CN114686609B - 一种番茄青枯病菌鉴定的特异性引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种番茄青枯病菌鉴定的特异性引物及其应用。本发明提供了一种用于鉴定或辅助鉴定青枯菌的引物对，由引物epsD‑F和引物epsD‑R组成；所述引物epsD‑F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物epsD‑R的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。利用本发明所提供的引物对进行荧光定量PCR检测青枯菌，该方法快速、特异性强、灵敏度高等优点，为番茄青枯病早期诊断和防治提供理论基础，对保障番茄产业稳产持续发展具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种番茄青枯病菌鉴定的特异性引物及其应用。
背景技术
茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)又称青枯菌，由它所引起的植物细菌性青枯病是一种典型的土传性病害，在不同地区、不同温湿度条件、不同种植模式下，都可发病。发病条件不同，危害程度不同。田块间连作地、地势低洼、排水不良、土质偏酸的田块发病较重，在中国南方各地都有发生。青枯病菌一般从番茄根部或茎基部的伤口侵入，在植株体内的维管束组织中扩散，然后增殖至地上部，产生大量的胞外多糖堵塞维管束系统，使维管束功能被破坏，水分运输被阻断，植物出现萎蔫症状，直至死亡。番茄青枯病株的外部特征表现为阶段性萎蔫，叶片由绿转黄脱落，植株坏死腐烂，且茎部生出不定根。剖开病株地下组织，可观察到根部软化变褐，并发散臭味；轻压病株茎部切口可观察到乳白色菌脓溢出。青枯病发病急，蔓延快，发生严重时会引起植株成片死亡，造成严重减产，甚至绝收，给农户造成了严重的经济损失。番茄青枯病一旦爆发，防治非常困难。宜在早期检测出病害的发生，通过药剂防治，微生物防治等方法有效预防青枯病的大面积爆发。
细菌病原菌的检测方法主要分为：指示植物检测方法，平板划线分离方法，平板涂布分离方法，血清学方法，分子检测方法。传统的病原菌检测方法单一，耗时耗力，实时荧光定量PCR技术弥补这一不足。传统的细菌病原分离鉴定方法难以对土壤青枯病菌进行快速有效的检测，实时荧光定量PCR技术的出现解决了这个难题。通过设计特异性引物，利用实时荧光定量PCR技术对青枯菌进行菌量的检测。
青枯菌在营养丰富的环境，能合成胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)分泌到细胞壁外，有的胞外多糖分泌到胞外后依附于微生物细胞壁形成荚膜，称为荚膜多糖；有的胞外多糖分泌到胞外后进入培养基形成粘液，称为粘液多糖。胞外多糖，被广泛认为是青枯菌重要的致病因子。常见的产胞外多糖的细菌有乳酸菌、芽孢杆菌、假单胞菌、根瘤菌、醋酸杆菌、动胶菌、乳球菌、乳杆菌、链球菌、鞘氨醇杆菌等。胞外多糖(EPS)是青枯菌通过释放多种毒性因子侵害植株的复杂调控机制的其中之一。根据目前的研究，EPS的功能主要表现在以下4个方面：(1)胞外多糖以粘液状存在于菌体周围，能够帮助青枯菌扩散繁殖，协助其在寄主植物根部定殖，促进萎蔫症状的产生；(2)青枯菌在导管中生长时产生的大量胞外多糖会阻塞维管束系统，特别是叶柄结和小叶处孔径较小的导管穿孔板，导致植株运输系统的功能障碍，水分和养料无法流到枝叶上，从而引起植株萎蔫；(3)青枯菌产生的胞外多糖可以避免或降低植物对细菌的识别，可能在植物的自我防御系统中具有重要作用；(4)EPS可促进细菌对周围环境水分与养分的吸收。
青枯菌胞外多糖合成途径的许多蛋白质是由eps操纵子编码的，由调控基因和合成基因组成，它们在基因组上位点互不相邻，调控基因为合成基因的反式调控因子。目前，在青枯雷尔氏菌中成簇存在7个与胞外多糖合成相关的结构基因，分别是：epsA、epsP、epsB、epsC、epsD、epsE和epsF。目前尚未有以epsD编码基因为靶标特异性鉴定青枯菌的相关报道。
发明内容
本发明的目的是通过以epsD编码基因为靶标，设计并验证特异性引物，从而提供一种青枯菌检测的方法，对于青枯病的预防具有一定的应用价值。
第一方面，本发明要求保护一种用于鉴定或辅助鉴定青枯菌的引物对。
本发明要求保护的用于鉴定或辅助鉴定青枯菌的引物对，由引物epsD-F和引物epsD-R组成；所述引物epsD-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物epsD-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
第二方面，本发明要求保护用于鉴定或辅助鉴定青枯菌的试剂或试剂盒。
本发明要求保护的用于鉴定或辅助鉴定青枯菌的试剂或试剂盒，包括前文第一方面中所述引物对。
所述试剂或试剂盒中还可含有除所述引物对外的其他试剂，如PCR反应缓冲液、DNA聚合酶等。
第三方面，本发明要求保护如下任一方法：
方法I：前文第一方面中所述引物对的制备方法，可包括将所述引物epsD-F和所述引物epsD-R分别单独包装的步骤；
方法II：前文第二方面中所述试剂或试剂盒的制备方法，可包括将所述引物epsD-F和所述引物epsD-R分别单独包装的步骤。
第四方面，本发明要求保护如下任一应用：
P1、前文第一方面中所述引物对或前文第二方面中所述试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定青枯菌中的应用；
P2、前文第一方面中所述引物对在制备用于鉴定或辅助鉴定青枯菌的产品中的应用；
P3、前文第一方面中所述引物对或前文第二方面中所述试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测菌是否为青枯菌中的应用；
P4、前文第一方面中所述引物对在制备用于鉴定或辅助鉴定待测菌是否为青枯菌的产品中的应用；
P5、前文第一方面中所述引物对或前文第二方面中所述试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测生物样品中是否含有青枯菌中的应用；
P6、前文第一方面中所述引物对在制备用于鉴定或辅助鉴定待测生物样品中是否含有青枯菌的产品中的应用；
P7、前文第一方面中所述引物对或前文第二方面中所述试剂或试剂盒在检测待测生物样品中青枯菌含量中的应用；
P8、前文第一方面中所述引物对在制备用于检测待测生物样品中青枯菌含量的产品中的应用。
第五方面，本发明要求保护一种鉴定或辅助鉴定青枯菌的方法。
本发明要求保护的鉴定或辅助鉴定青枯菌的方法，可包括如下步骤：以待测生物样品的基因组DNA为模板，用前文第一方面中所述引物对进行PCR扩增得到扩增产物，检测所述扩增产物的大小，如果所述扩增产物含有(或为)100-250bp的DNA片段，则所述待测生物样品为或候选为青枯菌或者含有或候选含有青枯菌；如果所述扩增产物不含有(或不为)100-250bp的DNA片段，则所述待测生物样品不为或候选不为青枯菌或者不含有或候选不含有青枯菌。
其中，所述100-250bp的DNA片段具体为192bp的DNA片段。
进一步地，所述192bp的DNA片段的核苷酸序列具体如SEQ ID No.3所示。
第六方面，本发明要求保护一种鉴定或辅助鉴定青枯菌的方法。
本发明要求保护的鉴定或辅助鉴定青枯菌的方法，可包括如下步骤：以待测生物样品的基因组DNA为模板，用前文第一方面中所述引物对进行荧光定量PCR，得到所述待测生物样品的Ct值，如果Ct值≤33，则所述待测生物样品为或候选为青枯菌或者含有或候选含有青枯菌；如果Ct值＞33，则所述待测生物样品不为或候选不为青枯菌或者不含有或候选不含有青枯菌。
第七方面，本发明要求保护一种检测待测生物样本中青枯菌含量的方法。
本发明要求保护的检测待测生物样本中青枯菌含量的方法，可包括如下步骤：基于前文第一方面中所述引物对，将青枯菌菌悬液浓度梯度稀释后进行荧光定量PCR，得到青枯菌菌液浓度与Ct值之间的标准曲线；然后以待测生物样品的基因组DNA为模板，用前文第一方面中所述引物对进行荧光定量PCR(与制作标准曲线时的条件相比差别仅在于模板不同)，得到所述待测生物样品的Ct值，然后将所述待测生物样品的Ct值代入所述标准曲线，计算得到所述待测生物样本中青枯菌含量。
第八方面，本发明要求保护SEQ ID No.3所示DNA分子。
第九方面，本发明要求保护SEQ ID No.3所示DNA分子在鉴定或辅助鉴定青枯菌或制备用于鉴定或辅助鉴定青枯菌的产品中的应用。
第十方面，本发明要求保护一种对植物进行青枯病防治的方法。
本发明要求保护的对植物进行青枯病防治的方法，可包括如下步骤：采用前文第七方面中所述方法监测植物根际土壤中青枯菌的含量，选择在植物根际土壤中青枯菌含量低于106cfu/g时进行青枯病防治。
在本发明的具体实施方式中，进行所述荧光定量PCR时优选采用SPINeasy DNAKit for soil试剂盒进行分DNA提取，如从番茄根际土壤样本中提取DNA。
在本发明的具体实施方式中，进行所述荧光定量PCR时优选采用QuantStudio6Flex实时荧光PCR仪和Universal qPCR Master Mix试剂进行。
在本发明的具体实施方式中，进行所述荧光定量PCR时反应体系优选包括：模板DNA 4.0μL，Universal qPCR master Mix(2X)10.0μL、10μM的引物epsD-F 1.0μL、10μM的引物epsD-R 1.0μL和双蒸水4.0μL。
在本发明的具体实施方式中，进行所述荧光定量PCR时的扩增程序优选为：第一步95℃预变性3min；第二步95℃变性15s，68℃退火45s，72℃延伸30s，40个循环。
在本发明的具体实施方式中，所述植物为番茄。所述待测生物样品为从植物(番茄)根际土壤中提取的DNA样本。
在本发明的具体实施方式中，所述青枯菌具体选自如下任一：青枯菌P380、青枯菌GMI1000、青枯菌P441。
本发明通过青枯菌与乳酸菌、芽孢杆菌、假单胞菌等产胞外多糖菌的epsD基因序列的属间比对结果，以及青枯菌胞外多糖epsD基因序列的属内比对结果，从而得出epsD基因不同属间具有特异性、同一属内高度保守，进而针对胞外多糖epsD基因设计引物对epsD-F/eps-R。利用基于epsD特异性引物的荧光定量PCR鉴定方法鉴定青枯菌，结果显示该方法快速、特异性强、灵敏度高等优点，为番茄青枯病早期诊断和防治提供理论基础，对保障番茄产业稳产持续发展具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1中青枯菌引物epsD基因的选定。A为青枯菌P380与20种产胞外多糖菌不同属间epsD基因序列的比对图。B为青枯菌P380与13种青枯菌同一属内epsD基因序列的比对图。
图2为实施例2中青枯菌epsD基因引物的设计和验证。A为上游引物epsD-F的基因保守序列。B为下游引物eps-R的基因保守序列。C中，泳道1、2、3模板分别为青枯菌P380、青枯菌GMI1000、青枯菌P441菌株的DNA；泳道4模板为阴性对照无菌水；泳道5模板为丁香假单胞DC3000菌株的DNA；泳道6模板为芽孢杆菌S1130菌株的DNA；泳道7、8模板为两组感病番茄根际土DNA；M为2000bp DNA Marker。D中，泳道1为青枯菌P380；泳道2为Bacillusaltitudinis(芽孢杆菌属)；泳道3为Pseudomonas prosekii(假单胞菌属)；泳道4为Pseudomonas mandelii(假单胞菌属)；泳道5为Nocardioides pyridinolyticus(类诺卡氏菌属)；泳道6为Gordonia terrae(戈登氏菌属)；泳道7为Rhodococcus baikonurensis(红球菌属)；泳道8为Rhodococcus erythropolis(红球菌属)；泳道9为Leifsonia soli(赖氏菌属)；泳道10为Nocardioides gansuensis(类诺卡氏菌属)；泳道11为Pseudarthrobacterchlorophenolicus(假杆菌属)；泳道12为Pseudarthrobacter niigatensis(假杆菌属)；泳道13为Leifsonia xyli subsp.cynodontis(赖氏菌属)；泳道14为Sphingomonas pruni(鞘氨醇单胞菌属)；泳道15为Arthrobacter humicola(节杆菌属)；泳道16为Pusillimonasharenae(极小单胞菌属)；泳道17为Paenarthrobacter nicotinovorans(拟杆菌属)；泳道18为Sphingomonas ginsengisoli(鞘氨醇单胞菌属)；泳道19为H2O；M为2000bp DNAMarker。E中，基于引物epsD-F/epsD-R的灵敏度验证，泳道1为1.0×101ng/μL；泳道2为1.0×100ng/μL；泳道3为1.0×10-1ng/μL；泳道4为1.0×10-2ng/μL；泳道5为1.0×10-3ng/μL；泳道6为1.0×10-4ng/μL；泳道7为1.0×10-5ng/μL；M为2000bp DNA Marker
图3为实施例3中青枯菌DNA浓度的Log值和qPCR中Ct值之间的标准曲线。
图4为实施例3中青枯病菌菌液浓度Log值和qPCR中Ct值之间的标准曲线。
图5为实施例4中健康和不同感病程度的番茄根际土中青枯菌的Ct值。1为健康番茄的根际土样品，2-5分别为侵染后3天、侵染后6天、侵染后9天、侵染后12天的番茄根际土样品。
图6为实施例5中青枯病菌数量与感病指数间的数学模型。
图7为实施例6中不同时期青枯菌菌量和病情指数之间的关系。
图8为实施例6中同一时期青枯菌菌量和发病等级之间的关系。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
青枯菌GMI1000：记载于“神方芳.宿主植物源的L-谷氨酸对青枯劳尔氏菌GMI1000的致病性调控研究.华南农业大学,2019年硕士论文”一文中的“青枯劳尔氏菌GMI1000”，公众可从申请人处获得，尽可用于重复本发明实验使用，不得他用。
青枯菌P380：记载于NCBI数据库，Ralstonia solanacearum strain P380,wholegenome shotgun sequencing project，NCBI Reference Sequence:NZ_JAKEEA000000000.1。公众可从申请人处获得，尽可用于重复本发明实验使用，不得他用。
实施例1、青枯菌特异性基因epsD的选定
一、青枯菌epsD基因序列与其它属epsD基因序列之间具有较大差异
将青枯菌的epsD基因与芽孢杆菌属(Bacillus)、固氮螺菌属(Azospirillum)、盐单胞菌属(Halomonas)、乳球菌属(Lactococcus)、溶杆菌属(Lysobacter)、甲基菌属(Methylobacillus)、甲基菌属(Pseudoalteromonas)、链球菌属(Streptococcus)、弧菌属(Vibrio)等9个属20种产胞外多糖菌的epsD基因进行不同属间序列比对，利用DNAMAN软件进行序列比对(图1中A)，结果发现：青枯菌的epsD基因属间同源性为24.19％，说明青枯菌的epsD基因与其他属菌株的epsD基因之间具有较大差异。
二、青枯菌的epsD基因序列属内高度保守
在NCBI数据库中下载14种青枯菌胞外多糖epsD基因的序列，利用DNAMAN软件进行epsD基因序列比对(图1中B)，结果发现：青枯菌epsD基因属内不同菌株间同源性为97.46％，说明青枯菌的epsD基因属内高度保守。
综上，epsD基因在青枯菌与芽孢杆菌属(Bacillus)、固氮螺菌属(Azospirillum)等9个属20种产胞外多糖菌的属间序列差异性较大(同源性24.19％)，在14株青枯菌属内不同菌株间高度保守(同源性为97.46％)，因此选择epsD基因作为青枯菌的特异性引物。
实施例2、青枯菌epsD基因引物的设计和验证
一、青枯菌epsD基因引物的设计
针对epsD基因序列，利用软件Primer Premier 6.0对属间具有较大差异而属内同源性高的序列进行引物设计，获得青枯菌特异性引物(图2中A和B)，具体如下：
epsD-F：5’-GGAGCCGGTCATCGCGTGCTTC-3’(SEQ ID No.1)；
epsD-R：5’-AGCGCGGCCTCCGCGTTCAGCA-3’(SEQ ID No.2)。
该引物由擎科生物技术有限公司合成，理论扩增片段大小为192bp(SEQ IDNo.3)。引物稀释前先在4℃条件下，以1×103rpm离心2min，然后加入去离子水配成10μM的贮存液保存于-20℃待用。
二、引物epsD-F/eps-R的特异性验证
采用引物epsD-F/eps-R对青枯菌基因组DNA及非靶标菌株基因组DNA进行普通PCR。
阳性对照为青枯菌P380、青枯菌GMI1000、青枯菌P441(由中国农业科学院农业资源与农业区划研究所魏海雷课题组提供)。
阴性对照包括芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、类诺卡氏属(Nocardioides)、戈登氏菌属(Gordonia)、红球菌属(Rhodococcus)、赖氏菌属(Leifsonia)、假杆菌属(Pseudarthrobacter)、单胞菌属(Sphingomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、极小单胞菌属(Pusillimonas)、拟杆菌属(Paenarthrobacter)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)等12个属18种近源菌和番茄根际土壤中的优势菌株以及无菌水。
同时对感染青枯病的番茄根际土提取的DNA进行验证。
供试菌株接种于NA培养基中，在30℃条件下培养2d，挑取单菌落制备菌落PCR模板，利用青枯菌特异性引物epsD-F和epsD-R进行PCR扩增。PCR反应体系：总体系20μL包含模板DNA 1.0μL，Taq PCR Mix(2×)10μL，10μM的引物epsD-F 1.0μL、10μM的引物epsD-R 1.0μL和双蒸水7μL。
扩增反应条件：第一步94℃预变性2min，第二步94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。PCR完成后，产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。
以近源菌和番茄根际土壤中的优势菌株、无菌水为对照，利用引物epsD-F/epsD-R进行常规PCR，电泳分析结果表明：青枯菌均有单一、明亮的目的条带，而对照菌株均未扩增出条带详情见图2中C和D。通过对引物epsD-F/epsD-R的特异性验证，结果显示该引物特异性良好。
三、引物epsD-F/eps-R的灵敏度验证
以epsD-F/epsD-R为引物，利用常规PCR对梯度稀释的青枯菌P380的DNA标准样品(1.0×10-5ng/μL～1.0×101ng/μL)进行扩增检测，在模板浓度为1.0×10-4ng/μL时，电泳条带模糊，但仍可检测到，可认为常规的检测下限为1.0×10-4ng/μL，详情见图2中E。
综上所述，该青枯菌引物的特异性好、灵敏度高，可用于后续青枯菌的荧光定量分析实验。
实施例3、建立基于epsD特异引物的番茄青枯病检测方法
一、标准曲线的建立
1、基于引物epsD-F/epsD-R建立青枯菌P380纯菌的DNA浓度梯度的标准曲线
将青枯菌P380纯菌的DNA按浓度梯度进行稀释，使其终浓度分别为1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、1×100ng/μL。取4μL各梯度稀释的菌悬液为模板，利用引物epsD-F/epsD-R进行荧光定量qPCR实验。qPCR采用QuantStudio 6 Flex实时荧光PCR仪和Universal qPCR Master Mix试剂进行。20μL qPCR反应体系包括：模板DNA 4.0μL，Universal qPCR master Mix(2X)10.0μL、10μM的引物epsD-F1.0μL、10μM的引物epsD-R1.0μL和双蒸水4.0μL。扩增程序如下：第一步95℃预变性3min；第二步95℃变性15s，68℃退火45s，72℃延伸30s，40个循环。PCR结束后立即进行溶解曲线分析，验证扩增的特异性。每个qPCR反应重复4次。记录qPCR反应体系的Ct值，并分析其与青枯菌DNA浓度的相关性。如图3所示，菌液DNA浓度在10-5～100ng/μL范围内，青枯菌DNA浓度的Log值与Ct值之间呈良好的线性关系，线性方程为y＝-3.1461x+17.552(x代表菌DNA浓度的Log值，y代表对应的循环阈值Ct)，R2＝0.9996。
2、基于引物epsD-F/epsD-R建立青枯菌P380纯菌的菌液浓度梯度的标准曲线
将青枯菌菌液浓度按梯度进行稀释，使其终浓度分别为1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL。取4μL各梯度稀释的菌悬液为模板，利用引物对epsD-F/epsD-R进行荧光定量qPCR实验。qPCR采用QuantStudio 6 Flex实时荧光PCR仪和Universal qPCR Master Mix试剂进行。20μL qPCR反应体系包括：模板DNA 4.0μL，Universal qPCR master Mix(2X)10.0μL、10μM的引物epsD-F 1.0μL、10μM的引物epsD-R1.0μL和双蒸水4.0μL。扩增程序如下：第一步95℃预变性3min，第二步95℃变性15s；68℃退火45s，72℃延伸30s，40个循环。PCR结束后立即进行溶解曲线分析，验证扩增的特异性。每个qPCR反应重复4次。记录qPCR反应体系的Ct值，并分析其与青枯菌菌液浓度的相关性。如图4所示，菌液浓度在103～108cfu/mL范围内，青枯菌DNA浓度的菌溶液浓度对数值与Ct值之间呈良好的线性关系，线性方程为y＝-3.0892x+43.607(x代表菌悬液中菌浓度对数值，y代表对应的循环阈值Ct)，R2＝0.9992。
二、循环阈值Ct值的确定
利用qPCR技术对各梯度稀释的青枯菌DNA进行检测(具体操作参见步骤一)，记录Ct值，并分析浓度在10-5～100ng/μL范围内，青枯菌DNA浓度的Log值与Ct值之间呈良好的线性关系，线性方程为y＝-3.1461x+17.552(x代表菌DNA浓度的Log值，y代表对应的循环阈值Ct)，R2＝0.9996。最低青枯菌DNA浓度为10-4ng/μL的Ct值为33.301。因此，我们将Ct值为33作为是否为番茄青枯病的临界值(即青枯菌阳性判定阈值)。即当番茄样本qPCR检测的Ct值小于33时，表明有青枯菌的存在，为番茄青枯病发病植株；当番茄样本qPCR检测的Ct值大于33时，表明番茄没有青枯菌，为番茄健康植株。
三、基于引物epsD-F/epsD-R鉴定番茄青枯病的方法
利用引物epsD-F/epsD-R进行荧光定量qPCR实验(具体操作参见步骤一)，鉴定番茄青枯菌。具体步骤如下：
(1)取疑似青枯病的番茄的根际土壤，采用SPINeasy DNA Kit for soil试剂盒从该番茄根际土壤中提取DNA；
(2)以该番茄根际土壤中提取的DNA为模板，利用上述番茄青枯病鉴定的特异性引物epsD-F/epsD-R进行荧光定量qPCR(具体操作参见步骤一)；
(3)记录该番茄根际土壤DNA的qPCR反应体系的Ct值，当Ct值≤33时，表明有青枯菌的存在，该番茄为青枯病发病植株，当Ct值>33时，表明没有青枯菌的存在，该番茄为健康植株。
实施例4、利用qPCR技术对侵染前和侵染后不同感病程度的番茄根际土的检测
采用青枯菌P380侵染番茄植株，分别于侵染前、侵染后3天、侵染后6天、侵染后9天、侵染后12天取根际土壤作为样本。利用本发明qPCR技术对侵染前和侵染后不同感病程度的番茄根际土的检测。利用SPINeasy DNA Kit for soil试剂盒从番茄根际土壤样本中提取DNA，琼脂糖凝胶电泳检测后，保存于-20℃条件下待用。
以番茄根际土样本DNA为模板，利用实施例1中的引物对epsD-F/epsD-R进行荧光定量qPCR实验。qPCR采用QuantStudio 6Flex实时荧光PCR仪和Universal qPCRMaster Mix试剂进行。20μL qPCR反应体系包括：模板DNA 4.0μL，Universal qPCR masterMix(2X)10.0μL、10μM的引物epsD-F 1.0μL、10μM的引物epsD-R 1.0μL和双蒸水4.0μL。扩增程序如下：第一步95℃预变性3min；第二步95℃变性15s，68℃退火45s，72℃延伸30s，40个循环。PCR结束后立即进行溶解曲线分析，验证扩增的特异性。每个qPCR反应重复4次。记录各样本qPCR反应体系的Ct值。
实验结果如图5所示，利用qPCR技术对青枯菌侵染前、侵染后3天、侵染后6天、侵染后9天、侵染后12天的番茄根际土样本进行检测，记录Ct值。结果表明：
1)侵染前的番茄根际土样本Ct值为39.6，大于上述Ct值的临界值，为健康植株。
2)侵染后不同感病程度的番茄根际土样本中，Ct值分别为26.4、22.0、18.8、15.9，均小于上述Ct值的临界值，为发病植株。
实施例5、利用qPCR技术对青枯病菌数量与感病指数间的数学模型的构建
青枯菌P380设置两个感病浓度(105、107cfu/mL)，侵染番茄各15株，菌液拌土后移栽伤根后的番茄，同时设置等量无菌水拌土伤根移栽的对照组(CK)番茄，处理后于恒温光照培养箱中培养，温度32℃，湿度70％。每3天取一次样，每次采3盆番茄的根际土，15天一个周期，同时记录番茄的发病等级。番茄青枯病发病情况分级标准为：0级，全株无病；1级，全株25％及以下茎干、叶片发病；2级，全株25％-50％(不含端点)茎干、叶片发病；3级，全株50％及以上茎干、叶片发病；4级，因病枯死。样品进行qPCR菌量检测(具体操作见实施例3)，利用标准曲线(具体见实施例3步骤一2)及数据处理得到青枯菌菌量，从而进行数学曲线的建立。
根据番茄的发病等级，利用公式病情指数(DI)＝[∑(各级病株数×该病级数)/(调查总株数×最高级别)]×100，计算出病情指数。
试验中对照组的番茄植株，一周期内番茄均没有发病；拌菌浓度为105cfu/mL的番茄植株，发病数量为1/15，发病番茄根际土菌量为1.725×107cfu/g，病情指数为1.67；实验中拌菌浓度107cfu/mL的番茄植株，番茄发病数量为10/15，病情指数为3.33时，番茄出现感病症状，发病的番茄根际土菌量为5.75×106cfu/g。建立每克根际土内的青枯菌菌量及病情指数构建数学模型，利用Origin拟合出病情指数与青枯菌量的关系模型，同时得到番茄青枯菌菌量对病情指数影响公式：y＝3.4513-4.15753e-0.70492x(x代表青枯菌菌量，y代表对应的病情指数)，根据公式随机选取7个青枯菌量点对青枯病模型进行验证，得出误差在可以接受的范围内，详情见图6。结果表明，番茄青枯病的发生与青枯病菌的数量关系密切，番茄根际土菌量在5.75×106cfu/g时发病。
实施例6、利用qPCR技术对田间不同时期和同一时期不同发病等级的番茄根际土菌量的检测
检测田间5个不同时期番茄根际土以及同一时期番茄根际土的青枯菌菌量，以0.5g番茄根际土样本为材料，采用SPINeasy DNA Kit for soil试剂盒提取番茄根际土样本的DNA，琼脂糖凝胶电泳检测后，保存于-20℃条件下待用。
取4.0μL番茄根际土样本DNA为模板，利用实施例1中的引物对epsD-F/epsD-R进行荧光定量qPCR实验。qPCR采用QuantStudio 6 Flex实时荧光PCR仪和UniversalqPCR Master Mix试剂进行。20μL qPCR反应体系包括：模板DNA 4.0μL，Universal qPCRmaster Mix(2X)10.0μL、10μM的引物epsD-F 1.0μL、10μM的引物epsD-R 1.0μL和双蒸水4.0μL。扩增程序如下：第一步95℃预变性3min；第二步95℃变性15s，68℃退火45s，72℃延伸30s，40个循环。PCR结束后立即进行溶解曲线分析，验证扩增的特异性。每个qPCR反应重复3次。记录各样本qPCR反应体系的Ct值。
根据Ct值，利用青枯菌菌液浓度标准曲线(具体见实施例3步骤一2)，得出青枯菌的菌量；利用公式病情指数(DI)＝[∑(级别代表值×本级病株数)/(检查总株数×最高级别代表值)]×100，计算出病情指数；建立菌量与病情指数、发病等级之间的关系(具体见实施例5)。
实验结果表明：
1)田间5个不同时期番茄根际土中，青枯菌菌量含量呈上趋势，且与病情指数呈正相关关系。第一次和第二次采样时番茄未发病，第三次采样开始发病，发病时菌量为1.38×106cfu/g，病情指数为8.33，详情见图7。
2)田间同一时期不同发病等级的番茄根际土中，青枯菌菌量含量呈上趋势，且与发病等级呈正相关关系。发病等级为1时，发病时菌量为1.98×106cfu/g，详情见图8。
综上，利用基于引物epsD-F/eps-R进行荧光定量qPCR，建立番茄青枯病感病数学模型，检测田间不同时期和同一时期不同发病等级的番茄根际土菌量，同时与数学模型的结果进行拟合，通过结果显示，该引物和番茄青枯菌鉴定方法效果良好，且根据田间验证效果及结合实施例5的结果，得出番茄青枯病的侵染阈值在1×106-5×106cfu/g，建议在检测到青枯菌菌量在106cfu/g前进行防治。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所
<120> 一种番茄青枯病菌鉴定的特异性引物及其应用
<130> GNCLN213622
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<211> 22
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agcgcggcct ccgcgttcag ca 22
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
ggagccggtc atcgcgtgct tcggcctgtc gttcaaggcc aatatcgacg atctgcgcga 60
gagtccggcg atcgaaatcg tgcagaccat ggtgcagcag cagctgggca cggtgctggt 120
ggtcgagccg catatcaagg tgctgccggc tgcgctgcag ggtgtcgaac tgctgaacgc 180
ggaggccgcg ct 192
Claims (8)
1.如下任一应用：
P1、引物对或试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定青枯菌中的应用；
P2、引物对在制备用于鉴定或辅助鉴定青枯菌的产品中的应用；
P3、引物对或试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测菌是否为青枯菌中的应用；
P4、引物对在制备用于鉴定或辅助鉴定待测菌是否为青枯菌的产品中的应用；
P5、引物对或试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测生物样品中是否含有青枯菌中的应用；
P6、引物对在制备用于鉴定或辅助鉴定待测生物样品中是否含有青枯菌的产品中的应用；P7、引物对或试剂或试剂盒在检测待测生物样品中青枯菌含量中的应用；
P8、引物对在制备用于检测待测生物样品中青枯菌含量的产品中的应用；
所述引物对由引物epsD-F和引物epsD-R组成；所述引物epsD-F的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述引物epsD-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述试剂包括所述引物对；
所述试剂盒包括所述引物对。
2.一种鉴定或辅助鉴定青枯菌的方法，包括如下步骤：以待测生物样品的基因组DNA为模板，用引物对进行PCR扩增得到扩增产物，检测所述扩增产物的大小，如果所述扩增产物含有100-250bp的DNA片段，则所述待测生物样品为或候选为青枯菌或者含有或候选含有青枯菌；如果所述扩增产物不含有100-250bp的DNA片段，则所述待测生物样品不为或候选不为青枯菌或者不含有或候选不含有青枯菌；
所述引物对由引物epsD-F和引物epsD-R组成；所述引物epsD-F的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述引物epsD-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述100-250bp的DNA片段为192bp的DNA片段。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述192bp的DNA片段的核苷酸序列如SEQID No.3所示。
5.一种鉴定或辅助鉴定青枯菌的方法，包括如下步骤：以待测生物样品的基因组DNA为模板，用引物对进行荧光定量PCR，得到所述待测生物样品的Ct值，如果Ct值≤33，则所述待测生物样品为或候选为青枯菌或者含有或候选含有青枯菌；如果Ct值＞33，则所述待测生物样品不为或候选不为青枯菌或者不含有或候选不含有青枯菌；
所述引物对由引物epsD-F和引物epsD-R组成；所述引物epsD-F的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述引物epsD-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
6.一种检测待测生物样本中青枯菌含量的方法，包括如下步骤：基于引物对，将青枯菌菌悬液浓度梯度稀释后进行荧光定量PCR，得到青枯菌菌液浓度与Ct值之间的标准曲线；然后以待测生物样品的基因组DNA为模板，用所述引物对进行荧光定量PCR，得到所述待测生物样品的Ct值，然后将所述待测生物样品的Ct值代入所述标准曲线，计算得到所述待测生物样本中青枯菌含量；
所述引物对由引物epsD-F和引物epsD-R组成；所述引物epsD-F的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述引物epsD-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
7.SEQ ID No.3所示DNA分子在鉴定或辅助鉴定青枯菌或制备用于鉴定或辅助鉴定青枯菌的产品中的应用。
8.一种对植物进行青枯病防治的方法，包括如下步骤：采用权利要求6所述方法监测植物根际土壤中青枯菌的含量，选择在植物根际土壤中青枯菌含量低于106cfu/g时进行青枯病防治。
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| Genome sequencing and analysis of Ralstonia solanacearum phylotype I strains FJAT-91, FJAT-452 and FJAT-462 isolated from tomato, eggplant, and chili pepper in China;Yidan Sun等;7、Standards in Genomic Sciences;第12卷;1-11 * |
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| 青枯雷尔氏菌胞外多糖合成缺失突变株构建及其生物学特性;陈小强等;微生物学报;第58卷(第5期);926-938 * |
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