM值均是显著大于Wv700的。根据如上规则，鉴定到了一个LRR-RLP基因Solyc12g009770符合上述规则(具体见附图3)。

1.2.2辅以qPCR实证锁定基因

进一步对该基因在抗感材料间的差异表达进行了qPCR的验证，使用青枯病的室内伤根灌注法对Hawaii7996(种质为华南农大汪国平教授提供，青枯病纯合抗病种质)、HG64(青枯病纯合抗病种质)、HG70(华中农业大学培育抗青枯病杂交品种华番12号的感病亲本)、HG6×HG70(两者杂交后品种，青枯病杂合抗病种质)及AC(即Ailsa Craig，种质来源TGRC，青枯病感病种质)进行接病，每份材料65株。15株作为空白处理，即伤根后灌注清水；剩下50株均接病，每隔24小时取10株接病处理植株的根系及3株mock处理植株的根系，用清水立即清洗干净，液氮冻存，持续5天(0h,24h,48h,72h,96h)。采用TRIzol抽提法提取上述所有冻存样本的总RNA，然后进行DNA的去除及cDNA的反转录。在进行qPCR之前，为了确保qPCR引物的特异性，以cDNA序列为模板设计的qPCR引物先在HG70与HG64的cDNA中进行普通PCR，对PCR产物进行一代测序验证，以一代测序的峰图中双峰情况来判断qPCR引物的特异性。以番茄β-actin基因作为内参，每份样品3次生物学重复，进行qPCR，结果使用2^-ΔΔCT法进行分析，将AC在24h的表达量定义为1即设为相对表达量的参照(具体见图4)，结果表明与感病品种相比，Solyc12g009770在抗病品种响应青枯菌侵染的过程中存在明显的上调表达，最终确定Solyc12g009770为Bwr12抗性的关联基因。

1.3基于抗病与感病材料在Solyc12g009770上的序列变异设计分子标记

在抗病材料Hawaii7996、HG64及感病材料AC、普罗旺斯(简称PLWS，购于武昌大东门种子交易市场)及Wv700(种质来源为TGRC)中对候选基因进行PCR扩增、测序以获取基因全长进而进行比对分析。结果表明抗病材料Hawaii7996与HG64序列一致，感病材料AC、HG70及Wv700的序列一致，PLWS的基因序列与上两种序列均不同。

将三种序列比较分析，在基因的起始位置处选取了一段序列作为通用正向引物，同时将两处变异位点处的序列(见附图5)设计为反向引物，三条引物共同构成一个SCAR标记(命名为Bwr12-CG)，使得携带Bwr12材料预期可扩增出475bp条带，而感病材料则预期扩增出550bp或315bp条带。

Bwr12-CG-F(正向引物如SEQ ID NO.2所示)序列为：

5-ATGTCCTGTAATTATTTCTGTGATGG-3；

Bwr12-CG-R1(第一条反向引物序列如SEQ ID NO.3所示)序列为：

5-TTGAAAAAGGAGGAAAGTAATCGTTATA-3；

Bwr12-CG-R2(第二条反向引物序列如SEQ ID NO.4所示)序列为：

5-AAGTTGTAAATCATAGTCATAAGAAGAAGA-3。

将上述引物按如下PCR反应体系、程序方法，在已知基因型的材料中进行初步测试：

PCR反应体系：总体积20μL。10X Easy Taq buffer 2.0μL，dNTP(10mM)0.4μL，Bwr12-CG-F 0.4μL(10mM)，Bwr12-CG-R1 0.4μL(10mM)，Bwr12-CG-R2 0.4μL(10mM)DNA模板2μL(100-200ng/μL)，Easy Taq酶(5U/μL)0.2μL，ddH₂O 14.2μL。

PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，72℃延伸5min，4℃保存10min。

凝胶电泳检测：酶切产物用2.5％琼脂糖在110V压条件下电泳30min，最终结果在凝胶成像系统上显示。

基因型的判断：具有475bp大小带型的为抗病基因型，具有550bp或315bp带型的为感病基因型，475bp+550bp或315bp的带型为杂合基因型，已知基因型材料(Bwr12代表抗病基因，bwr12代表感病基因):

Hawaii7996(Bwr12/Bwr12，纯合抗病)、DF349(bwr12/bwr12，感病)，AC(bwr12/bwr12，感病)，PLWS(bwr12/bwr12)，华番12(Bwr12/bwr12，杂合抗病)，HG35(bwr12/bwr12)，MT(bwr12/bwr12),钻红8号(Bwr12/bwr12)，HG70(bwr12/bwr12)，齐达利(bwr12/bwr12)及Heinz1706(bwr12/bwr12)。

测试结果见图6，其中，泳道1为marker，2-12依次为Hawaii7996，DF349，AC，PLWS，华番12，HG35，MT,钻红8号，HG70，齐达利，Heinz1706。

凝胶电泳检测：PCR产物用2.5％琼脂糖在110V压条件下电泳30min，最终结果在凝胶成像系统上显示。

结果显示(图6)：设计的SCAR标记Bwr12-CG在11份材料中均扩增出了与基因型吻合的预期带型。

实施例2

利用抗青枯病商业品种测试分子标记

将Bwr12-CG在18份抗青枯商业杂交种和普通感病杂交种中进行验证。

结果表明番茄抗青枯病品种鸿星和浙砧1号为Bwr12杂合基因型，其它品种均不携带Bwr12。这说明Bwr12-CG可以作为Bwr12的分子标记使用，具体结果见图7，具体对应顺序为：泳道1为marker，2-19依次为大田毛粉802，京番108，凯撒，欧盾，粉宴一号，106-209，欧倍，SV1366TH，欧丽，PT5023，RT1702，PLWS，浙砧1号(抗青枯商品种)，702，航研8号，鸿星(抗青枯商品种)，红番9号，京番103。

实施例3

Bwr12-CG与已公开分子标记RsR12-1的对比：

通过查阅文献，搜集Bwr-12已开发的标记。通过分析，选出RsR12-1标记Development of diagnostic molecular markers for marker-assisted breedingagainst bacterial wilt in tomato Alebel Mekuriaw

Jinwoo

Youngjun Kim¹,Chang-Sik Oh²,Inhwa Yeam³,Ill-Sup Nou⁴ and Je Min Lee^*1)来和Bwr12-CG做对比试验。试验材料从大果番茄(S.lycopersicum)和樱桃番茄(S.lycopersicum var.cerasiforme)中选取，总共选取23个材料作为对比材料，其中大果番茄3个，樱桃番茄20个。顺序为TM-3、TM-6、TM-13、TM-22、TM-33、TM-38、TM-46、TM-56、TM-65、TM-72、TM-77、TM-82、TM-88、Ailsa Craig、浙砧7号、TS-4、TM-15、TM-17、TM-28、TM-30、TM-50、TM-86、TM-94。已知阳性对照为TS-4，浙砧7号(纯合抗病)；阴性对照Ailsa Craig。

通过查阅文献，获取RsR12-1的PCR反应体系和条件，以及标记的酶切条件。RsR12-1引物序列(正向引物：GTTACACGAACAAGCTTAAATTTCTAGATTTATCCC；反向引物：GACAGGTCCTTCGAATTGATTAC)，使用的限制性核酸内切酶：AciI。抗病条带为168+35bp，感病条带为203bp。

本发明开发的Bwr12反应条件见技术方案描述。

结果见图8、图9，图8为Bwr12-CG的鉴定结果；图9为RsR12-1的鉴定结果；泳道1-13分别为TM-3、TM-6、TM-13、TM-22、TM-33、TM-38、TM-46、TM-56、TM-65、TM-72、TM-77、TM-82、TM-88；泳道14为阴性对照Ailsa Craig；泳道15-16分别为抗青枯阳性对照浙砧7号和TS-4；泳道17-23分别为TM-15、TM-17、TM-28、TM-30、TM-50、TM-86、TM-94。

在RsR12-1结果中，抗病带型、感病带型和杂抗带型十分清楚而且稳定，但是浙砧7号、TM-15、TM-17、TM-28、TM-30、TM-50、TM-86、TM-94(15、17、18、19、20、21、22、23泳道)结果和开发的Bwr12-CG标记基因型鉴定结果不同(结果见下表)。

表4 Bwr12-CG与RsR12-1基因型鉴定结果

对Bwr12-CG与RsR12-1基因型矛盾的品系进行接病鉴定：

选取已知感病品系Ailsa Craig为阴性对照、已知抗病品系浙砧7号、TS-4作为阳性对照两个标记基因型矛盾的品系TM-15、TM-17、TM-28、TM-30、TM-50、TM-86、TM-94(上述品种Bwr12-CG鉴定为感病基因型，RsR12-1鉴定为抗病基因型)，进行接病鉴定。挑取青枯菌单菌落摇菌40h，培养菌液浓度约为OD₆₀₀下Abs为0.4-0.5。3000r/min离心12分钟后去上清，使用灭菌水初步稀释溶解沉淀菌体并测定Abs，进一步稀释原始菌液至OD₆₀₀ Abs为0.1，菌液浓度约为10⁸cfu/mL，接种浓度使用5×10⁷(约等0.05Abs)，伤根接种时使用无菌手术刀伤根接种，确保每株植物根系尽可能被伤，伤根程度相对均一。接种完成后将植株置于温室(温度＝30℃，相对湿度＝70％，光照时长＝16h/d)，接种14天后观察植株发病情况。发病0级，无症状；发病1级，0-25％的叶片有轻微萎蔫状况；发病2级，25％-50％叶片萎蔫；发病3级，50％-100％叶片萎蔫，植株未死；发病4级，叶片全部萎蔫，整株死亡。结果见下表，TM-15、TM-17、TM-28、TM-30、TM-50、TM-86、TM-94与抗病对照相比，高度感病(病情指数均在50％以上，表明其不携带Bwr12基因)确认了本发明开发的Bwr12-CG标记的准确性。

表5 RsR12-1与Bwr12-CG基因型矛盾材料的接病鉴定结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种检测番茄青枯病抗性位点Bwr12的分子标记及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 475

<212> DNA

<213> 番茄(Tomato)

<400> 1

atgtcctgta attatttctg tgatggaact tgtttcccaa aaacaaagtc ttggaatgag 60

agtagggatt gctgcagttg ggatggagtc acttgtgact tgttaaacgg tcatgttatc 120

ggtttagacc ttagttgcag tcagattgtt ggcacttttc atcccaatag cagcctcttc 180

caacttcatc atctccaaac actaaacctt gcttacaatg actttgatgg gaaaatccca 240

acggaaatat catacctttc caatttggtt tcacttgatc tttctaatag ttatcataga 300

ttacaacttg atgagagaac atttgaaaca atgcttcaca acttgacaaa tcttgagtta 360

ctagctctct ctcttggcaa catctcatca cccattcatc ccaatagcag cctcttccag 420

cttcatcatc tccacacact aaacctttat aacgattact ttcctccttt ttcaa 475

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtcctgta attatttctg tgatgg 26

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgaaaaagg aggaaagtaa tcgttata 28

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagttgtaaa tcatagtcat aagaagaaga 30

<210> 5

<211> 3570

<212> DNA

<213> 番茄(Tomato)

<400> 5

atgtcctgta attatttctg tgatggaact tgtttcccaa aaacaaagtc ttggaatgag 60

agtagggatt gctgcagttg ggatggagtc acttgtgact tgttaaacgg tcatgttatc 120

ggtttagacc ttagttgcag tcagattgtt ggcacttttc atcccaatag cagcctcttc 180

caacttcatc atctccaaac actaaacctt gcttacaatg actttgatgg gaaaatccca 240

acggaaatat catacctttc caatttggtt tcacttgatc tttctaatag ttatcataga 300

ttacaacttg atgagagaac atttgaaaca atgcttcaca acttgacaaa tcttgagtta 360

ctagctctct ctcttggcaa catctcatca cccattcatc ccaatagcag cctcttccag 420

cttcatcatc tccacacact aaacctttat aacgattact ttcctccttt ttcaatccca 480

aatggcattg gccgattgag gaatttgagg catctgatac tccttggctt tgatggaaaa 540

atcccaacag aaatatcata cctttccaat ttggtttcac ttgatctttc taatagttat 600

gcattagaac ttgatgagag aacatttgaa acaatgcttc aaaactttac aaatcttgag 660

ttactagctc tccctcttgg cagcatctca tcacccattc atcccaatag cagcctcttc 720

cagcttcatc atctccacac actaaacctt gcttgcaatt actttcatcc tttttcaatc 780

ccaaatggca ttggccgatt gacgaatttg aggcatctga tactctctga ctttgatgga 840

caaatcccaa cagaaatctc atacctttcc aatttggttt cacttgatct ctctggttat 900

gatttacaac ttgatgagag aacatttgaa acaatgcttc acaacttgac aaatcttgag 960

ttactagctc tctctcttgg caacatctca tcacccattc atcccaatag cagcctcttc 1020

cagcttcatc atctccacac actaaacctt gcttgcaatt actttcctcc tttttcaatc 1080

ccaaatggca ttggccgatt gacgaatttg aggcatctga tactctctga ctttgatgga 1140

caaatcccaa cagaaatctc atacctttcc aatttggttt cacttgatct ttcttatagt 1200

tatgcattaa aacttgatga gagaacattt gaaacaatgc ttcacaactt gacaaatctg 1260

gagctacttt ctctctctga cgtcgacatc tcatctccga tacctctcaa tatttcttct 1320

tctttaaggc acttggatct tgataatact aatctgcgag gtgttctcac agagagcttt 1380

ttccttgttc caaacagctt ggaaacgctc aaattgagtg ggaatgatct tctcaaagga 1440

gtatttccaa aggtacaccg gagcaacact ctgttaatgg agttggatat ttcatacaca 1500

ggcatctctg gtgagctgcc agattcaatt ggcaacttca gttccttgaa tatcttgaac 1560

ctctatggat gtcaattctc tggttccatt cctgattcca taggcaacct aacactaatt 1620

acaaagttat atttatctaa taatcatttc actggcaata ttcctgatgt tttctctaac 1680

ctccaagatc tatattattt agagctttct aaaaacagct tcatcggttt gtttcccgtt 1740

tcaattttaa gtttgacatg tcttaaatat ttacacatgt cgaataattc cctatctggc 1800

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caagaactac atttaagcaa taatcaactc agtggttctt ttcctcaatc acttgtgaat 2040

ctcacaaacc ttgtaaccct tggaatttca tcaaataaca tcaccattga tgagggaatg 2100

aatatcacct ttcttagcct atcatcctta ttcttatcat cttgtcaact gaagcatttt 2160

ccacacttct tgagaaatgt aaacacactt gtgtacttgg atatttctaa caatcagatt 2220

tctggtcaaa tccctaactg gtttagcggc atgaggtgga actcgttgca gttcctaaac 2280

ctttctcata attcattaac aggccaccta ccacagtttc attactatag tctagagtat 2340

cttgatctga aatttaactc ccttcagggt ccactacctt catccatttg taacatgagc 2400

aaacttatct tattagattt atcacataac tacttcagtg attctgttcc acattgcttg 2460

ggaagcttgg atttactagc ggcgctggac ttaagaagga acaatctcac agggaatctt 2520

cctccattat gtgcacagag cacttcattg agtaccattg tcgtaaatgg taatcgattt 2580

gaaggacctg ttcctgtgtc attgctcaag tgtaatggtc tagaagtcct tgatgtgggg 2640

aacaatgcta taaatgacac atttccagct tggctcggaa ttcttcaaga gctgcaggtc 2700

cttatattaa agtcgaacaa gttccatgga cctataagta tgtgtcagac tgagttttgc 2760

tttcccaagt tgcgaatttt tgatctttct cgtaatgatt tcagtggctc acttcctgca 2820

aaagtttttg gaaacttcaa ggcaatgatc aaattagatg gtgaagacag aggaaatatc 2880

aagtacatga catctctgtt gaattcgcca tttgtcacat cgtatgagaa ttcagtgagt 2940

ttggtgatca aaggcaatga tattgagcta gaaagaatca gcacaattat gacaacgata 3000

gatctctcaa gcaaccattt tgaaggtgtc attccgaaat cactaaagga tctcagctca 3060

cttcggttac tcaatttatc ccgtaacaat ctcaaaggtg atattccaat cgaattggga 3120

caattgaatg tgcttgaagc aatggatctc tcctggaatc ggctcactgg aaagattcca 3180

caggaattga caagactgaa ctttctggcc atcttaaacc tctctcaaaa tcatctcatg 3240

ggaccaattc ctcaaggtcg acagttcaac acatttgaaa atgactcata tggtggcaac 3300

cttgatttat gcggtgttcc tttaactaac aaatgtggaa cgagtgattc atcgcatgtt 3360

cctcaaccag aagataaaga cgagtcatat tttttcagtg gatttacttg ggaatcagta 3420

gtcataggct acagttttgg actagttgtt ggaacagtca tgtggagtct catgtttaaa 3480

tatcgcaagc caaaatggtt tgtggaattt tttgatggac tgatgcctca caaaagaaga 3540

aggccgaaaa agagagctca gagacgatga 3570

Claims (9)

1.一种检测番茄青枯病抗性的SCAR分子标记，其特征在于，所述检测番茄青枯病抗性的SCAR的分子标记的特异性片段序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种检测权利要求1所述的番茄青枯病抗性的SCAR分子标记的引物对，其特征在于，所述检测番茄青枯病的分子标记的引物对包括一个正向引物及两个反向引物，其中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；两个所述反向引物分别为第一反向引物及第二反向引物，所述第一反向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二反向引物的序列如SEQ IDNO.4所示。

3.一种检测番茄青枯病抗性的试剂盒，其特征在于，所述检测番茄青枯病抗性的试剂盒包括权利要求1所述的分子标记的引物对。

4.一种检测番茄青枯病抗性的方法，其特征在于，所述检测番茄青枯病抗性的方法包括：

步骤S1:以待测番茄为材料，提取样品DNA；

步骤S2:以所述样品DNA为模板，采用权利要求2所述的分子标记的引物对进行PCR反应，得到扩增产物；

步骤S3：判断所述扩增产物是否有特异性片段或包含所述特异性片段的基因片段，所述特异性片段的序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述的检测番茄青枯病抗性的方法，其特征在于，所述步骤S3中，若扩增产物包括475bp大小的扩增带，则携带Bwr12抗病基因。

6.根据权利要求4或5所述的检测番茄青枯病抗性的方法，其特征在于，若扩增产物为550bp或315bp大小的扩增带，则不携带Bwr12。

7.根据权利要求4所述的检测番茄青枯病抗性的方法，其特征在于，所述步骤S3中，采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

8.权利要求1所述的分子标记、权利要求2所述的分子标记的引物对、权利要求3所述的试剂盒或权利要求4～7任一项所述的方法在鉴定番茄青枯病抗性或选育抗性青枯病番茄上的应用。

9.权利要求1所述的分子标记、权利要求2所述的分子标记的引物对、权利要求3所述的试剂盒或权利要求4～7任一项所述的方法在检测Solyc12g009770基因型上的应用。

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