CN106577273B - 一种铁甲秋海棠叶片离体再生体系建立的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铁甲秋海棠叶片离体再生体系建立的方法,其特征在于:包括如下步骤:外植体的选取与消毒、不定芽诱导、不定芽继代获得试管苗、根的诱导、移栽。采用该繁殖方法对铁甲秋海棠进行组织培养,一个培养周期增殖率为1200倍以上,繁殖速度快,有效解决了铁甲秋海棠种苗繁殖的难题。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种铁甲秋海棠(Begonia masoniana)组织培养的繁殖方法。
背景技术
铁甲秋海棠(Begonia masoniana),秋海棠科(Begoniaceae)秋海棠属(Begonia)多年生草本观叶植物,原产巴西东部一带,叶形优美,叶色绚丽,是室内极好的观叶植物。性喜温暖、湿润、半阴及空气湿度大的环境,忌强光直射。生长适温为22-25℃,不耐高温,气温超过32℃则生长缓慢。
铁甲秋海棠,根茎肥厚,粗短,叶轮廓斜宽卵形至斜近圆形,边缘有密、微凸起的长芒之齿。上面深绿色,有浅色斑纹,下面淡褐绿色。叶和叶柄上密生茸毛,花较小,为黄色。5-7月开花,聚伞花序,花朵饱满呈水红色,袅娜娇艳,亦颇具观赏价值。
然而,作为秋海棠属植物的一种,其种子不易获得,有性繁殖能力弱,且后代多变异,优良性状难以保持。且播种繁殖常用与国内外引种、品种改良和规模性商品生产,播种常规引种以春季4-5月或秋季9-10月为宜。因种子特别细小,播种时需谨慎操作,植物组织培养技术作为当代新兴的生物技术方法之一,具有繁殖系数高、遗传性状稳定、不受季节限制等诸多优点,因而十分适用于优秀观赏植物的推广繁殖,目前已广泛应用于马蹄莲、兰花、菊花、月季等观赏植物的再生产,秋海棠属植物中也有许多品种组培成功。但关于铁甲秋海棠组织培养的报道较少,偶有关于秋海棠属植物的组培报道,何勇等通过蟆叶秋海棠的幼嫩叶片外植体进行组织培养,得出了再生植株,但只是重点研究了愈伤组织的诱导试验,并没有对增殖方法进行摸索(《蟆叶秋海棠离体培养的研究》,湖北农业科学,2009年第8期,1814-1816页),与之前秋海棠相关的申请专利201010504126比较,扦插时间较长,且增殖率较低。徐菲等曾发表文章《蟆叶秋海棠“光灿”组织培养技术研究》,江西农业科学,2011年12期,然而,其整体增殖率较低,一个培养周期增殖率仅为100倍,且周期相对较长。虽然蟆叶秋海棠和铁甲秋海棠均为秋海棠属植物,但品种形态差异较大,套用组培繁殖技术比较困难,而现有报道中未见铁甲秋海棠的组培繁殖技术的研究,现亟需一种铁甲秋海棠高效离体快繁方法,用以推广该优良品种。
发明内容
本发明的目的是为了建立铁甲秋海棠组织培养繁殖体系。
为了达到上述目的,本发明提供了一种铁甲秋海棠叶片离体再生体系建立的方法,包括如下步骤:
(1)外植体的选取与消毒:选取完全展开的成熟健壮叶片作为外植体,冲洗干净后,进行消毒,消毒过程为:先以适量洗涤剂溶液振荡清洗15min,再用自来水流水冲洗40min,取出后于无菌操作台上,用75%酒精消毒10s,立即转入含有0.1%的升汞溶液中消毒25min,再以无菌水冲洗5-6次,每次1min,消毒滤纸吸干表面水分,将叶片边缘切除后切成3-4cm2的方形小块。
(2)不定芽的诱导:取步骤(1)中处理得到的外植体方形小块,将叶片平铺接种于诱导培养基中进行不定芽的诱导,培养温度为25±2℃,进行暗光照培养20d;所述暗光照培养条件为:光照时间为14h/d,光照强度为1000lx;所述诱导培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.5mg/L DA-6,pH值为5.8-6.0;
(3)不定芽继代获得试管苗:将诱导得到的不定芽切分后,接入壮苗培养基中进行继代培养30d,培养温度为25±2℃,光照时间为14h/d,光照强度为1500lx;所述继代壮苗培养基为MS+0.4 mg/L IBA,pH值为5.8-6.0;一般需要2~3个继代周期(40d左右)使不定芽长成大苗。
(4)根的诱导:将步骤(3)中得到的铁甲秋海棠试管苗接入生根培养基中进行生根培养10d,培养温度为25±2℃,光照时间为14h/d,光照强度为1500lx;所述生根培养基为1/2MS+0.5 mg/L IBA,pH值为5.8-6.0;待不定根长至3cm左右,植株整体生长稳健时,可准备移苗出瓶。
(5) 将培养瓶移出组培室,将瓶盖打开,组培苗炼苗2-3天,将组培苗的根浸泡在复合微生物制剂中,10min,移栽入基质中,所述基质优选为:按照2:1的体积比例将泥炭土和珍珠岩混匀。
所述复合微生物制剂为:按照淡紫灰链霉菌发酵液:黄绿木霉发酵液:假丝酵母菌发酵液:粪产碱杆菌发酵液:草炭:磷酸氢二钠重量比=1:2:3:2:4:1
所述淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)为CGMCC NO.2130;
所述黄绿木霉为黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)ACCC32248
所述假丝酵母菌具体为假丝酵母菌(Candida utilis)ATCC No.22023;
所述粪产碱杆菌为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 31555。
首先将淡紫灰链霉菌、黄绿木霉、假丝酵母菌、粪产碱杆菌分别按照常规方式活化,然后培养至菌液中活菌数达到107个/克获得发酵液,将上述发酵液按照质量比例1:2:3:2混合,按照重量配比添加草炭、磷酸氢二钠即得。
对于本发明的进一步改进在于,所述步骤(1)中外植体的选取及选取时间:以完全展开的成熟健壮叶片为外植体,在诱导15-20天后即可有效获得大量不定芽,数量多且生长迅速;在3-4月份进行外植体选取和消毒,污染率大大降低。
本发明铁甲秋海棠叶片离体再生体系建立的方法具有以下优点:
组织培养方法其步骤都具有相似性,其结果却具有显著的不同,本申请发明人经过反复实验得出,铁甲秋海棠在初代诱导不定芽的阶段,较弱光照1000lx的暗光培养能够使外植体迅速分裂,获得大量不定芽;后期再采用1500lx的光照强度进行壮苗效果最佳。采用1000lx的光照强度能够诱导出不定芽,强光照会大大抑制不定芽的形成。这可能是由于铁甲秋海棠野生生境为阴暗潮湿条件形成的。
本领域公知,对于植物组培领域研究如何利用植物组织分化再生植株,提高植物的繁殖数量,是科学家研究重要的技术重点也是技术难点,而激素种类及激素浓度使用范围,培养基类型更是重中之重,本申请发明人经过大量创造性劳动,筛选的到最佳的铁甲秋海棠诱导培养基、增殖培养基及生根培养基的成分及激素组合,不仅诱导、增殖效果明显,且出芽时间大大缩短,且壮苗、生根效果显著。
泥炭土具有良好的通透性和较大的盐分平衡能力,珍珠岩吸水、透气,本申请发明人经过多年创造性劳动,进行筛选对比实验,从大量扦插基质中筛选得出泥炭、珍珠岩按照2:1的体积比例结合使用,最适宜铁甲秋海棠生根存活,各基质间互作互应,达到透气、保湿、固根的效果。
利用组合基质培养铁甲秋海棠,能够快速有效的得到大量铁甲秋海棠,解决其短缺的问题;通过对取样时间、灭菌、光照、激素等条件的优化,一个周期内,能够使得铁甲秋海棠增殖率达到1200倍以上,成活后快速达到种苗规格,此外,组培操作不必考虑季节因素,出瓶前可一年四季的扩繁,繁殖系数可以指数化增长,能够高效的得到铁甲秋海棠种苗,大大满足了市场的需求。
具体实施方式
实施例1
外植体取样时间筛选
1、不同季节取样的比较
于12月1日、2月1日、3月1日、4月1日和5月1日五个时间点,选取展叶叶片进行消毒处理和初代诱导。消毒方法均为“先以适量洗涤剂溶液振荡清洗15min,再用自来水流水冲洗40min,取出后于无菌操作台上,用75%酒精消毒10s,立即转入含有0.1%的升汞溶液中消毒25min,再以无菌水冲洗5-6次,每次1min,消毒滤纸吸干表面水分,将叶片边缘切除后切成3-4cm2的方形小块。”污染控制见表1,可以看出最佳取样时间为3-4月份,当年生叶片刚刚展叶。
表1季节取样对污染率的影响
接种时间 | 外植体数 | 污染率 |
12月1日 | 50 | 90% |
2月1日 | 50 | 80% |
3月1日 | 50 | 8% |
4月1日 | 50 | 5% |
5月1日 | 50 | 40% |
实施例2
外植体筛选:
2、外植体的切割大小筛选
经过消毒处理的外植体叶片,其切割大小的不同也导致培养效果不同。每块切割成3~4cm2的外植体出芽早,数量多,增长极快,且后期壮苗效果好;而每块切割为0.5~1cm2的叶片则出芽晚,且后期壮苗效果差,逐渐趋于褐化或萎蔫。
表2外植体切割大小的影响
外植体切割大小 | 外植体数 | 20d产生芽体数 | 芽体发育情况 |
0.5~1cm2 | 20 | 80 | 长势弱,出现褐化,继代后部分枯死,壮苗效果差 |
3~4cm2 | 20 | 500 | 长势壮,生长无停滞,诱导迅速,无萎蔫现象,继代后迅速成苗 |
实施例3
光照条件筛选:
3、初代诱导中光照条件的比较
在铁甲秋海棠叶片初代诱导过程中,比较不同光照对叶片外植体诱导不定芽情况的影响。光照条件设置弱光1000lx、强光1500lx、极强光2000lx以及先暗培养1d后正常光照四个梯度。接入培养基20d后观察统计叶片诱导不定芽的情况。
1000lx出芽很多,每块叶片可诱导出200倍的不定芽数。1500lx出芽较少,仅为10倍左右,而极强光2000lx基本没有不定芽出现,先暗培养1d后正常光培养出芽70倍左右,可见,光照条件对铁甲秋海棠叶片诱导不定芽的影响极其显著。
4、壮苗过程中光照条件的比较
在铁甲秋海棠叶片继代壮苗过程中,将光照条件设置弱光1000lx、强光1500lx和极强光2000lx三个梯度。比较不同光照对不定芽壮苗情况的影响。将初代诱导的不定芽接入壮苗培养基30d后观察统计芽体发育的情况。
1000lx光照条件下,不定芽长势一般,叶片较小,展叶周期需15d左右。1500lx不定芽长势较快,展叶周期较短,仅需10d,叶片光亮。极强光2000lx抑制不定芽发育,芽体出现僵硬状态,不发育。可见,在继代过程中增加一定的光照度,有利于铁甲秋海棠叶片不定芽的壮苗,而过度增加光强也会抑制芽体发育。
实施例4
培养基筛选:
5、不定芽诱导培养基的筛选
将消毒切割成3~4cm2的叶块,接入5种培养基中进行不定芽诱导培养20d,培养温度为25±2℃,光照时间为14h/d,光照强度为1000lx。发现不定芽诱导分化效果最好的培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.5mg/L DA-6,pH值为5.8,诱导分化率为100%,且芽体生长迅速且旺盛,形状饱满,颜色新鲜翠绿。培养基中激素不添加6-BA和DA-6时,外植体的分化率相对较低,且分化形成的芽体长势不佳,形状单薄细弱,颜色呈淡黄或黄白色;而在MS+6-BA1.0mg.L-1+NAA0.1 mg.L-1培养基中,虽然外植体的也有较高的出芽率,但增殖相对缓慢。
表3诱导培养基筛选
培养基 | 分化率(%) | 分化生长情况 |
MS | 30 | 出芽少,芽体细弱,黄白色 |
MS+2.0mg.L-16-BA | 48 | 出芽较少,芽体细弱,淡黄至黄白色 |
MS+1.0mg.L-16-BA +0.2 mg.L-1 NAA | 90 | 出芽较多,芽体较细弱,增殖较慢,新鲜绿色 |
MS+1.0mg.L-16-BA +0.1 mg.L-1 NAA | 80 | 出芽较多,增殖较慢,芽体粗壮,新鲜绿色 |
MS+2.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.5mg/L DA-6 | 100 | 出芽极多,生长迅速,芽体饱满,新鲜绿色 |
6、壮苗培养基的筛选
将诱导得到的不定芽切割后,接入5种壮苗培养基中进行继代培养30d,培养温度为25±2℃,光照时间为14h/d,光照强度为1500lx。试验发现在MS+0.4 mg/L IBA培养基更适合于芽的增殖,其增殖系数最高且出芽极多,生长迅速,生成芽体粗壮稠密。
表4壮苗培养基筛选
激素配比(mg·L-1) | 增殖系数 | 增殖情况 |
MS+0.4 mg/L NAA | 4.2 | 增殖缓慢,芽体细弱 |
MS+0.2 mg/L IBA | 6.7 | 出芽较多,增殖慢,芽体粗 |
MS+0.4 mg/L IBA | 9.0 | 出芽极多,增殖迅速,芽体粗壮 |
MS+0.8 mg/L IBA | 5.2 | 出芽多,但增殖较慢,芽体细长 |
MS+1.0 mg/L IBA | 5.8 | 出芽多,增殖较慢,芽体细长 |
7、移栽时,淡紫灰链霉菌、黄绿木霉、假丝酵母菌、粪产碱杆菌形成一个良好的微生态系统,各菌种之间合理配伍,共生协调,互不拮抗,微生物分泌根系促生素和抑菌素能够呵护幼苗根系感染腐霉根腐病、疫霉根腐病、细菌性根腐病和茎基腐病及立枯病、猝倒病等苗期病害,从而有效控制苗期的死苗烂棵现象,磷酸氢二钠给根系源源不断供给营养,维持苗强苗壮势头,极大的提高植株的适应性,提高整个成活率,经单因子试验表明,组培苗根部经过该促进剂浸泡后,移栽成活率较之不经过任何处理,提高31.7%。
实施例5
1、外植体的选取与消毒:2015年4月1日,在温室培养的1株铁甲秋海棠上,选取完全展开的成熟健壮叶片10片作为外植体,冲洗干净后,进行消毒,消毒过程为:先以适量洗涤剂溶液振荡清洗15min,再用自来水流水冲洗40min,取出后于无菌操作台上,用75%酒精消毒10s,立即转入含有0.1%的升汞溶液中消毒25min,再以无菌水冲洗5-6次,每次1min,消毒滤纸吸干表面水分,将叶片边缘切除后切成3-4cm2的方形小块,共得到小块80块。
2、不定芽的诱导:取步骤(1)中处理得到的外植体方形小块,将叶片平铺接种于诱导培养基中进行不定芽的诱导,培养温度为25±2℃,进行暗光照培养20d;所述暗光照培养条件为:光照时间为14h/d,光照强度为1000lx;所述诱导培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L DA-6,pH值为5.8-6.0。培养20d后(污染率为0),80块外植体边缘平均长出 8.3个不定芽,共664个不定芽。
3不定芽的继代壮苗:将诱导得到的不定芽切分后(每个继代小块平均带有3.5个芽),接入壮苗培养基MS+0.4 mg/L IBA中进行继代培养20d,培养温度为25±2℃,光照时间为14h/d,光照强度为1500lx,壮苗培养基为pH值为5.8,20d后继代一次,二次继代培养20d后不定芽长成大苗,壮苗过程中不定芽仍会增加90%,壮苗40d后不定芽数达1261个。
4根的诱导:将铁甲秋海棠试管苗接入生根培养基1/2MS+0.5 mg/L IBA中进行生根培养10d,培养温度为25±2℃,光照时间为14h/d,光照强度为1500lx;所述生根培养基pH值为5.9;待不定根长至3cm左右,植株整体生长稳健时,可准备移苗出瓶。
(5) 将培养瓶移出组培室,将瓶盖打开,组培苗炼苗2-3天,将组培苗的根浸泡在复合微生物制剂中,10min,移栽入基质中,所述基质优选为:按照2:1的体积比例将泥炭土和珍珠岩混匀。
所述复合微生物制剂为:按照淡紫灰链霉菌发酵液:黄绿木霉发酵液:假丝酵母菌发酵液:粪产碱杆菌发酵液:草炭:磷酸氢二钠=1:2:3:2:4:1
所述淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)为CGMCC NO.2130;
所述黄绿木霉为黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)ACCC32248
所述假丝酵母菌具体为假丝酵母菌(Candida utilis)ATCC No.22023;
所述粪产碱杆菌为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 31555。
1个培养周期内,1株铁甲秋海棠可增殖出1210株,繁殖倍数达1200倍之多。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (1)
1.一种铁甲秋海棠叶片离体再生体系建立的方法,其特征在于,具体包括如下步骤:步骤(1)外植体的选取与消毒:选取叶片作为外植体,冲洗干净后,进行消毒,切成3-4cm2的方形小块;
步骤(2)不定芽的诱导:取步骤(1)中处理得到的叶片平铺接种于诱导培养基中进行不定芽的诱导,暗光照培养,所述暗光照培养条件为:光照时间为14h/d,光照强度为1000lx;所述诱导培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.5mg/L DA-6;
步骤(3)不定芽继代获得试管苗:将步骤(2)诱导得到的不定芽切分后,接入壮苗培养基中进行继代培养获得试管苗,光照时间为14h/d,光照强度为1500lx;所述壮苗培养基为MS+0.4 mg/L IBA;
步骤(4)根的诱导:将步骤(3)中得到的试管苗接入生根培养基中进行生根培养得到组培苗,光照时间为14h/d,光照强度为1500lx;所述生根培养基为1/2MS+0.5 mg/L IBA;
步骤 (5) 移栽:将步骤(4)组培苗的根浸泡在复合微生物制剂中10min,移栽入基质中,所述基质由泥炭土和珍珠岩按照2:1的体积比例混匀制得;
所述复合微生物制剂为:按照淡紫灰链霉菌发酵液:黄绿木霉发酵液:假丝酵母菌发酵液:粪产碱杆菌发酵液:草炭:磷酸氢二钠重量比=1:2:3:2:4:1;所述步骤(1)中外植体取样时间为3-4月。
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铁十字秋海棠和蟆叶秋海棠的组织培养与快速繁殖;侯占铭等;《内蒙古师大学报自然科学版》;20010930;第30卷(第3期);第260-262页,尤其是260-261页第1-2节 * |
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