CN103397099A

CN103397099A - 通过荧光定量pcr检测转基因小麦生长期内根际土壤中荧光假单胞菌数量的方法

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Publication number: CN103397099A
Application number: CN2013103562326A
Authority: CN
Inventors: 史建荣; 杜鹃; 吴季荣; 刘馨; 徐剑宏; 胡晓丹
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-08-16
Filing date: 2013-08-16
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2033-08-16
Also published as: CN103397099B

Abstract

转基因作物对土壤根际微生物的影响是环境生物安全研究的重要方面。本文对转基因抗病小麦根际土壤中荧光假单胞菌数量进行绝对定量，建立了实时荧光定量PCR（Real-TimeQPCR）检测体系。应用该反应体系，对转基因小麦各个生长时期根际土壤的荧光假单胞菌拷贝数进行绝对定量。结果表明，该设计引物具有较好特异性；Real-TimeQPCR反应的扩增曲线中各梯度标准质粒的循环阈值（Ct值）间隔均匀，熔解曲线峰值较突出，该标准曲线的相关系数R²=0.99905，斜率为-3.203，计算其扩增效率E=100%。在转基因小麦的播种期、返青期、灌浆期和成熟期，根际土壤荧光假单胞菌数量呈现逐渐上升的趋势。

Description

通过荧光定量PCR检测转基因小麦生长期内根际土壤中荧光假单胞菌数量的方法

技术领域

本发明涉及农作物生防菌的分子检测技术，属于生物技术领域。

背景技术

农业生物技术应用服务组织（ISAAA）数据显示，到2012年，种植转基因作物的国家已经达到29个，并且全球转基因作物的种植面积也已经达到15亿公顷。^.转基因作物与日俱增的种植面积，主要还是由于其带来的丰厚经济效益，但这样大范围的扩增对整个农业种植环境到底有无影响成为一个迫在眉睫的问题，所以对于其对农业生产的生态环境的考量也就显得尤为重要。

荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens)在分类学上属于细菌域、变形菌门、γ-变形菌纲、假单胞菌目、假单胞菌科的假单胞菌属。细胞为直的杆菌，大小为0.7-0.8X2.3-2.8 微米，不产芽孢，革兰氏染色阴性。有数根极生鞭毛，运动。需氧,进行严格的呼吸型代谢,以氧为最终电子受体。能以硝酸盐为替代的电子受体进行厌氧呼吸。化能营养异养，不需要有机生长因子。氧化酶阳性，接触酶阳性。能利用葡萄糖和果糖，有些菌株能从蔗糖合成果聚糖，明胶液化。生长温度范围 4-37℃，最适生长温度是25-30℃。 DNA中G+C 含量是60-61%。广泛分布于自然界，如土壤、水、植物及动物活动环境中。该菌生化能力活跃，可降解许多人工合成化合物，常被用于环境保护。

荧光假单胞菌还是一种重要的植物根际促生细菌,是已知植物根际有益微生物中种群数量较多的细菌种类之一。该菌营养需要相对简单,能够利用根系分泌物中大部分营养迅速在植物根围定殖。其中一些菌株具有促进植物生长和防治病害的作用,因而用于植物病害的生物防治。

荧光假单胞菌是一种在根际土壤中很容易分离得到的一个菌种，并且其特性被认为可以快速直观的反应整个土壤环境的变化，由此通过对荧光假单胞的数量变化的检测，就可以较为准确的说明转基因小麦对其根系土壤环境有无影响。

目前人们对土壤样品中荧光假单胞菌的检测方法主要是通过分离培养菌株然后通过生理生化或分子生物学进行鉴定，这种方法只能针对特定时间的特定土壤进行分析，虽能也分离得到荧光假单胞菌但并未对其数量进行确定，不能反映整个土壤环境在植物生长期间的变化，并未形成针对植物生长期间对土壤中荧光假单胞菌变化规律进行检测的体系。

实时荧光定量PCR 技术是一种利用核酸进行定量的方法，发明人曾于2011年12月15日申请了利用该技术检测转基因小麦生长期内根际土壤中镰刀菌拷贝数，并获得了专利权，授权公告号为：CN102517385B，该专利告诉我们，它能够重复的，灵敏的，特异的对目标真菌进行定量，结果也较为准确，较普通的定量方法快捷有效。但是，能否用于对转基因小麦生长期内根际土壤中的细菌进行检测，并没有任何启示，此前的公开报道和论文也没有相关的报道。

发明内容

本发明的目的在于：对转基因小麦根际土壤中荧光假单胞菌含量的绝对定量方法进行了研究，旨在建立对转基因小麦根际土壤中荧光假单胞菌数量进行定量的荧光定量PCR的方法，为后续对小麦各个生长时期检测做准备工作，进而研究转基因小麦对根际土壤微生物动态的影响。

近年来，荧光定量PCR技术的提出，为土壤中微生物检测提供了全新的方法，和普通PCR 方法相比，具有敏感性高、特异性强、重复性好、成本低、操作方便和直观等优点，它可以通过检测病原菌目的序列PCR扩增产物的荧光信号强度达到实时解析的目的。

本发明的目的是这样实现的：一种通过实时荧光定量PCR建立转基因小麦生长期内根际土壤中荧光假单胞菌数量的方法，其特征在于：利用荧光假单胞菌gyrB为目的基因设计的特异引物S EQ ID No.1和SEQ ID No.2对转基因小麦根际土壤样本的总DNA进行PCR扩增，获得大小在151bp的特异性片段，具体步骤如下：

a）在田间播种转基因小麦，设置四个重复。分别在小麦生长发育的播种期、拔节期、灌浆期、成熟期采用对角线5点取样法采集根际土壤样本；

b）应用UltraClean^TM soil DNA Isolation Kit试剂盒（Mo-Bio，USA）分别提取各根际土壤样本的总DNA，并将样本的总DNA溶于ddH₂O中；以荧光假单胞菌gyrB基因的特异引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2对每个时期的样本DNA进行PCR扩增，获得大小在151bp的特异性片段；并进行克隆测序，分析得到阳性克隆后提取质粒，构建标准曲线。由实时荧光定量PCR仪根据荧光信号的变化及标准曲线直接测出土壤中荧光假单胞菌拷贝数；

c）将不同时期土壤样本中荧光假单胞菌拷贝数汇总，形成转基因小麦生长期内根际土壤中荧光假单胞菌拷贝数变化趋势。

在本发明中：所述的标准曲线为Y₁= -3.320X₁+38.843，R²=0.99905，其中Y₁为实时荧光定量PCR反应的Ct值，X₁为荧光假单胞菌的标准质粒拷贝数对数值。

在本发明中：PCR反应的体系为：20μL，其中10×PCR Buffer 10 μL，其中包括2×Master Mix，上、下游引物10μmol/L各0.5μL，模板1μL，再加去离子水补足；荧光时实定量PCR反应程序为：95 ℃预变性10min; 95 ℃变性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共进行40个循环。

本发明的优点在于：所用的引物反应得到的扩增曲线、熔解曲线以及标准曲线均达到Real-Time QPCR反应的理想条件。gyrB基因是一种蛋白编码基因，编码促旋酶的B亚单位。有研究表明gyrB序列比16SrDNA序列区分相似种的能力更强，它可以有效的区分出相近的物种，因为gyrB基因不显现频繁的水平转移,在大多数细菌中存在, 在不同蛋白及蛋白不同位点, 具有不同的氨基酸替代率，而这些特点充分的满足了一个优良的靶标基因必须具备的条件，本发明使用根据荧光假单胞菌的gyrB基因设计得到的引物扩增无引物二聚体及非特异性扩增出现，具有良好的特异性。建立实时荧光定量检测体系除了引物应具有良好的特异性外，标准曲线的建立更是定量的关键；由于Real-Time QPCR绝对定量是建立在模板的初始浓度与Ct值关系的基础上，因此为保证样本定量分析具有稳定可重复的结果，标准曲线参数的要求非常严格。理论上合格的标准曲线具有一致的重复反应、高线性相关( R² > 0. 99)和高扩增效率( E: 90~ 105%)。

本发明的优点还在于，应用分子生物学手段研究转基因作物的安全性，建立了快速、简便的鉴定方法。转基因作物对土壤微生物的影响是安全性评价的一个重要方面。本发明采用对土壤总DNA进行提取，采用PCR方法对荧光假单胞菌的gyrB基因片段进行扩增，再经连接、转化后，获得插入片段为151bp的质粒，再以此质粒为模板进行Real-Time QPCR。此方法不仅鉴定了荧光假单胞菌，并且可准确的对其进行绝对定量，并得到在转基因小麦根际土壤中各个生育期荧光假单胞菌的拷贝数。在小麦整个生育期中，荧光假单胞菌拷贝数的变化总体呈现由低到高的趋势，但差异并不明显。本实验立足于国际转基因作物发展现状，应用分子生物学手段研究转基因作物的安全性，建立了快速、简便而精确的鉴定方法。为后续试验提供了理论和试验依据，对进一步评价转基因作物的安全性具有重要意义。

本发明与现有方法相比，具有以下的技术优势：敏感性高，特异性强，重复性好，操作方便，结果直观。

附图说明

图1 Real-time Q PCR扩增曲线图（从左到右依次为2.57×10⁸ copies/μL~2.57×10⁴copies/）。

图2 Real-time Q PCR标准曲线（Y₁=-3.320X₁+38.843，R²=0.99905）。

图3 Real-time Q PCR熔解曲线（曲线峰值单一，特异引物扩增得到的标准质粒及样品的峰值在（88.5±0.3）℃）。

图4 Real-Time QPCR灵敏度检测的扩增曲线（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10依次代表标准质粒原液、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9倍稀释）。

图5 Real-Time QPCR灵敏度检测结果的琼脂糖凝胶电泳结果（M:DL 2000 maker，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10依次代表：标准质粒原液、10^-1、10^-2、10^-3、 10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9倍稀释）。

图6转基因小麦土壤根系土荧光假单胞菌拷贝数。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1：荧光定量PCR体系的建立

（1）制作标准曲线所需荧光假单胞菌DNA模板的制备

根据荧光假单胞菌的gyrB基因及荧光定量PCR的引物要求设计引物：

SEQ ID No.1：gyrB-F: TGTTCGAGGTGGTCGACAACT

SEQ ID No.2：gyrB-R: TGGAGGACGGTCATGATGA

应用此引物从提取的土壤总DNA进行目的片段扩增。PCR反应体为25μL，其中rTaq酶0.125μL，10×PCR buffer2.5μL，dNTP 2μL,Mgcl 1.5μL,上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板1μL ，去离子水补足体积。反应条件为:预变性94℃ ; 变性94℃ ，退火55℃ ，延伸72℃ ，35个循环; 延长10min后进行琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物是否单一特异，若结果特异则切胶回收目的条带，回收产物与T载体进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞，利用氨苄抗性平板过夜筛选，然后对克隆进行PCR鉴定，将阳性克隆送由上海生工生物工程有限公司进行测序。

对测序结果正确的阳性克隆进行扩大培养并提取其质粒，使用微量紫外分光光度计测得其浓度，按照公式计算得到质粒拷贝数，将已知拷贝数的质粒作为标准质粒，用于下一步定量研究。

（2）标准质粒浓度的计算

提取经过测序验证的阳性克隆的质粒，将获得的质粒计算拷贝数。

质粒拷贝数的计算方法为：

质粒拷贝数（copy/μl）=质粒浓度（g/μl）×6.023×10²³（copy/μl）/MW（g/mol）（其中MW=（克隆载体长度+目的片段长度）（bp））×324×2g/（mol bp）。

（4）检测体系建立

取构建好的质粒进行10⁸-10⁴copy/μl系列梯度稀释，以稀释好的质粒为模板，进行荧光定量PCR分析，同时设置阴性对照。20 μl反应体系：2×Master Mix 10 μL，ddH₂O 8 μL，正向引物10 μmol/L 0.5 μL，反向引物 10 μmol/L 0.5 μL， DNA 1.0 μL。PCR反应条件为：94℃预变性 5 min，94℃变性 10 s，55℃退火 10 s，72℃延伸20 s，共进行40个循环。反应在Rotor Gene 6000实时荧光定量PCR仪（Corbett，Australia）上进行，标准曲线、扩增曲线及熔解曲线由仪器自带分析软件自动生成。

Rotor-Gene 6000 Series实时荧光定量分析软件绘制出反应的扩增曲线（见附图1）。扩增曲线显示，从左至右5条曲线依次代表标准品的1:10⁸、1:10⁷、1:10⁶、1:10⁵、1:10⁴的梯度稀释液的扩增曲线，5个质粒标准品扩增曲线较光滑，呈现典型的S型曲线，且各循环阈值(Ct值)间隔均匀。

根据扩增曲线提供的标准品各梯度浓度及反应的循环阈值(CT值)，Rotor-Gene 6000 Series软件自行绘制出反应的标准曲线(见附图2)。该标准曲线的相关系数R²=0.99905，斜率为-3.320，计算其扩增效率E=100%，符合荧光定量分析对标准曲线的要求。

测定各浓度稀释梯度的标准品及样品在PCR过程中的熔解温度并绘制熔解曲线(见附图3)。标准品及样品的熔解曲线峰型单一，且标准品及样品熔解温度相同(88.5±0.3℃ )，表明扩增反应产物熔解温度较均一，特异性好且无引物二聚体影响。

实施例2：荧光定量PCR检测体系灵敏度检测

对已构建的标准质粒进行10倍稀释，稀释为2.57×10¹⁰ copies/μL~2.57×10 copies/μL，使用相应的引物进行荧光定量扩增，以检测其扩增的灵敏性。得到扩增曲线（见附图4），并对扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测(见附图5)

由上述结果分析得知在对标准质粒进行10^-7倍稀释前其扩增曲线依然呈现“s”型，且扩增曲线间隔均匀，在琼脂糖凝胶电泳后也呈现明显梯度及较好的亮度，在10^-7稀释后，扩增曲线“s”型不明显，且无法区分梯度，此时灵敏度下降，这点在琼脂糖凝胶电泳中也有较好的体现。由此说明，此反应体系灵敏度较高，可以满足本实验中对根系土壤中荧光假单胞菌进行定量分析的要求。

实施例3：

转基因小麦主要生育期根际土壤中荧光假单胞菌生长动态分析

采用实施例1的荧光定量PCR体系

实时荧光定量PCR仪采用Corbett公司（Australia）生产的Rotor Gene 6000荧光定量PCR进行。

分别于冬小麦生长的播种期、拔节期、灌浆期及成熟期在相同地点采集小麦根际土壤，提取DNA，利用实施例1提供的特异引物及扩增体系进行扩增，根据标准曲线计算即可获得土壤样本中初始荧光假单胞菌的含菌量。

应用已建立的Real-Time QPCR，对小麦整个生长期根际土壤中的荧光假单胞菌的数量进行了检测（见附图6）。2012年转WYMV-Nib8抗小麦黄花叶病毒病基因小麦N12-1根际土壤的荧光假单胞菌的拷贝数数量为4.20E+07-9.27E+07 copies /g土壤，生长时期之间的差异基本呈现先上升后下降的趋势，这种差异的构成原因是多方面的，可能与土壤湿度，PH值，采样时温度差异有关。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 通过荧光定量PCR检测转基因小麦生长期内根际土壤中荧光假单胞菌数量的

方法

<130> 2013

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgttcgaggt ggtcgacaac t 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tggaggacgg tcatgatga 19

Claims

1. 建立应用荧光定量PCR方法检测转基因小麦根际土壤中荧光假单胞菌(Psdeuomnoda fluoerncnet)数量的检测体系,其特征在于：利用荧光假单胞菌gyrB为目的基因设计的特异引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2对转基因小麦根际土壤样本的总DNA进行PCR扩增，获得大小在151bp的特异性片段，具体步骤如下：

a）在田间播种转基因小麦，设置四个重复；分别在小麦生长发育的播种期、拔节期、灌浆期、成熟期采用对角线5点取样法采集根际土壤样本；

b）应用UltraClean^TM soil DNA Isolation Kit试剂盒（Mo-Bio，USA）分别提取转基因小麦根际土壤样本的总DNA，并将该样本的总DNA溶于ddH₂O中；以荧光假单胞菌gyrB为目的基因设计的特异引物S EQ ID No.1和SEQ ID No.2，对每个时期的样本DNA进行PCR扩增，获得大小在151bp的特异性片段；并进行克隆测序，分析得到阳性克隆后提取质粒，构建标准曲线；由实时荧光定量PCR仪时根据荧光信号的变化及标准曲线直接测出土壤中荧光假单胞菌拷贝数；

c）应用定量PCR引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2进行荧光定量扩增，将不同时期土壤样本中荧光假单胞菌拷贝数汇总，形成转基因小麦生长期内根际土壤中荧光假单胞菌拷贝数变化趋势；

所述的标准曲线为Y₁=-3.320X₁+38.843，R²=0.99905，其中Y₁为实时荧光定量PCR反应的Ct值，X₁为荧光假单胞菌的标准质粒拷贝数对数值。

2.根据权利要求1所述的通过实时荧光定量PCR建立转基因小麦生长期内根际土壤中荧光假单胞拷贝数的方法，其特征在于：PCR反应的体系为：20μL，其中10×PCR Buffer10 μL，其中包括2×Master Mix，上、下游引物10μmol/L各0.5μL，模板1μL，再加去离子水补足；实时荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性5 min; 95℃变性10 s，55℃退火20s，72℃延伸20s，共进行40个循环。