JP6403665B2 - 共生体を含む人工種子の大規模生成のための方法 - Google Patents
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Description
したがって、従来技術に伴う問題や欠点の一つ以上を克服するか、少なくとも、軽減することが、本願発明の目的である。
植物の種子の供給源を提供する工程、
種子(複数可)を表面殺菌工程に付す工程、
表面殺菌種子(または複数)から種子胚(複数可)を単離する工程、および
人工種子(複数可)を形成するコーティングで胚(複数可)を被覆する工程、
を含む方法が提供される。
種子胚のソースを提供する工程
真菌エンドファイト等の1つ以上の共生生物を胚に接種する工程
接種された胚(複数可)をコーティングで被覆して人工種子(単数または複数)を形成する工程
を含んでもよい。
種子胚のソースを提供する工程
真菌ファイトなどの共生生物を含むコーティングで胚を被覆して人工種子(単数または複数)を形成する工程
を含んでもよい。
(a) 1つまたはそれ以上の共生生物が接種され、コーティングで被覆されてカプセル化された植物胚、および
(b)共生生物を含有するコーティング層で被覆された植物の胚
からなる群より選択される人工種子が提供される。
。
例えばNaOH、好ましくは弱いNaOH溶液等の、アルカリを用いて共生体からタンパク質を抽出するステップ、
ブラッドフォード(Bradford)アッセイなどの比色アッセイを用いた、タンパク質の定量、
を含む方法によって定量化することができる。
そのような真菌エンドファイトを接種した植物の胚等の共生生物を含む種子の供給源を提供すること、および
それに老化促進を適用することにより、植物-真菌エンドファイトの共生体等の植物/共生生物アソシエーション(すなわち共生体(symbiota))の適合性および/または安定性について、前記種子及び/又はそれらの子孫をスクリーニングすること、
を含む。
共生生物、例えば真菌エンドファイトを接種した植物胚を含む、種子の供給源を提供すること;
それに老化促進を適用することにより、植物-真菌エンドファイトの共生生物等の植物/共生生物アソシエーション(すなわち共生体(symbiota))の適合性および/または安定性について、前記種子及び/又はそれらの子孫をスクリーニングすること;および
選択された共生生物(シンビオータ)集団を、急速な、真菌エンドファイト等の共生生物(シンビオント)の生存率アッセイに付すこと;
を含む、植物-真菌エンドファイト共生体等の植物共生アソシエーション(すなわち複数の共生体(symbiotum))の適合性および/または安定性を評価することが含まれ得る。
種子を培養して小植物、実生または発芽種子を生成すること、
小植物、実生または発芽種子からDNAおよび/またはRNAを抽出すること;および
抽出したDNAおよび/またはRNAを植物体での、発現された真菌エンドファイト特異的遺伝子(複数可)等の、共生生物特異的遺伝子(複数可)についてのアッセイに供すること
が含まれる。
この作業の目的は、は、グラス(草)-エンドファイトの共生体の大規模生産のために、効率的な堅牢で低コストの方法を開発することであった。該方法は以下:
a)数百〜数千の草遺伝子型において数十〜数百のエンドファイトの接種に適用可能であり、
b)ペレニアルライグラス、トールフェスクおよびBrachiariaに適用できる;及び
c)新規に生成される遺伝的変異[すなわち、突然変異誘発の誘導(イオン化放射線、コルヒチン)、標的突然変異生成、トランスジェネシス、シスジェネシス、イントラジェネシスなど]を用いて新規エンドファイトおよびデザイナーエンドファイトの接種に適用可能である、
べきである。
1. ペレニアルライグラス種由来の胚の大規模単離および人工種子生産
A. 効率的、低コスト、大規模な種子の表面滅菌法を開発すること。
B. 効率的、低コスト、大規模な種子由来胚の分離法を開発すること。
C. 効率的、低コスト、大規模な人工種子生産方法を開発すること。
D. 人工種子の発芽率及び発芽段階を試験すること;
E. エンドファイトプラス種子から単離された胚を用いて生成された人工種子に由来する実生におけるエンドファイトの存在を評価すること。
F. 人工種子のための効率的、低コスト、大規模なエンドファイト接種方法を開発すること[二重/複数のコーティング(内側層プラスエンドファイト、‘疑似−アリューロン/胚乳’としての外側層)を含む人工種子生産が後に続く、種子に由来する胚のエンドファイト菌糸体での接種に基づく];および
G. 新規のエンドファイトを接種したエンドファイトマイナスの種子から単離された胚を用いて生成された人工種子に由来する実生におけるエンドファイトの存在を評価すること。
A)種子表面滅菌法
行われた種子表面滅菌法は、以下のステップを含む:
1日目:種子を一晩、10%硫酸に浸漬した。
2日目: 10%のDomestosで20分間処理し、滅菌蒸留水で洗浄した後に24℃で保存した。
3日目: 10%のDomestosで20分間処理し、滅菌蒸留水で洗浄した後に24℃で保存し、続いて胚を単離した[下のB)参照]。
成功している表面種子消毒法[上記A)参照)]に基づくと、ライグラス種子由来の1000の胚は、4時間以内に一人で単離することができる。
ペレニアルライグラスの胚のアルギン酸Caコーティングによる人工種子
i)追加された栄養素のないアルギン酸Caマトリックスでのコーティング
追加された栄養素のないアルギン酸Caマトリックスを有するコーティングを用いたペレニアルライグラス胚のアルギン酸Caコーティングによる人工種子のために、以下のステップが実施された:
・胚は新鮮に単離され、3%アルギン酸ナトリウム溶液と混合した。
・60rpmで攪拌しながら、アルギン酸滴を50mM塩化カルシウム溶液に入れた。各液滴には一つの胚が含まれている。
・15分間攪拌した後に人工種子を回収し、十分な滅菌蒸留水で洗浄した。
追加された栄養素を含むアルギン酸Caマトリックスを有するコーティングを用いたペレニアルライグラス胚のアルギン酸Caコーティングによる人工種子のために、以下のステップが実施された:
・胚を新鮮に単離し、MS(CaCl2を含まない)+ 750 mg / Lのグルタミン+5μΜのCuS04+ 1.95グラム/LのMESからなる改変MS培地中の3%アルギン酸ナトリウムと混合した。
・60rpmで攪拌しながら、アルギン酸滴を50mM塩化カルシウム溶液に入れた。
・各液滴には一つの種子に由来する単離された胚が含まれている。
・15分間攪拌した後に人工種子を回収し、十分な滅菌蒸留水で洗浄した。
・発芽のために人工種子をMS培地プレート上に置いた。
追加された栄養素を含む色付きのアルギン酸Caマトリックスを有するコーティングを用いたペレニアルライグラス胚のアルギン酸Caコーティングによる人工種子のために、以下のステップが実施された:
胚を新鮮に単離し、MS(CaCl2を含まない)+ 750 mg / Lのグルタミン+5μΜのCuS04+ 1.95グラム/LのMESからなる改変MS培地中の3%アルギン酸ナトリウムと混合した。
異なる食用色素[すなわち10μl/mlのクイーングリーン(90610)またはクイーンピンク(92330)]をアルギン酸ナトリウムコーティング溶液に添加してコーティングマトリックスを着色し、こうして多層コーティングの潜在的可能性を実証するための基礎を確立した。
60rpmで攪拌しながら、アルギン酸滴(個々の胚をコーティング含む)を50mM塩化カルシウム溶液に入れた。
各液滴には一つの種子に由来する単離された胚が含まれている。
15分間攪拌した後に人工種子を回収し、十分な滅菌蒸留水で洗浄した。
発芽のために人工種子をMS培地プレート上に置いた。
複数のアルギン酸Caマトリックスを有するコーティングを用いたペレニアルライグラス胚のアルギン酸Caコーティングによる人工種子のために、以下のステップが実施された:
・胚を新鮮に単離し、MS(CaCl2を含まない)+ 750 mg / Lのグルタミン+5μΜのCuS04+ 1.95グラム/LのMESからなる改変MS培地中の3%アルギン酸ナトリウムと混合した。
・60rpmで攪拌しながら、アルギン酸滴を50mM塩化カルシウム溶液に入れた。
・各液滴には一つの種子に由来する単離された胚が含まれている。
・15分間攪拌した後に層Aで被覆された人工種子を回収し、十分な滅菌蒸留水で洗浄した。層Aで新鮮に被覆された人工種子の平均直径は4mmである。層Aで被覆された人工種子をペトリ皿に置き、層流キャビネット内で1〜2時間空気乾燥に付した。空気乾燥された層Aで被覆された人工種子の直径は2mmである。
・空気乾燥された層Aで被覆された人工種子を、同じ手順で、二重コーティングされた人工種子を作るために第二の被覆層(B層)としての食用色素[すなわち10μl/mlのクイーングリーン(90610)]で着色された改変MS培地[MS(CaCl2を含まない)+ 750 mg / Lのグルタミン+5μΜのCuS04+ 1.95グラム/LのMESからなる]中の3%アルギン酸ナトリウムと混合した。
人工種子の発芽率を評価するために、以下のステップが実施された。
種子発芽率は以下について比較して評価した(図5):
a)元の種子:ろ紙上での発芽率1%。
b)表面殺菌した種子:ろ紙上での発芽率10%。
c)単離された胚:発芽培地上での発芽率48%。
d)人工種子(発芽培地で):MS培地上での発芽率40%。
種子発芽率は以下について比較して評価した(図6):
a)元の種子:ろ紙上での発芽率10%。
b)表面殺菌した種子:ろ紙上での発芽率30%。
c)単離された胚:発芽培地上での発芽率90%。
d)人工種子(発芽培地で):MS培地上での発芽率81%。
人工種子由来の実生中のエンドファイトの存在を評価するために、以下のステップが実施された:
ろ紙上で発芽したBronsyn E+(2667)種子の実生20本を土壌に移植した。
ペレニアルライグラスの人工種子におけるエンドファイトの大規模接種のための、下記方法1〜3の例のように、異なる方法が開発された。
方法1、ペレニアルライグラスにおけるエンドファイト菌糸体を用いた単離種子由来胚の接種およびエンドファイト感染人工種子の産生は、以下の通り、アルギン酸Ca被覆前のエンドファイト懸濁液を用いた単離胚の直接接種に基づく:
方法2、ペレニアルライグラスにおけるエンドファイト菌糸体を用いた単離種子由来胚の接種およびエンドファイト感染人工種子の産生は、以下の通り、エンドファイト含有アルギン酸Ca層を用いた単離胚の直接被覆に基づく:
ペレニアルライグラスの胚を、96ウェルプレートの個々のウェルのエンドファイト懸濁液(1/16希釈)中に新たに単離した。
人工種子をエンドファイト層被覆胚で産生する(図11)。
96ウェルプレートの個々のウェル中で、ペレニアルライグラスの胚を新たに単離し、アルギン酸Caを含むエンドファイト懸濁液(1/8または1/16希釈)で被覆し、次いで、添加して胚を被覆するエンドファイト含有アルギネート層を生成する。
方法3、ペレニアルライグラスにおけるエンドファイト菌糸体を用いた単離種子由来胚の接種およびエンドファイト感染人工種子の産生は、以下の通り、エンドファイト接種単離胚から生成される人工種子の二重被覆に基づく:
方法1を使用して新規エンドファイト(例えば、NEA11)を接種した種子由来胚を有する人工種子に由来する実生中のエンドファイトの存在を評価するために、以下の実験を行った:
人工種子に由来する実生を6週間成長させた後、エンドファイトの存在を、エンドファイト特異的SSR試験に基づいて評価した。
ペレニアルライグラス人工種子におけるコルヒチン処理による突然変異誘発の誘導(例えば、NEA12dh17)またはX線突然変異誘発(例えば、IRM1-35)に由来するデザイナーエンドファイトの大規模接種を、上述した方法1〜3を使用して実施する。
ペレニアルライグラス人工種子中でDsRed蛍光マーカー遺伝子(例えば、NEA12-DsRed)を発現させるために、キメラ遺伝子を含有するプラスミドを用いたNEA12エンドファイトの遺伝子形質転換に由来するトランスジェニックエンドファイトの大規模接種を、上述した方法1を使用して実施する。
トールフェスク人工種子におけるトールフェスクに由来する新規エンドファイト(例えば、NEA17、NEA19、NEA20)の大規模接種を、上述した方法1を使用して実施する。
本実施例では、方法1(直接接種)または方法2(エンドファイト含有アルギン酸Ca層での被覆)を使用する接種の前に、皮下針でペレニアルライグラスの単離胚に穿刺した後のエンドファイト接種頻度の増強を記載する。
本実施例では、方法1(直接接種)または方法2(エンドファイト含有アルギン酸Ca層での被覆) を使用する接種の前に、皮下針でペレニアルライグラス(ホソムギ)およびトールフェスク(オニウシノケグサ)の単離胚に穿刺した後のエンドファイト接種頻度の増強を記載する。
方法2:エンドファイト含有アルギン酸Ca層での単離胚の直接被覆
Claims (18)
- 人工種子を調製する方法であって、
植物種子の源を準備する工程と、
種子を表面滅菌工程に付す工程と、
表面滅菌した種子から種子胚を単離する工程と、
種子胚に1種または複数の共生生物を接種し、接種した種子胚をコーティングで被覆して人工種子を形成する工程と
を含み、
被覆の前に種子胚に1種または複数の共生生物を接種する、方法。 - 種子胚にエンドファイト菌糸体を直接接種する、請求項1に記載の方法。
- 人工種子が第2のコーティング層をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 第2のコーティング層が追加された栄養素を含む、請求項3に記載の方法。
- 第2のコーティング層が養分欠乏層である、請求項3に記載の方法。
- 植物種子が牧草及びマメ科からなる群より選択される植物に由来する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 種子胚の集団に共生生物の集団が接種される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 方法がさらに、
人工種子を育成して小植物または実生を形成する工程;および
共生生物の存在について小植物または実生をスクリーニングする工程
を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。 - スクリーニング工程が、人工種子および/またはそれらの子孫を、適合性および/または安定性について、老化促進によってスクリーニングし、所望の特徴を示す共生体を選択することを含む、請求項8に記載の方法。
- 選択された共生体を迅速なエンドファイト生存能アッセイに付す工程をさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 1種または複数の共生生物が真菌エンドファイトである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 種子胚を処理して、1種または複数の共生生物の1つまたは複数の侵入点を創製する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 1種または複数の共生生物で接種された種子胚からなり、コーティングで被覆して前記胚をカプセル化している、人工種子であって、被覆の前に種子胚に1種または複数の共生生物が接種されたものである、人工種子。
- 第2のコーティング層で被覆されている、請求項13に記載の人工種子。
- 第2のコーティング層が追加された栄養素を含む、請求項14に記載の人工種子。
- 第2のコーティング層が養分欠乏層である、請求項14に記載の人工種子。
- 種子胚が牧草及びマメ科からなる群より選択される植物に由来する、請求項13〜16のいずれか一項に記載の人工種子。
- 1種または複数の共生生物が真菌エンドファイトである、請求項13〜17のいずれか一項に記載の人工種子。
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