CN105850736B - 一种仙茅人工种子的制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种仙茅人工种子的制作方法，包括仙茅愈伤组织的诱导，仙茅不定芽的诱导，仙茅不定芽的筛选，仙茅不定芽的包埋和人工种子的制备步骤。本发明制作的人工种子，萌发率高，成苗率高。相比天然种子，人工种子不受季节的限制，可应用于大规模的批量生产。
Description
技术领域
本发明属于人工种子制备领域，具体涉及一种仙茅人工种子的制作方法。
技术背景
仙茅(Curculigo orchioides Gaertn.)为仙茅科仙茅属植物，是一种极其珍贵的药用植物。通过文献查考，认为仙茅最早记载于一千多年前的《海药本草》，古今用药种类基本一致。以仙茅的干燥根茎入药，其功效在中医古籍中多为补肾壮阳为主，近年研究发现其功效还包括壮筋骨、抗炎症、抗氧化、耐缺氧、耐高温等。
仙茅自然繁殖率低，加之长期无节制采挖，其野生资源日益减少；传统的繁殖方式如分株、扦插等繁殖率也较低；组织培养技术能在一定程度上解决快速繁殖的难题，但是依然存在转接次数多、生产周期长、成本高、移栽成活率低等问题。人工种子是将离体产生的体细胞胚或其它繁殖体包埋在能提供养分的胶囊里，又在胶囊外包上具有保护功能的外膜，形成类似于种子的结构。1978年，美国科学家Murashige在国际园艺植物学术会议首次提出了人工种子的概念。它是在植物离体培养技术基础上发展来的一门新兴技术，是细胞工程中最年轻的一项技术。人工种子可以不受季节、环境各方面天然条件的限制，来进行大规模大批量高效制作生产，使得农业生产的择时播种成为可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种萌发率高、成苗率高的仙茅人工种子的制作方法，通过本发明可大规模批量生产仙茅种子，为解决仙茅资源紧张问题提供技术支持。
本发明采用的具体技术方案如下:一种仙茅人工种子的制作方法,包括仙茅愈伤组织的诱导、仙茅不定芽的诱导、仙茅不定芽的筛选以及仙茅不定芽的包埋和人工种子的制备步骤，仙茅不定芽的包埋和人工种子的制备过程中，仙茅不定芽在包埋液中反应后再与质量浓度为2％的CaCl2溶液反应，上述反应重复一次；
其中，所述的包埋液是以1/2MS+0.8mg/L NAA+0.05mg/L6-BA+3％蔗糖+3mg/L多菌灵为人工胚乳，在其中加入4％海藻酸钠熬制而成。
本发明进一步包括以下优选方案：
优选的方案中，仙茅不定芽的包埋和人工种子的制备过程为：将不定芽加入灭菌过的包埋液中，搅拌充分混合，3分钟后，将含有不定芽的包埋液滴入到质量浓度为2％的CaCl2溶液中，反应5分钟，形成透明有弹性的人工种子，将制作的人工种子再放入人工胚乳中，搅拌充分混合，3分钟后，用玻璃棒将含有不定芽的包埋液，拨入到质量浓度为2％的CaCl2溶液中，反应10分钟。
优选的方案中，含有不定芽的包埋液滴入到质量浓度为2％的CaCl2溶液的过程中，用内径为3mm的吸管吸取包含有不定芽的包埋液。
仙茅愈伤组织的诱导过程中，切取长为4-6mm的仙茅幼叶，接种到MS+1.5mg/LKT+0.05mg/L2,4-D+3.0％蔗糖+0.7％琼脂+3mg/L多菌灵+8mg/L柠檬酸培养基中进行仙茅愈伤诱导培养。
优选的方案中，仙茅不定芽的诱导过程中，把得到的愈伤组织转移到MS+3.0％蔗糖+0.7％琼脂+3mg/L多菌灵分化培养基中，进行不定芽的诱导。
优选的方案中，仙茅不定芽的选择过程中，选出长度为2-3mm的不定芽。
优选的方案中，仙茅愈伤组织的诱导过程中，培养温度25±1℃，光照强度1100-1200lx，光照时间10-12h。
优选的方案中，仙茅不定芽的诱导过程中，培养温度25±1℃，光照强度1100-1200lx，光照时间12-14h。
优选的方案中，种子发芽时：培养温度26±1℃，光照强度1100-1200lx，黑暗处理3-5天，发芽后光照时间为12-14h。
本发明通过人工的方法制备种子可以代替天然种子，可不受季节限制，大规模大批量高效生产人工种子，可实现择时播种，为仙茅资源开发提供技术保证。
本发明的萌发率高、成苗率高。
本发明的仙茅种子发芽生根率高、染菌率低、失水率低。
本发明得到的种子颗粒均匀，软硬适中，呈球形，透明有弹性。
附图说明
图1为本发明仙茅幼叶诱导出的愈伤组织的照片。
图2为本发明仙茅愈伤组织诱导出的不定芽的照片。
图3为本发明仙茅不定芽包裹一层包埋液制作的人工种子的照片。
图4为本发明仙茅不定芽包裹两层包埋液制作的人工种子的照片。
图5为仙茅人工种子发芽初期的照片。
图6为仙茅人工种子发芽中期的照片。
图7为仙茅人工种子发芽后的植株种植在土壤中，置于外界环境中的照片。
图8为仙茅人工种子植株二个月后在外界环境中生长状况的照片。
具体实施方式
以下实施例旨在对本发明进行进一步说明，但本发明并不限于下述实施例。
实施例1
第一步、诱导愈伤组织选取广东省中华仙茅健壮植株的幼叶，将叶子用清水洗净，用流动水冲洗两小时。在超净工作台中，用75％的酒精消毒10s，无菌水冲洗3次。然后将叶片放入0.1％升汞溶液中灭菌10min，无菌水冲洗5次，用灭菌的滤纸吸干表面水分。在超净工作台上，用消过毒的手术刀将叶片切成5mm左右大小，用灭菌的镊子将叶片接种到愈伤组织诱导培养基(以MS培养基为基本培养基，1.5mg/LKT，0.1mg/L2,4-D，8mg/L柠檬酸，3.0％蔗糖，0.7％琼脂，3mg/L多菌灵，pH值为5.8。
第二步、诱导不定芽在组培室中培养50天左右出现愈伤组织，将愈伤组织在无菌条件下转移到分化培养基(以MS培养基为基本培养基，3％蔗糖，0.7％琼脂，3mg/L多菌灵，pH值为5.8)上，培育20天后出现大量不定芽，在无菌条件下选出长度为2-3mm的不定芽。
第三步、制作人工种子将不定芽放在灭菌过的包埋液中，包埋液是以1/2MS+0.8mg/L NAA+0.05mg/L 6-BA+3mg/L多菌灵为人工胚乳，加入3％的海藻酸钠熬制而成。搅拌充分混合；3分钟后，用内径为3mm的吸管吸取包含有不定芽的包埋液，滴入到质量浓度为2％的CaCl2溶液中，反应5分钟，形成透明有弹性的人工种子，取出所述人工种子并在无菌水中清洗两遍。
第四步、二次包膜取出一半的人工种子，再放入人工胚乳中，搅拌充分混合，进行二次包裹。3分钟后，用玻璃棒将含有不定芽的包埋液，拨入到质量浓度为2％的CaCl2溶液中，反应10分钟，形成透明有弹性的人工种子，取出所述人工种子并在无菌水中清洗两遍，用滤纸吸干所述人工种子上的液体。
第五步、测定失水率和发芽率将人工种子放在培养皿上，15天后测量失水率、发芽率。包裹一层膜的人工种子失水率为53.03％，发芽率为79％。包裹两层膜的人工种子失水率为23.58％，发芽率达到93％。
表1 不同激素配比对仙茅幼叶愈伤组织诱导的影响
表2 不同激素配比对人工种子发芽生根率及多菌灵对染菌率的影响
| 编号 | 6-BA(mg/L) | NAA(mg/L) | 多菌灵(mg/L) | 发芽生根率(％) | 染菌率(％) |
| 1 | 0.01 | 0.4 | 1 | 74 | 30 |
| 2 | 0.01 | 0.8 | 2 | 81 | 21 |
| 3 | 0.01 | 1.6 | 3 | 60 | 12 |
| 4 | 0.05 | 0.4 | 2 | 66 | 24 |
| 5 | 0.05 | 0.8 | 3 | 93 | 15 |
| 6 | 0.05 | 1.6 | 1 | 79 | 29 |
| 7 | 0.1 | 0.4 | 3 | 54 | 11 |
| 8 | 0.1 | 0.8 | 2 | 72 | 20 |
| 9 | 0.1 | 1.6 | 1 | 58 | 29 |
| 10 | 0.5 | 0.4 | 1 | 43 | 31 |
| 11 | 0.5 | 0.8 | 2 | 51 | 25 |
| 12 | 0.5 | 1.6 | 3 | 68 | 13 |
表3 不同浓度包埋剂及反应时间对种人工种子形态的影响
用3％的海藻酸钠与2％的CaCl2制作的人工种子测试失水率
将制作好的人工种子置于铺有无菌水浸润滤纸的培养皿中，培养温度(25±1)℃，每天光照12h，光照强度1 200～1500lx。观察人工种子形态并每5d测量1次失水率，实验重复三次。
失水率＝贮藏前的质量-贮藏后的质量/贮藏前的质量×100％
表4 包埋次数对人工种子失水率的影响
Claims (3)
1.一种仙茅人工种子的制作方法，其特征在于，包括仙茅愈伤组织的诱导、仙茅不定芽的诱导、仙茅不定芽的筛选以及仙茅不定芽的包埋和人工种子的制备步骤，仙茅不定芽的包埋和人工种子的制备过程为：将不定芽加入灭菌过的包埋液中，搅拌充分混合，3分钟后，将含有不定芽的包埋液滴入到质量浓度为2％的CaCl2溶液中，反应5分钟，形成透明有弹性的人工种子，将制作的人工种子再放入人工胚乳中，搅拌充分混合，3分钟后，用玻璃棒将含有不定芽的包埋液，拨入到质量浓度为2％的CaCl2溶液中，反应10分钟；其中，所述的包埋液是以1/2MS+0.8mg/L NAA+0.05mg/L 6-BA+3％蔗糖+3mg/L多菌灵为人工胚乳，在其中加入3％海藻酸钠熬制而成；
仙茅愈伤组织的诱导过程中，切取长为4-6mm的仙茅幼叶，接种到MS+1.5mg/LKT+0.1mg/L2,4-D+3.0％蔗糖+0.7％琼脂+3mg/L多菌灵+8mg/L柠檬酸培养基中进行仙茅愈伤诱导培养；
仙茅愈伤组织的诱导过程中，培养温度25±1℃，光照强度1100-1200lx，光照时间10-12h；
仙茅不定芽的诱导过程中，把得到的愈伤组织转移到MS+3.0％蔗糖+0.7％琼脂+3mg/L多菌灵分化培养基中，进行不定芽的诱导；
仙茅不定芽的诱导过程中，培养温度25±1℃，光照强度1100-1200lx，光照时间12-14h。
2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，仙茅不定芽的选择过程中，选出长度为2-3mm的不定芽。
3.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，含有不定芽的包埋液滴入到质量浓度为2％的CaCl2溶液的过程中，用内径为3mm的吸管吸取包含有不定芽的包埋液。
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