CN116849126A - 一种黑峰秋海棠种质资源离体保存的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黑峰秋海棠种质资源离体保存的方法。本发明的黑峰秋海棠种质资源离体保存的方法，以黑峰秋海棠新长出未完全展开的叶为外植体，通过外植体消毒、愈伤组织的诱导、愈伤组织脱分化诱导不定芽、不定芽继代增殖培养、生根壮苗培养、试管苗移栽环节，成功进行了其种苗的规模化繁殖。本发明获取外植体对母株损伤小，具有消毒成功率高，繁殖系数高，生长健壮等特点。实施该发明只需要简单的植物组织培养设备即可进行。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种黑峰秋海棠种质资源离体保存的方法。
背景技术
黑峰秋海棠(Begoniaferox C.IPeng&Yan Liu)又称刺秋海棠，是秋海棠科秋海棠属植物，被列入《国家重点保护野生植物名录(2021)》，属于国家二级重点保护野生植物；世界自然保护联盟(IUCN)评估其濒危等级：极度濒危(CR)。黑峰秋海棠全株皆被细碎红棕色绒毛，茎匍匐于地面生长，叶互生，叶片不对称，卵形，基部明显斜心形，表面有泡状隆起，好似空心的“刺”状结构，叶背部微红带孔洞，叶边缘呈不规则波浪形皱褶，花期5-10月，观赏价值高，是秋海棠科为数不多叶片凸起的植物，可应用于家庭室内装饰美化及园林绿化。
黑峰秋海棠为广西特有种，仅分布于中国广西弄岗国家级自然保护区的一处石灰岩崖壁上，只发现一个种群，数量少于50株。其常规繁殖主要采用扦插繁殖，繁殖速度慢，利用组织培养技术对种质资源进行离体保存能有效解决这个问题。但以黑峰秋海棠的地下根状茎为外植体时，污染率高。
目前，国内外尚未见黑峰秋海棠离体保存的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种对母株损伤小，具有消毒成功率高，污染率很小，繁殖系数高，生长速度快的黑峰秋海棠种质资源离体保存的方法。
本发明的黑峰秋海棠种质资源离体保存的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.外植体消毒和愈伤组织的诱导：选取无病虫害的黑峰秋海棠(Begoniaferox C.IPeng&
Yan Liu)叶片作为外植体，经消毒处理后，进行切割处理，接种到诱导愈伤组织培养基
中培养，培养温度22-26℃，光照1500-2500lx，光照时间12-16h/d，外植体产生愈伤组织；B.愈伤组织脱分化诱导不定芽：将步骤A获得的愈伤组织转移到不定芽诱导培养基中培养，
培养温度为22-26℃，光照1500-2500lx，光照12-16h/d，愈伤组织脱分化诱导出不定芽；C.不定芽继代增殖培养：将诱导出的不定芽切割成单芽后再继代培养于不定芽继代增殖培
养基中进行不定芽增殖，培养温度为22-26℃，光照1500-2500lx，光照12-16h/d；
D.生根壮苗培养：将生长至2-3cm的不定芽切下，移入生根壮苗培养基中进行生根培养，培养温度为22-26℃，光照1800-2500lx，光照12-16h/d；
E.试管苗移栽：生根培养后的试管苗，在自然光照下炼苗，然后洗掉试管苗根部培养基，
移栽至栽培基质中；
所述的诱导愈伤组织培养基为：6-苄氨基嘌呤0.5-2.0毫克、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)0.5-2.0毫克或噻苯隆0.5-2.0毫克、萘乙酸0.1毫克进行组合试验、蔗糖20-30克、琼脂6.0-7.0克，其余为MS基本培养基，pH5.8-6.0；
所述的不定芽诱导培养基为：6-苄氨基嘌呤0.5-1.5毫克、萘乙酸0.1-0.3毫克、蔗糖20-30克、琼脂6.0-7.0克，其余为MS基本培养基，pH5.8-6.0；
所述的不定芽增殖培养基为：6-苄氨基嘌呤1.0-2.0毫克、噻苯隆0.01-0.03毫克、萘乙酸0.01-0.1毫克、蔗糖20-30克、琼脂6.0-7.0克，其余为MS基本培养基，pH5.8-6.0；
所述的生根壮苗培养基为：吲哚丁酸0.1-0.5毫克、萘乙酸0.1-0.3毫克、蔗糖20-30克、琼脂6.0-7.0克，其余为1/2MS基本培养基，pH5.8-6.0。
优选，所述的外植体消毒处理：在生长季节选取生长旺盛的黑峰秋海棠新长出未展开的嫩叶片作为外植体，用体积分数为75％乙醇浸泡的棉球对叶片表面进行擦拭消毒，放入质量分数为0.1％升汞溶液中，浸泡8-12min，无菌水洗涤4-5次，中间适当摇晃；
优选，所述的愈伤组织诱导：在超净工作台中，用组培剪和镊子将叶片切割成1cm×1cm大小，在剪切叶片时，保留叶片的经脉，并且在叶片方块边缘多剪切3-5个切口，以叶背接触培养基的方式接种至诱导愈伤组织培养基中，进行愈伤组织诱导；
优选，所述愈伤组织诱导阶段需暗培养3-7d，然后进入光照培养；
优选，所述试管苗炼苗移栽是将获得的再生苗连同培养基、培养瓶一起转入大棚内进行炼苗，不开盖炼苗4-7d后，打开培养瓶盖炼苗3-6d；
优选，所述炼苗后的再生植株移栽至泥炭土：珍珠岩体积比为(2-4)：1的基质中，于28±2℃、自然光照在大棚中生长，定植后每周喷施一次营养液，生长旺盛。成活率可达95-100％。
本发明的黑峰秋海棠种质资源离体保存的方法，以黑峰秋海棠新长出未完全展开的叶为外植体，通过外植体消毒、愈伤组织的诱导、愈伤组织脱分化诱导不定芽、不定芽继代增殖培养、生根壮苗培养、试管苗移栽环节，成功进行了其种苗的规模化繁殖。本发明获取外植体对母株损伤小，具有消毒成功率高，繁殖系数高，生长健壮等特点。实施该发明只需要简单的植物组织培养设备即可进行。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限定。
实施例1：
1.外植体消毒和愈伤组织的诱导：在生长季节选取生长旺盛的黑峰秋海棠(Begoniaferox C.IPeng&Yan Liu)新长出未展开的嫩叶片作为外植体，用体积分数为75％乙醇浸泡的棉球对叶片表面进行擦拭消毒，放入质量分数为0.1％升汞溶液中，浸泡8-12min，无菌水洗涤4-5次，中间适当摇晃。经消毒处理后，进行切割处理，在超净工作台中，用组培剪和镊子将叶片切割成1cm×1cm大小，在剪切叶片时，保留叶片的经脉，并且在叶片方块边缘多剪切3-5个切口，以叶背接触培养基的方式接种至诱导愈伤组织培养基中，进行愈伤组织诱导，诱导阶段暗培养3-7d，然后进入光照培养，消毒成功率88-95％。将无菌叶片作为外植体，接种到不同浓度6-苄氨基嘌呤(6-BA)(0.5、1.0、2.0毫克)、噻苯隆(TDZ)(0.5、1.0、2.0毫克)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)(0.5、1.0、2.0毫克)与萘乙酸(NAA)0.1毫克的组合试验，以MS为基础培养基(见表1)，蔗糖30克、琼脂6.0克，ph5.8。培养温度24±2℃，光照1500-2000lx，光照时间12h/d，培养30-40d外植体产生愈伤组织。
表1不同植物生长调节剂对叶片愈伤组织的诱导
实验结果：
由表1可见，以黑峰秋海棠叶片为外植体时，植物生长调节剂的类型或浓度对其愈伤组织诱导效果有明显的影响。
6-BA、2,4-D或较低浓度的TDZ(0.5毫克)处理能显著提高黑峰秋海棠愈伤组织的诱导率，而较高浓度的TDZ(1.0、2.0毫克)处理会抑制愈伤组织的发生。1.0毫克6-BA和0.5毫克2,4-D处理下，诱导形成的愈伤组织数显著高于其他处理组，达到94.32-98.00％。随着6-BA或2,4-D浓度继续增加，愈伤组织平均数下降，表明较高浓度的6-BA或2,4-D会抑制愈伤组织的发生。值得注意的是，6-BA与2,4-D诱导形成的愈伤组织形态不同。6-BA诱导形成的愈伤组织形态正常，可分化成为完整植株。2,4-D诱导形成的愈伤整体膨大，这种畸形的膨大组织不能分化成苗。因此，综合上述结果，1.0毫克6-BA和0.1毫克NAA处理最适合用于黑峰秋海棠愈伤组织诱导。
2.愈伤组织脱分化诱导不定芽：将步骤1获得的愈伤组织切分成小块，转移到不定芽诱导培养基中进行不定芽的培养，愈伤组织脱分化的不定芽诱导培养基每升含有：6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.5毫克、萘乙酸(NAA)0.1毫克、蔗糖20克、琼脂6.0克，其余为MS基
本培养基，ph5.8。培养温度为22℃，光照1500lx，光照12h/d，不定芽诱导率达85％。
3.不定芽继代增殖培养：将诱导出的不定芽切割成单芽后再继代培养于不定芽增殖培养基中进行不定芽增殖，不定芽增殖培养基每升含有：6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.0毫克、噻苯隆(TDZ)0.01毫克、萘乙酸(NAA)0.01毫克、蔗糖20克、琼脂6.0克，其余为MS基本培养基，pH5.8-6.0。培养温度为22℃，光照1500lx，光照12h/d。一般30d为一个继代增殖周期，每一个继代增殖后的增殖倍数为20倍。
4.生根壮苗培养：将芽生长至2-3cm高时，切下移入生根壮苗培养基中进行生根培养，生根壮苗培养基每升含有：吲哚丁酸(IBA)0.1毫克、萘乙酸(NAA)0.1毫克、蔗糖20克、琼脂6.0克，其余为1/2MS基本培养基，pH5.8-6.0。培养温度为22℃，光照2000lx，光照12h/d。能正常生根，培养40d时生根率可达95％；
5.试管苗移栽：当生根培养的试管苗生长至4cm左右时，将获得的再生苗连同培养基、培养瓶一起转入大棚内进行炼苗，不开盖炼苗4d后，打开培养瓶盖炼苗3d，然后洗掉试管苗根部培养基，移栽至泥炭土：珍珠岩体积比为2:1的基质中，注意浇水、遮阴、保湿和保温，成活率可达95％。
实施例2：
1.愈伤组织脱分化诱导不定芽：将实施例1步骤1获得的愈伤组织切分成小块，转移到不定芽诱导培养基中进行不定芽的培养，不定芽诱导培养基每升含有：6-苄氨基嘌呤(6-BA)
1.0毫克、萘乙酸(NAA)0.2毫克、蔗糖25克、琼脂6.0克，其余为MS基本培养基，
ph5.9。培养温度为24℃，光照1800lx，光照14h/d，不定芽诱导率达92％。
2.不定芽继代增殖培养：将诱导出的不定芽切割成单芽后再继代培养于不定芽增殖培养基中进行不定芽增殖，不定芽增殖培养基每升含有：6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.5毫克、噻苯隆(TDZ)0.02毫克、萘乙酸(NAA)0.05毫克、蔗糖20克、琼脂6.0克，其余为MS基本培养基，pH5.8-6.0。培养温度为24℃，光照1800lx，光照14h/d。一般30d为一个继代增殖周期，每一个继代增殖后的增殖倍数为30倍。
3.生根壮苗培养：将芽生长至2-3cm高时，切下移入生根壮苗培养基中进行生根培养，生根壮苗培养基每升含有：吲哚丁酸(IBA)0.3毫克、萘乙酸(NAA)0.2毫克、蔗糖25克、琼脂6.0克，其余为1/2MS基本培养基，pH5.9。培养温度为24℃，光照2300lx，光照14h/d。能正常生根，培养30d时生根率可达100％；
4.试管苗移栽：当生根培养的试管苗生长至4cm左右时，将获得的再生苗连同培养基、培养瓶一起转入大棚内进行炼苗，不开盖炼苗5d后，打开培养瓶盖炼苗4d，然后洗掉试管苗根部培养基，移栽至泥炭土：珍珠岩体积比为3:1的基质中，注意浇水、遮阴、保湿和保温，成活率可达100％。
实施例3：
1.愈伤组织脱分化诱导不定芽：将实施例1步骤1获得的愈伤组织切分成小块，转移到不定芽诱导培养基中进行不定芽的培养，不定芽诱导培养基每升含有：6-苄氨基嘌呤(6-BA)
1.5毫克、萘乙酸(NAA)0.3毫克、蔗糖30克、琼脂6.0克，其余为MS基本培养基，
ph6.0。培养温度为26℃，光照2000lx，光照16h/d，不定芽诱导率达90％。
2.不定芽继代增殖培养：将诱导出的不定芽切割成单芽后再继代培养于不定芽增殖培养基中进行不定芽增殖，不定芽增殖培养基每升含有：6-苄氨基嘌呤(6-BA)2.0毫克、噻苯隆(TDZ)0.03毫克、萘乙酸(NAA)0.1毫克、蔗糖30克、琼脂6.0克，其余为MS基本培养基，pH6.0。培养温度为26℃，光照2000lx，光照16h/d。一般30d为一个继代增殖周期，每一个继代增殖后的增殖倍数为25倍。
3.生根壮苗培养：将芽生长至2-3cm高时，切下移入生根壮苗培养基中进行生根培养，生根壮苗培养基每升含有：吲哚丁酸(IBA)0.5毫克、萘乙酸(NAA)0.3毫克、蔗糖30克、琼脂6.0克，其余为1/2MS基本培养基，pH6.0。培养温度为26℃，光照2500lx，光照16h/d。能正常生根，培养30d时生根率可达98％；
4.试管苗移栽：当生根培养的试管苗生长至4cm左右时，将获得的再生苗连同培养基、培养瓶一起转入大棚内进行炼苗，不开盖炼苗6d后，打开培养瓶盖炼苗5d，然后洗掉试管苗根部培养基，移栽至泥炭土：珍珠岩体积比为4:1的基质中，注意浇水、遮阴、保湿和保温，成活率可达98％。
Claims (6)
1.一种黑峰秋海棠种质资源离体保存的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.外植体消毒和愈伤组织的诱导：选取无病虫害的黑峰秋海棠(Begoniaferox C.IPeng&Yan Liu)叶片作为外植体，经消毒处理后，进行切割处理，接种到诱导愈伤组织培养基中培养，培养温度22-26℃，光照1500-2500lx，光照时间12-16h/d，外植体产生愈伤组织；
B.愈伤组织脱分化诱导不定芽：将步骤A获得的愈伤组织转移到不定芽诱导培养基中培养，培养温度为22-26℃，光照1500-2500lx，光照12-16h/d，愈伤组织脱分化诱导出不定芽；
C.不定芽继代增殖培养：将诱导出的不定芽切割成单芽后再继代培养于不定芽继代增殖培养基中进行不定芽增殖，培养温度为22-26℃，光照1500-2500lx，光照12-16h/d；
D.生根壮苗培养：将生长至2-3cm的不定芽切下，移入生根壮苗培养基中进行生根培养，培养温度为22-26℃，光照1800-2500lx，光照12-16h/d；
E.试管苗移栽：生根培养后的试管苗，在自然光照下炼苗，然后洗掉试管苗根部培养基，移栽至栽培基质中；
所述的诱导愈伤组织培养基为：6-苄氨基嘌呤0.5-2.0毫克、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)0.5-2.0毫克或噻苯隆0.5-2.0毫克、萘乙酸0.1毫克进行组合试验、蔗糖20-30克、琼脂6.0-7.0克，其余为MS基本培养基，pH5.8-6.0；
所述的不定芽诱导培养基为：6-苄氨基嘌呤0.5-1.5毫克、萘乙酸0.1-0.3毫克、蔗糖20-30克、琼脂6.0-7.0克，其余为MS基本培养基，pH5.8-6.0；
所述的不定芽增殖培养基为：6-苄氨基嘌呤1.0-2.0毫克、噻苯隆0.01-0.03毫克、萘乙酸0.01-0.1毫克、蔗糖20-30克、琼脂6.0-7.0克，其余为MS基本培养基，pH5.8-6.0；
所述的生根壮苗培养基为：吲哚丁酸0.1-0.5毫克、萘乙酸0.1-0.3毫克、蔗糖20-30克、琼脂6.0-7.0克，其余为1/2MS基本培养基，pH5.8-6.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外植体消毒处理：在生长季节选取生长旺盛的黑峰秋海棠新长出未展开的嫩叶片作为外植体，用体积分数为75％乙醇浸泡的棉球对叶片表面进行擦拭消毒，放入质量分数为0.1％升汞溶液中，浸泡8-12min，无菌水洗涤4-5次，中间适当摇晃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的愈伤组织诱导：在超净工作台中，用组培剪和镊子将叶片切割成1cm×1cm大小，在剪切叶片时，保留叶片的经脉，并且在叶片方块边缘多剪切3-5个切口，以叶背接触培养基的方式接种至诱导愈伤组织培养基中，进行愈伤组织诱导。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导阶段需暗培养3-7d，然后进入光照培养。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试管苗炼苗移栽是将获得的再生苗连同培养基、培养瓶一起转入大棚内进行炼苗，不开盖炼苗4-7d后，打开培养瓶盖炼苗3-6d。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述炼苗后的再生植株移栽至泥炭土：珍珠岩体积比为(2-4)：1的基质中，于28±2℃、自然光照在大棚中生长，定植后每周喷施一次营养液，生长旺盛。成活率可达95-100％。
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