CN108207633B - 一种荷花无菌苗获取的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种荷花无菌苗获取的构建方法,属于植物组织培养技术领域。本发明包括以下步骤：(1)灭菌：选取“广昌白莲”的圆形饱满的莲子在无菌操作台上用75％的酒精和3％次氯酸钠消毒备用；(2)破壳浸泡：用修枝剪破壳，将已经破壳的荷花种子整平浸泡在无菌水中7h以上，种子吸水膨胀，种壳同子叶分离；(3)剥除种壳：把种子外的种皮剥除，将无种壳的种子在75％的酒精中浸泡2min消毒，取出种子晾干。(4)获得种胚：待种子表面的水分蒸发后用手将已吸水膨胀的种子捏开，用镊子将种胚取下。(5)初选接种：对胚进行初选，将初选合格的胚接种在MS培养基上。本发明显著提高了莲子的利用率、成活率，并且把污染率、损耗率降至最低。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种荷花无菌苗获取的构建方法。
背景技术
荷花(Nelumbo nucifera Gaertn.)为莲科莲属多年生水生花卉,是中国十大传统名花之一，具有很高的观赏价值、经济价值和独特的文化内涵，深受人们喜爱。
随着生理、生化等相关学科的发展,并且伴随组织培养技术的日益完善,科研工作者往往会采用生物技术创造新种质，如：结合基因工程将抗病基因、抗旱基因等转入栽培品种,开辟改良抗病性、抗旱性的新途径；也可以与多倍体诱导相结合，以加速和丰富荷花的多倍体育种；还可以与分子生物学方法结合起来，在细胞水平上进行遗传修饰，以改良荷花品种。
荷花的遗传转化体系尚不完善，目前仅见泰国Buathong等(2013)的报道：以荷花成熟胚培养出的无菌苗的茎尖作为外植体诱导出愈伤组织，对愈伤组织采用基因枪法转入DFR基因，然后对愈伤组织诱导不定芽分化成苗。武汉大学生命科学院胡中立教授(2015)以太空连36号1周龄幼胚诱导丛生芽。试验过程中需从莲子中取出种胚，培育无菌苗，过程费时费力，操作难度大，损耗率极高，污染率高且成活率都不高。
现有技术常用硫酸腐蚀莲子、直接消毒、修枝剪破壳的方法，具有导致荷花种子致死、操作难度大、过程复杂和成活率低的缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一种荷花无菌苗获取的构建方法，以解决现有技术培育过程费时费力，操作难度大，损耗率极高，污染率高且成活率都不高的问题。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：一种荷花无菌苗获取的构建方法，包括以下步骤：
(1)灭菌：选取“广昌白莲”的圆形饱满的莲子在无菌操作台上用75％的酒精和3％次氯酸钠消毒灭菌备用；
(2)破壳浸泡：用修枝剪破壳，破壳部位在荷花种子萌发孔正对面的种蒂处，将已经破壳的荷花种子整平浸泡在无菌水中7h以上，浸泡完成后，种子吸水膨胀，种壳同子叶分离；
(3)剥除种壳：在超净工作台上将浸泡用的容器中的水倒出，用无菌水洗一次种子，把浸泡时产生的浑浊的水洗净，把种子外的种皮在不破坏子叶完整性的前提下剥除，将无种壳的种子在75％的酒精中浸泡1-5min消毒，取出种子晾干待用；
(4)获得种胚：待种子表面的水分蒸发后用手将已吸水膨胀的种子捏开，用镊子将种胚取下；
(5)初选接种：对胚进行初选，将初选合格的胚接种在MS培养基上，培养无菌苗，所述培养基配方如下：MS+8g/L琼脂+30g/L蔗糖。
优选的，步骤(1)灭菌的具体方法为选取“广昌白莲”的圆形饱满的种子用75％的酒精消毒30s，用无菌水冲洗1次，3％次氯酸钠浸泡8min，再用无菌水冲洗3次，备用。
优选的，步骤(2)中用修枝剪破壳的程度为不破环包裹在子叶外的种皮；
优选的，步骤(2)浸泡时，种子与水的比例为2：3。
优选的，步骤(3)中将种皮剥除后，于75％酒精中浸泡2min，晾干备用。
优选的，步骤(4)中弃用胚囊进水的种子。
优选的，步骤(5)中初选过程中选择已经转绿的，胚饱满且有活性的胚进行接种。
本发明的有益效果：
本发明采用不同于以往的破壳方法，有针对性避开莲子最薄弱的萌发孔，通过莲子自我吸水膨胀萌发的特性，简化破壳，取胚的操作难度和过程，克服了现有技术的用硫酸腐蚀莲子、直接消毒、修枝剪破壳等方法易致死、难度大、过程复杂等缺陷，显著提高了莲子的利用率、成活率，并且把污染率、损耗率降至最低。
进一步的，步骤(2)中用修枝剪破壳的程度为不破环包裹在子叶外的种皮，因为这样可以保证水分是经过厚大子叶的天然过滤作用后被胚吸收，最大程度的保证无菌环境，把污染率、损耗率降至最低。
进一步的，由于浸泡过程中会有小部分胚囊进水，此种胚污染风险很大，挑选出这种胚，得以避免在培育过程中造成污染，提高莲子的利用率、成活率。
进一步的，对所有获得的种胚进行初选，以获得更大的成活率，并降低污染率，保证了培育的荷花的质量和成活率。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1
一种荷花再生体系的构建方法，按以下步骤进行：
(一)培养基的配制
无菌苗培养基：MS+8g/L琼脂+30g/L蔗糖
(二)灭菌及破壳：
选取“广昌白莲”的圆形饱满的莲子用75％的酒精消毒30s，用无菌水冲洗1次后，放入3％次氯酸钠浸泡8min，再用无菌水冲洗3次，在萌发孔正对面的种蒂处用修枝剪破壳，破壳时，要掌握破壳的程度，以不破环包裹在子叶外的种皮为宜，因为这样可以保证水分是经过厚大子叶的天然过滤作用后被胚吸收，最大程度的保证无菌环境；加无菌水浸泡大约7h左右，种子即可吸水变软，加水不宜过多，也不宜过少，以能淹没所有种子为宜。之后整平待用。
将超净工作台，无菌水，酒精，滤纸，培养基，废液瓶等紫外灭菌。先用无菌水洗一次种子，把浸泡时出的浑浊的水洗干净。把种子外的种皮在不破坏子叶完整性的前提下剥除，剩下的种子待表面水分蒸发后，放入瓶中加75％的酒精浸泡1min。弃用胚囊进水的种子，剩下的种子待表面的水分蒸发后，取出子叶包裹的胚。进行初选，只选择已经转绿的，胚非常饱满且具有活性的接种。
(三)无菌苗的培养：将取出的莲心作为外植体接种于无菌苗培养基中，每瓶接种3个，各接种26瓶，每天光照时间为14h，光照强度1500-2500Lx，控温25℃，1周后获得无菌苗。统计无菌苗成活率和污染率。成活率＝成活的无菌苗数(不包括污染了被剔除的)/接种莲心×100％，污染率＝污染无菌苗数/总接种数×100％。
26瓶中仅有1瓶污染，污染率仅3.85％，成活率100％。
实施例2
一种荷花再生体系的构建方法，按以下步骤进行：
(一)培养基的配制
无菌苗培养基：MS+8g/L琼脂+30g/L蔗糖
(二)灭菌及破壳：
选取“广昌白莲”的圆形饱满的莲子用75％的酒精消毒30s，用无菌水冲洗1次后，放入3％次氯酸钠浸泡8min，再用无菌水冲洗3次，在萌发孔正对面的种蒂处用修枝剪破壳，破壳时，要掌握破壳的程度，以不破环包裹在子叶外的种皮为宜，因为这样可以保证水分是经过厚大子叶的天然过滤作用后被胚吸收，最大程度的保证无菌环境；加无菌水浸泡大约7h左右，种子即可吸水变软。之后整平待用。
将超净工作台，适宜的无菌水，酒精，滤纸，培养基，废液瓶等紫外灭菌。先用无菌水洗一次种子，把浸泡时出的浑浊的水洗干净。把种子外的种皮在不破坏子叶完整性的前提下剥除，待表面水分蒸发后，放入瓶中加75％的酒精浸泡1min。待表面的水分蒸发后，取出子叶包裹的胚。进行初选，只选择已经转绿的，胚非常饱满的接种。
(三)无菌苗的培养：将取出的莲心作为外植体接种于无菌苗培养基中，每瓶接种3个，各接种23瓶,每天光照时间为14h，光照强度1500-2500Lx，控温25℃，1周后获得无菌苗。统计无菌苗成活率和污染率。成活率＝成活的无菌苗数(不包括污染了被剔除的)/接种莲心×100％，污染率＝污染无菌苗数/总接种数×100％。
23瓶中仅有1瓶污染，污染率仅4.35％，成活率100％。
Claims (6)
1.一种荷花无菌苗获取的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)灭菌：选取“广昌白莲”的圆形饱满的莲子在无菌操作台上用75％的酒精和3％次氯酸钠消毒灭菌备用；
(2)破壳浸泡：用修枝剪破壳，破壳部位在荷花种子萌发孔正对面的种蒂处，将已经破壳的荷花种子整平浸泡在无菌水中7h以上，浸泡完成后，种子吸水膨胀，种壳同子叶分离；
(3)剥除种壳：在超净工作台上将浸泡用的容器中的水倒出，用无菌水洗一次种子，把浸泡时产生的浑浊的水洗净，把种子外的种皮在不破坏子叶完整性的前提下剥除，将无种壳的种子在75％的酒精中浸泡1-5min消毒，取出种子晾干待用；
(4)获得种胚：待种子表面的水分蒸发后用手将已吸水膨胀的种子捏开，用镊子将种胚取下；
(5)初选接种：对胚进行初选，将初选合格的胚接种在MS培养基上，培养无菌苗，所述培养基配方如下：MS+8g/L琼脂+30g/L蔗糖；
其中，步骤(2)中用修枝剪破壳的程度为不破环包裹在子叶外的种皮。
2.根据权利要求1所述的荷花再生体系的构建方法，其特征在于：步骤(1)灭菌的具体方法为选取“广昌白莲”的圆形饱满的种子用75％的酒精消毒30s，用无菌水冲洗1次，3％次氯酸钠浸泡8min，再用无菌水冲洗3次，备用。
3.根据权利要求1所述的荷花再生体系的构建方法，其特征在于：步骤(2)中浸泡时，种子与水的比例为2：3。
4.根据权利要求1所述的荷花再生体系的构建方法，其特征在于：步骤(3)中将种皮剥除后，于75％酒精中浸泡2min，晾干备用。
5.根据权利要求1所述的荷花再生体系的构建方法，其特征在于：步骤(4)中弃用胚囊进水的种子。
6.根据权利要求1所述的荷花再生体系的构建方法，其特征在于：步骤(5)中初选过程中选择已经转绿的，胚饱满且有活性的胚进行接种。
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