CN110771509B - 一种甘草人工种子及其培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种甘草人工种子及其培养方法。本发明将无菌的甘草茎段放入到人工胚乳中混合均匀，然后用吸管每次吸取一个繁殖体，滴到人工种皮上进行离子交换反应15min，然后以无菌水漂洗20min，终止反应。捞起晾干。移栽时，采用木屑：腐殖土：珍珠岩＝1：2：1作为移栽基质，进行室内炼苗移栽。本发明首次进行人工种子的研制，以甘草茎段为繁殖体，研究不同种类的人工种皮、人工胚乳成分，建立起甘草人工种子技术体系。该甘草人工种子稳定性好，制作较为简便，出苗率高，为甘草苗木快繁奠定基础。

Description

一种甘草人工种子及其培养方法
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种甘草人工种子。
背景技术
植物人工种子(Artificial seeds)或合成种子(Synthetic seeds)即人为制造的种子。人工种子技术是在植物离体培养技术基础上发展起来的一门新兴技术。人工种子是一种含有植物胚状体或芽等繁殖体、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。人工种子的概念最早是由Murashige于1978年第4届国际植物组织细胞培养大会上提出的。Murashige认为随着植物组织培养技术的不断发展，可以用少量的外植体同步培养出众多的胚状体，这些胚状体被包埋在某种胶囊内使其具有种子的功能，可以直接用于田间播种。1985年，日本学者Kamada将人工种子的概念延伸，他认为使用适当的方法包埋由组织培养所产生的具有发育成完整植株的分生组织(芽，愈伤组织，胚状体和生长点等)，可取代天然种子用于播种的颗粒体均可称为人工种子。1995年，中国科学家陈德富等将人工种子的概念进一步扩展，他们认为植物离体培养中产生的体细胞胚或能发育成完整植株的分生组织(如胚状体、芽和茎段等)，包埋在含有营养物质和具有保护功能的外壳内，形成的在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体均可称之为人工种子。近年来，该概念已从狭义的体细胞胚的包被发展到对任何合适的植物繁殖体的包被，如不定芽、块茎、腋芽、芽尖、原球茎、愈伤组织和发根等繁殖体的包被。
甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)是豆科(Leguminosea)甘草属(Glycyrrhiza)的多年生草本植物，以根和根茎入药。主要产于东北、河北、山西、内蒙古、陕西、甘肃、青海和新疆等地。从古至今，甘草一直被使用，即为大宗药材。同时，甘草还是我国西北地区重要的固沙植物。建国以来，甘草的需求量更是大幅度的增长。多年来，甘草药物主要依靠野生资源，但近年来，由于对甘草的无节制采挖，使我国的甘草资源受到了严重破坏。甘草的人工繁殖方式通常以播种繁殖为主，造成出苗不齐，出苗率较低，后代长势差异较大，不利于管理。人工种子可以提供一种快速繁殖甘草苗木的途径，且可弥补上述不足。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明根据种子主要结构及其功能，并基于植物组织培养的基本原理，人工合成甘草种子。本发明提供了一种甘草人工种子及其制备方法。本发明采用如下技术方案：
在超净工作台上，将无菌的甘草茎段放入到人工胚乳中混合均匀，该人工胚乳的配方是：MS+13.5mg/LKH2PO4+3％蔗糖，然后用吸管每次吸取一个繁殖体，滴到人工种皮上进行离子交换反应15min，该人工种皮的配方按质量百分比具体为：3％海藻酸钠+2％CaCl2+5％纤维素+1％半纤维素，然后以无菌水漂洗20min，终止反应。捞起晾干。移栽时，采用木屑：腐殖土：珍珠岩＝1：2：1作为移栽基质，进行移栽炼苗，保持基质湿润，空气湿度在80％左右，每天喷水4～5次，进行室内炼苗移栽。
进一步的，所述的人工胚乳在本发明中的作用是包埋剂，该人工胚乳筛选具体过程为：首先进行最适生根培养基的筛选，将最适生根培养基去除琼脂作为人工胚乳。以MS、1/2MS、1/4MS为基本培养基，设定KH2PO4浓度为：7～20mg/L；蔗糖浓度为：1～5％；琼脂浓度均为7％。作3因素3水平正交设计，不考虑交互作用，通过正交试验筛选人工胚乳配方。以茎段生根率为筛选指标。
进一步的，所述的人工种皮在本发明中的作用是凝固剂，该人工种皮的筛选具体过程为：以甘草茎段为繁殖体，MS+13.5mg/LKH2PO4+3％蔗糖为人工胚乳，进行适宜的人工种皮的筛选。人工种皮以浓度为1％～5％的海藻酸钠、浓度为1％～3％的CaCl2、浓度为1％～5％的纤维素和浓度为1％～5％的半纤维素溶液相互配合。作4因素3水平正交设计，不考虑交互作用，通过正交试验筛选人工种皮。以人工种子在MS培养基上的萌发率为筛选指标。
进一步的，所述的移栽基质的筛选具体过程为：采用碎木屑、腐殖土、珍珠岩三种基质按不同比例配比(1～5：1～5：1～5)。进行移栽炼苗，保持基质湿润，空气湿度在70-90％，优选80％，每天喷水4～5次，进行室内炼苗移栽，考查上述配比时，人工种子的移栽成活率。每个处理每盆移栽10粒种子，设置5次重复。
本发明首次进行人工种子的研制，以甘草茎段为繁殖体，研究不同种类的人工种皮、人工胚乳成分，建立起甘草人工种子技术体系。该甘草人工种子稳定性好，制作较为简便，出苗率高，为甘草苗木快繁奠定基础。
附图说明
图1甘草人工种子。
图2人工种子萌芽状。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
下述实施例中，首先进行人工胚乳的筛选，具体实验过程如下：
1.人工胚乳的筛选
首先进行最适生根培养基的筛选，将最适生根培养基去除琼脂作为人工胚乳。以MS、1/2MS、1/4MS为基本培养基，设定KH2PO4浓度为：7～20mg/L；蔗糖浓度为：1～5％；琼脂浓度均为7％。作3因素3水平正交设计，不考虑交互作用，通过正交试验筛选人工胚乳配方。以茎段生根率为筛选指标(见表1-1)。
实验设计：人工胚乳中，基本培养基为MS(A1)、1/2MS(A2)、1/4MS(A3)；KH2PO4浓度设计为7mg/L(B1)、13.5mg/L(B2)、20mg/L(B3)蔗糖浓度设计为1％(D1)、3％(D2)、5％(D3)。采取正交设计的方法，实验处理组合共9个，每个处理设5次重复。即：A1B1C1处理1、A1B2C2处理2、A1B3C3处理3、A2B1C2处理4、A2B2C3处理5、A2B3C1处理6、A3B1C3处理7、A3B2C1处理8、A3B3C2处理9。
表1-1不同处理的生根率(％)
Figure BDA0002289439510000031
表1-2对表1-1结果的方差分析
变异来源 自由度 平方和 均方 F值 F0.05 F0.01
处理间 8 2400.00 300.00 3.75** 2.21 3.05
误差 36 2880.00 80.00
总变异 44 5280.00
表1-3对表1-1数据的差异显著性检验
处理 平均数 5％差异 1％差异
处理2 90.00 a A
处理1 78.00 b AB
处理3 76.00 b AB
处理9 72.00 b B
处理6 70.00 b B
处理5 68.00 b B
处理7 68.00 b B
处理8 66.00 b B
处理4 66.00 b B
实验结果：处理组合A1B2C2(即：MS+13.5mg/L KH2PO4+3％蔗糖)是最适宜的生根培养基，在该培养基上生根率最大。
2.人工种皮的筛选
以甘草茎段为繁殖体，MS+13.5mg/L KH2PO4+3％蔗糖为人工胚乳，进行适宜的人工种皮的筛选。人工种皮以浓度为1％～5％的海藻酸钠、浓度为1％～3％的CaCl2、浓度为1％～5％的纤维素和浓度为1％～5％的半纤维素溶液相互配合。作4因素3水平正交设计，不考虑交互作用，通过正交试验筛选人工种皮。以人工种子在MS培养基上的萌发率为筛选指标(见表2-1)。
实验设计：人工种皮中，海藻酸钠浓度为1％(A1)、3％(A2)、5％(A3)；CaCl2浓度为1％(B1)、2％(B2)、3％(B3)；纤维素浓度为1％(C1)、3％(C2)、5％(C3)；半纤维素浓度为1％(D1)、3％(D2)、5％(D3)。采取正交设计的方法，实验处理组合共9个，每个处理设5次重复。即：
A1B1C1D1处理1
A1B2C2D2处理2
A1B3C3D3处理3
A2B1C2D3处理4
A2B2C3D1处理5
A2B3C1D2处理6
A3B1C3D2处理7
A3B2C1D3处理8
A3B3C2D1处理9
表2-1不同处理的萌发率(％)
Figure BDA0002289439510000051
表2-2对表2-1结果的方差分析
变异来源 自由度 平方和 均方 F值 F0.05 F0.01
处理间 8 3297.78 412.22 4.95** 2.21 3.05
误差 36 3000.00 83.33
总变异 44 6297.78
表2-3对表2-1数据的差异显著性检验
处理 平均数 5％差异 1％差异
处理5 94.00 a A
处理4 84.00 ab AB
处理6 82.00 abc ABC
处理7 74.00 bcd BC
处理3 72.00 bcd BC
处理8 72.00 bcd BC
处理2 70.00 cd BC
处理1 68.00 d BC
处理9 66.00 d C
实验结果：处理组合A2B2C3D1(即：3％海藻酸钠+2％CaCl2+5％纤维素+1％半纤维素)是最适宜的人工种皮配方。
3.移栽基质的筛选
采用碎木屑、腐殖土、珍珠岩三种基质按不同比例配比(1～5：1～5：1～5)。进行移栽炼苗，保持基质湿润，空气湿度在80％左右，每天喷水4～5次，进行室内炼苗移栽。
实验设计：移栽基质中，碎木屑、腐殖土、珍珠岩三种基质采用了三种配比，即碎木屑：腐殖土：珍珠岩＝5：1：1、碎木屑：腐殖土：珍珠岩＝1：2：1和碎木屑：腐殖土：珍珠岩＝1：1：5。考查上述三种配比时，人工种子的移栽成活率(见表3-1)。每个处理每盆移栽10粒种子，设置5次重复。
表3-1不同配比基质上移栽成活率(％)
Figure BDA0002289439510000061
Figure BDA0002289439510000071
表3-2对表3-1的方差分析
变异来源 自由度 平方和 均方 F值 F0.05 F0.01
处理间 2 1373.33 686.67 10.30** 3.89 6.93
误差 12 800.00 66.67
总变异 14 2173.33
表3-3对表3-1数据的差异显著性检验
处理 平均数 5％差异 1％差异
处理2 78.00 a A
处理3 60.00 b B
处理1 56.00 b B
实验结果：碎木屑：腐殖土：珍珠岩＝1：2：1的配比是最佳基质，在该基质上移栽成活率最大。
实施例1
在超净工作台上，将无菌的甘草茎段放入到包埋剂(人工胚乳，配方是：MS+13.5mg/L KH2PO4+3％蔗糖)中，混合均匀，然后用吸管每次吸取一个繁殖体，滴到凝固剂(人工种皮，配方是：3％海藻酸钠+2％CaCl2+5％纤维素+1％半纤维素)中进行离子交换反应15min。而后以无菌水漂洗20min，终止反应。捞起晾干。移栽时，采用木屑：腐殖土：珍珠岩＝1：2：1作为移栽基质，进行移栽炼苗，保持基质湿润，空气湿度在80％左右，每天喷水4～5次，进行室内炼苗移栽。
实施例2
在超净工作台上，将无菌的甘草茎段放入到包埋剂(人工胚乳，配方是：MS+7mg/LKH2PO4+1％蔗糖)中，混合均匀，然后用吸管每次吸取一个繁殖体，滴到凝固剂(人工种皮，配方是：5％海藻酸钠+3％CaCl2+3％纤维素+5％半纤维素)中进行5min离子交换反应。而后以无菌水漂洗10min，终止反应。捞起晾干。移栽炼苗时三种基质碎木屑、土壤、珍珠岩的比例为5：1：1，保持基质湿润，空气湿度在80％左右，每天喷水4～5次，进行室内炼苗移栽。
实施例3
在超净工作台上，将无菌的甘草茎段放入到包埋剂(人工胚乳，配方是：MS+20mg/LKH2PO4+5％蔗糖)中，混合均匀，然后用吸管每次吸取一个繁殖体，滴到凝固剂(人工种皮，配方是：1％海藻酸钠+1％CaCl2+1％纤维素+3％半纤维素)中进行离子交换反应10min。而后以无菌水漂洗15min，终止反应。捞起晾干。移栽炼苗时三种基质碎木屑、土壤、珍珠岩的比例为1：1：5，保持基质湿润，空气湿度在80％左右，每天喷水4～5次，进行室内炼苗移栽。
以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种甘草人工种子培养方法，其特征在于，在超净工作台上，将无菌的甘草茎段放入到人工胚乳中混合均匀，该人工胚乳的配方是：MS+13.5mg/L KH2PO4+3％蔗糖，然后用吸管每次吸取一个繁殖体，滴到人工种皮上进行离子交换反应15min，该人工种皮的配方按质量百分比具体为：3％海藻酸钠+2％CaCl2+5％纤维素+1％半纤维素，然后以无菌水漂洗20min，终止反应，捞起晾干，移栽时，采用木屑：腐殖土：珍珠岩＝1：2：1作为移栽基质，进行移栽炼苗，保持基质湿润，空气湿度在80％左右，每天喷水4～5次，进行室内炼苗移栽。
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