CN111557242B - 一种莲组培苗培养与快速扩繁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种莲组培苗培养与快速扩繁的方法：（1）以授粉后第15‑18天的莲胚芽为材料，在无菌条件下接入无菌苗培养基，封口放入组培室；（2）培养3个月后，获得生根的走茎无菌苗；（3）把走茎苗的每个节切开为新的芽，接种在继代培养基进行继代培养，一个月后获得大量生根的走茎无菌苗，如此反复，可继代增殖培养5次；（4）把步骤（3）中所得走茎苗移植到温室进行炼苗驯化，3个星期后移至自然条件生长。本发明突破性地以新鲜莲子的胚为外植体，成功培育了走茎苗，成功率高达98%，污染率低于5%，每次继代的繁殖系数可达9.6，周期短，扩繁效率高，有益于莲种苗的大规模生产，为满足莲种苗市场需求提供了一条新的途径。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种莲组培苗培养与快速扩繁的方法。
背景技术
莲属莲科莲属植物，是我国栽培面积最大的水生经济作物，具有极其重要的食用、观赏和药用价值，同时莲还富含大量包括生物碱和类黄酮以及抗氧化剂等次生代谢物质，具有抗菌消炎、抗氧化和抗癌等作用，成为开发天然、安全保健药物最具潜力的首选药材之一。一般莲有种子繁殖和分藕繁殖两种繁殖方式，种子繁殖对时间季节要求较高，而且莲多为异花授粉植物，通过种子繁殖的后代常出现性状分离的现象，一般只用于育种。生产上通常采用分藕繁殖，但是这种方式的繁殖系数低、周期长、成本高。而且长期的藕种繁殖容易因病毒累积造成种质退化，产量和品质下降，种性严重退化。这已成为制约莲种植业发展的一个瓶颈问题。
利用组织培养的莲快速繁殖技术繁殖系数高、成本低，而且可以培育出脱病毒种苗，是当今科学工作者的重点研究方向。目前国内已有不少研究者开展了利用不同外植体如莲叶片叶柄、成熟莲子的胚、茎尖、莲藕的顶芽等进行莲组织培养工作，但存在成活率、实验重复性差等问题。此外，他们培育出来的多为有根但不走茎的莲无菌苗。但在我们的实践中发现，有根、无走茎的无菌苗，出瓶后基本无法成活。因此必须诱导出走茎的无菌苗，才能保证出瓶后的成活率。目前所有莲组培研究都仅仅涉及到无菌苗培养与驯化移栽，而没有考虑到无菌苗的扩繁问题，这严重制约了莲组培技术的应用和种苗的规模化生产。
针对目前莲组培技术的不完善，我们采用新鲜莲子的胚芽进行组织培养试验，筛选出能大量产生走茎的培养基和增殖系数高的继代培养基，经组培苗的驯化炼苗，成功的获得大量的莲种苗。本发明提高了组培苗的成活率、繁殖系数，解决了目前莲种苗繁殖周期长、效率低的问题，有益于进行莲种苗的大规模生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种莲组培苗培养与快速扩繁的方法，以解决现有莲组培技术中外植体易污染、成活率低，增殖效率低，周期长等问题。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种莲组培苗培养与快速扩繁的方法，其首先采取离体组织培养获得走茎无菌苗，经继代扩繁培养，然后炼苗移载即得可自然生长的莲，具体包括以下步骤：
(1)外植体获取：取授粉后15-18天新鲜莲子，除去外种皮，消毒后用无菌剪刀取出胚芽作为外植体；
(2)走茎无菌苗的培养：在无菌条件下，将莲胚芽接种于无菌苗培养基中进行培养，获得生根的走茎无菌苗，所述的无菌苗培养基以MS作为基本培养基，加入0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+0.5g/L活性炭，琼脂 8g/L，pH＝5.8，期间无需更换培养基；
(3)无菌苗的继代培养：将步骤(2)中的走茎苗每个节切开为新的芽，接种在继代培养基进行无菌培养，获得大量生根的走茎无菌苗，所述的继代培养基为：MS培养基+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+80g/L蔗糖+0.5g/L活性炭，琼脂8g/L，pH＝5.8。如此反复，继代培养5次；
(4)无菌苗的炼苗与移栽：将步骤(3)中的走茎苗从培养基里取出，洗掉琼脂，移植到灭菌后培养土，加水至刚淹没土，覆盖薄膜后放置于培养室进行驯化，湿度维持在85％以上；3周后将苗移入自然条件下生长。
优选地，所述莲子为刚采摘的授粉后15-18天的新鲜莲子，若在5个小时内无法处理，可放置于4℃短暂保存，保存时间不易超过48个小时，此莲子的胚芽为外植体可成功培养出生根的走茎无菌苗，效率高达98％；将所述莲子除去外种皮后用自来水冲洗后，移入无菌条件下，用75％的乙醇消毒，无菌水漂洗，然后用0.1％升汞杀菌5-8分钟，再用无菌水漂洗，完成对所述莲子的消毒灭菌处理。
优选地，所述的培养均在每天光照周期为16h/8h(白天/黑夜)，光照强度 1500-2500Lx，控温25±2℃的条件下进行。
优选地，步骤(4)中，所述培养土按照泥炭土:普通土＝1：2配制好后放入 120℃高温灭菌锅之中进行高温灭菌，灭菌完成后取出冷却后备用。
优选地，所述的莲的品种是秋红阳、白花建莲。
由于采取以上技术方案，本发明具有以下优点和积极效果：
1)本发明突破性地采用15-18天新鲜莲子的莲胚芽培养组培苗，污染率小(低于5％)，成活率高(98％以上)，为莲无菌苗的培养拓宽了外植体的选择范围。
2)本发明采取先对莲子消毒，然后取出莲胚芽作外植体，克服了前人直接对胚芽消毒易杀死胚芽的缺陷，方法操作简单，污染率低，褐化率极低，成活率高。
3)本发明通过对培养基中激素配比和蔗糖含量的调节，可一步诱导出芽、根和走茎，节省了培养基更换的步骤，实施步骤更简单易行，大大提高了组培的效率。
4)本发明通过对走茎苗的节间截取，获得新芽进行继代增殖培养，成功完成无菌苗的大量繁殖，繁殖系数可达9.6。一个胚芽可进行5次继代培养，实现了莲种苗的规模化生产，为满足莲种苗市场需求提供了一条新的途径。
附图说明
图1为莲组培苗培养与快速扩繁的流程图。
图2为不同外植体的组培结果。
图3为走茎苗在继代培养基上的生长情况。图 3 A.继代5次时培养30天的走茎无菌苗；图 3 B.继代8次后培养30天的走茎无菌苗。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施案例，进一步阐述本发明的技术方案。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
莲组培苗外植体的筛选，按如下步骤进行：
(1)分别选用‘秋红阳’刚长出水面的幼嫩叶片、地下茎的顶芽、成熟莲子的胚芽和授粉后15-18天新鲜莲子的胚芽为外植体进行无菌苗的培养。其中叶片(剔除叶脉后)和地下茎顶芽(剥去芽鞘后)直接消毒杀菌，成熟莲子和新鲜莲子先除去外种皮后消毒杀菌，最后用无菌剪刀取出胚芽作外植体。灭菌方法为：用75％的乙醇消毒30秒，无菌水漂洗一遍；然后用0.1％升汞杀菌8分钟，再用无菌水漂洗5次。
(2)在无菌条件下，将4种莲外植体接种于无菌苗培养基中，光周期为 16h/8h(白天/黑夜)，光照强度2000Lx，控温25±2℃。无菌苗培养基以MS作为基本培养基，加入0.5mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+0.5g/L活性炭，琼脂8g/L，pH＝5.8。观察无菌苗的生长，统计其成活率和污染率。
成活率＝成活的无菌苗数/总接种数×100％
污染率＝污染的无菌苗数/总接种数×100％
统计发现，以叶片为外植体的60个培养瓶，培养1周后污染率达50％。无污染的叶片无生长迹象，并开始枯萎，4周后全部死亡。以地下茎顶芽为外植体的60个培养瓶，培养1周后污染率达85％；无污染的顶芽变绿，有一定的生长，但培养4周后仍没有根生长出。以成熟莲子胚芽为外植体的60个培养瓶，培养1周后发现均有不同程度的污染，污染率达100％。以新鲜莲子胚芽为外植体的60个培养瓶，培养1周后只有5％的污染率；无污染的胚芽开始长根，4 周内胚芽显著生长，45天开始出现走茎，3个月可以进行继代；成活率达到 100％。
实施例2
莲组培的无菌苗培养基的优化，按如下步骤进行：
(1)取‘秋红阳’刚采摘的授粉后15-18天新鲜莲子，除去外种皮，然后用自来水冲洗15分钟后移入无菌工作台。用75％的乙醇消毒30秒，无菌水漂洗一遍。再用0.1％升汞消毒8分钟，无菌水漂洗5次。最后用无菌剪刀取出胚芽作为外植体。
(2)在无菌条件下，将莲胚芽接种于无菌苗培养基中,光周期为16h/8h (白天/黑夜)，光照强度2000Lx，控温25±2℃。培养1个月后无菌苗生根，培养3个月后获得生根的走茎无菌苗。无菌苗培养基设计了以下配比：
①0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+0.5g/L活性炭
②1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+0.5g/L活性炭
③0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+80g/L蔗糖+0.5g/L活性炭
④0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+1.0g/L活性炭
加入琼脂8g/L，调节pH＝5.8。
在培养85天时观察组培苗的生长，统计其成活率、生根率、走茎的节数和顶芽数。成活率＝成活的无菌苗数/总接种数×100％；生根率＝生根的无菌苗数 /总接种数×100％。
(3)将步骤(2)中的走茎苗每个节切开为新的芽，接种在继代培养基进行无菌培养，继代培养基为：MS培养基+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+ 80g/L蔗糖+0.5g/L活性炭，琼脂8g/L，pH＝5.8，其他培养条件如(2)。培养 1个月获得大量走茎无菌苗。
表1表明，4种培养基配比接种苗成活率没有影响，均可以全部成活；对无菌苗的生根率有一定影响，以培养基①的生根效果最好；对走茎苗的生长速度有一定影响，培养基①所形成的走茎节数和顶芽数较多，培养基③所形成的走茎节数和顶芽数最少。综上，培养基①最有利于无菌苗生根、长芽和走茎。
表1不同无菌苗培养基配比对组培苗生长的影响(培养85天)
实施例3
莲组培的继代培养基的优化，按如下步骤进行：
(1)取‘秋红阳’刚采摘的授粉后15-18天新鲜莲子，除去外种皮，然后用自来水冲洗15分钟后移入无菌工作台。用75％的乙醇消毒30秒，无菌水漂洗一遍。再用0.1％升汞消毒8分钟，无菌水漂洗5次。最后用无菌剪刀取出胚芽作为外植体。
(2)在无菌条件下，将莲胚芽接种于无菌苗培养基中,光周期为16h/8h (白天/黑夜)，光照强度2000Lx，控温25±2℃。培养1个月后无菌苗生根，培养3个月后获得生根的走茎无菌苗。无菌苗培养基以MS作为基本培养基，加入0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+0.5g/L活性炭，琼脂8g/L，pH ＝5.8。期间无需更换培养基。
(3)无菌苗的继代培养：将步骤(2)中的走茎苗每个节切开为新的芽，接种在继代培养基进行无菌培养，其他培养条件如(2)。培养1个月后获得走茎无菌苗。如此反复，进行多次继代培养。
继代培养基设计了以下2个配比：
①0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+80g/L蔗糖+0.5g/L活性炭
②0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+0.5g/L活性炭
加入琼脂8g/L，调节pH＝5.8。
在培养28天时观察组培苗的生长，统计其成活率、生根率、走茎的节数和顶芽数。成活率＝成活的无菌苗数/总接种数×100％；生根率＝生根的无菌苗数 /总接种数×100％。
表2表明，2种培养基配比接种苗成活率和无菌苗的生根率没有影响；对走茎苗的生长速度有一定影响，培养基(1)所形成的走茎节数和顶芽数较多。综上，培养基(1)通过提高蔗糖含量可显著提高的无菌苗生根、长芽和走茎。
表2不同继代培养基配比对组培苗生长的影响(培养28天)
同时对在继代培养基上继代不同次数进行分析比较，发现继代1-5次，走茎苗长到30天时生长情况良好。当继代到第6次时，走茎苗开始出现叶片变黄情况，继续培养会出现死亡。所以最佳的继代次数为5次。
实施例4
用于莲组培苗培养与快速扩繁的品种筛选，按如下步骤进行：
(1)取‘秋红阳’、‘秋日红花’、‘武植子1号’和‘白花建莲’刚采摘的授粉后15-18天新鲜莲子，除去外种皮，然后用自来水冲洗15分钟后移入无菌工作台。用75％的乙醇消毒30秒，无菌水漂洗一遍。再用0.1％升汞消毒8分钟，无菌水漂洗5次。最后用无菌剪刀取出胚芽作为外植体。
(2)在无菌条件下，将莲胚芽接种于无菌苗培养基中,光周期为16h/8h (白天/黑夜)，光照强度2000Lx，控温25±2℃。培养1个月后无菌苗生根，培养3个月后获得生根的走茎无菌苗。无菌苗培养基以MS作为基本培养基，加入0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+0.5g/L活性炭，琼脂8g/L，pH ＝5.8。期间无需更换培养基。
(3)将步骤(2)中的走茎苗每个节切开为新的芽，接种在继代培养基进行无菌培养，继代培养基为：MS培养基+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+ 80g/L蔗糖+0.5g/L活性炭，琼脂8g/L，pH＝5.8，其他培养条件如(2)。培养 1个月后可获得大量生根的走茎无菌苗。如此反复，继代培养5次。
(4)将步骤(3)中的走茎苗从培养基里取出，洗掉琼脂，移植到灭菌后培养土(泥炭土:普通土＝1：2)，加水至刚淹没土，覆盖薄膜后放置于培养室进行驯化。驯化条件同(2)的条件，湿度维持在85％以上。1天后破3-4小孔透气，3天后将小孔开大，5天后揭膜，期间一直保持水刚刚淹没培养土。7天后浇水至2-4mm水深，之后一直保持此水位。3周后将苗移入自然条件下生长。
分别观察无菌苗在无菌培养基和继代培养基的生长，统计其繁殖系数。繁殖系数＝增殖的无菌苗数/总接种数。
表3表明，4个品种在无菌培养基和继代培养基的繁殖系数存在着显著差异，其中‘秋红阳’在无菌苗培养基上的繁殖系数最高，其次为‘白花建莲’；‘白花建莲’在继代培养基上的繁殖系数最高，其次为‘武植子1号’。
表3不同莲品种在无菌培养基的繁殖系数
Claims (6)
1.一种莲（Nelumbo nucifera）组培苗培养与快速扩繁的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外植体获取：取授粉后15-18天新鲜莲子，除去外种皮，消毒后用无菌剪刀取出胚芽作为外植体；
（2）走茎无菌苗的培养：在无菌条件下，将莲胚芽接种于无菌苗培养基中进行培养，获得生根的走茎无菌苗，所述的无菌苗培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+0.5 g/L活性炭+琼脂8g/L，pH＝5.8，期间无需更换培养基；
（3）无菌苗的继代培养：将步骤（2）中的走茎苗每个节切开为新的芽，接种在继代培养基进行无菌培养，获得大量生根的走茎无菌苗，所述的继代培养基为：MS 培养基+0.5mg/L6-BA +0.5mg/L NAA + 80g/L蔗糖+0.5 g/L活性炭+琼脂8g/L，pH＝5.8，如此反复，继代培养5次；
（4）无菌苗的炼苗与移栽：将步骤（3）中的走茎苗从培养基里取出，洗掉琼脂，移植到灭菌后培养土，加水至刚淹没土，覆盖薄膜后放置于培养室进行驯化，湿度维持在85%以上；3周后将苗移入自然条件下生长。
2.根据权利要求1 所述的一种莲组培苗培养与快速扩繁的方法，其特征在于：步骤（1）中，采摘的授粉后15-18天的新鲜莲子若在5个小时内无法处理，放置于4℃短暂保存，保存时间不超过48个小时。
3.根据权利要求1 所述的一种莲组培苗培养与快速扩繁的方法，其特征在于：步骤（1）中，将所述莲子除去外种皮后用自来水冲洗后，移入无菌条件下，用75%的乙醇消毒，无菌水漂洗，然后用0.1%升汞杀菌5-8分钟，再用无菌水漂洗，完成对所述莲子的消毒灭菌处理。
4.根据权利要求1 所述的一种莲组培苗培养与快速扩繁的方法，其特征在于：所述的培养均在每天光照周期为16h/8h，光照强度1500-2500Lx，控温25±2℃的条件下进行。
5.根据权利要求1 所述的一种莲组培苗培养与快速扩繁的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述培养土按照泥炭土:普通土=1：2配制好后放入120℃高温灭菌锅之中进行高温灭菌，灭菌完成后取出冷却后备用。
6.根据权利要求1 所述的一种莲组培苗培养与快速扩繁的方法，其特征在于：所述的莲的品种是秋红阳、白花建莲。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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