CN105359961B - 一种通过幼胚离体挽救获得朱顶红‘苹果’杂交种的方法 - Google Patents

一种通过幼胚离体挽救获得朱顶红‘苹果’杂交种的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过幼胚离体挽救获得朱顶红‘苹果’杂交种的方法，以雌性不育的朱顶红‘苹果’做为母本进行杂交授粉，在幼胚败育前将其取出进行胚挽救培养，使杂交幼胚得以发育成正常种子，从而获得多种‘苹果’的杂交种后代。该方法有效地提高了杂种成活率并缩短了‘苹果’杂交后代的培育周期，为其育种工作的开展提高了有利的技术保障，对朱顶红的种质资源创新具有积极意义。

Description

一种通过幼胚离体挽救获得朱顶红‘苹果’杂交种的方法
技术领域
本发明涉及组培技术领域，具体涉及一种通过幼胚离体挽救获得朱顶红‘苹果’杂交种的方法。
背景技术
朱顶红(Hippeastrum Herb.)是石蒜科朱顶红属的多年生球根花卉植物，其花大色艳且冬春时节开花，盛开时花朵与浓绿的叶子相映成辉，观赏价值极高。朱顶红既是理想的年宵盆栽花卉及高档切花材料，也能在露地园林花境配置中起到很好的美化景观效果。然而朱顶红野生种主要分布于南美洲、巴西等热带、亚热带地区，我国没有朱顶红野生资源的分布。因此，我国朱顶红市场过分依赖进口，品种没有自主知识产权，在生产和销售上受到限制。
苹果(H.Apple Blossom)为单瓣大花型品种，花色为粉红色与纯白色相间并具有一定的香气，其花朵品质维持特性极优，且株形适中、植株的适应性和抗病性强，该品种综合了朱顶红育种目标中的多个重要的优良性状，可以成为优秀的朱顶红杂交母本品种。但是前人对其多年的杂交授粉研究发现：‘苹果’属于雌性不育品种，即作为母本时其杂交胚会发生败育从而不能结实(叶露，2007；吕文涛等，2010；石丰瑞等，2014)，这极大地阻碍了人们对其进行杂交育种的研究工作。因此，急需一套完善的人工胚挽救技术以获得‘苹果’的优良杂交种质资源，但在此之前还没有关于其杂交幼胚挽救及杂交种质的获得方法，更没有成功的实例。
发明内容
本发明的目的正是为了克服上述技术的不足，而提供一种通过幼胚离体挽救获得朱顶红‘苹果’杂交种的方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种通过幼胚离体挽救获得朱顶红‘苹果’杂交种的方法，该方法主要包括如下步骤：
1)、培养基的配制：
(1)基本培养基：MS培养基，其中蔗糖20～30g/L，琼脂5～9g/L，pH＝5.8；
(2)胚挽救培养基：MS+6-BA 0.1～0.5mg/L+NAA0.01～0.05mg/L+谷氨酰胺200～600mg/L+水解酪蛋白200～800mg/L+0.1～0.4g/L活性炭；
(3)壮苗生根培养基：MS+6-BA 0.01～0.03mg/L+NAA0.05～0.3mg/L；
2)、杂交授粉及外植体的选取：以‘苹果’做为母本进行杂交授粉，于杂交幼胚败育前摘取子房做为外植体；
3)、外植体消毒及接种：将步骤2)中的子房进行消毒处理后于无菌条件下接种于胚挽救培养基上进行离体培养，至种子成熟并萌发成幼苗；
4)、壮苗生根培养：将步骤3)获得的幼苗转至壮苗生根培养基上进行生根壮苗培养；
5)、炼苗移栽：将步骤4)中的生根壮苗从培养基中取出并洗掉根部的培养基，然后将其移栽至装有基质的营养钵中进行炼苗，1周后可移至田间种植从而获得‘苹果’的杂交后代植株。
进一步地，本发明在所述步骤2)中，杂交授粉是将父本花粉轻涂到母本‘苹果’开裂的柱头上后进行套袋，在授粉后2～3周左右摘取未成熟子房做为外植体。
进一步地，本发明在所述步骤3)中，消毒处理是以整个的未成熟子房为外植体材料，先用洗洁精溶液浸泡20min后再用自来水清洗，然后将其置于锥形瓶中进行消毒处理，依次在体积比为70％的酒精溶液和有效氯浓度为1％的次氯酸钠溶液中分别浸泡3min和6min，期间摇晃数次，最后用无菌水冲洗3～5遍，每遍1min。
进一步地，本发明在所述步骤3)中，所述的胚挽救是将消毒后的子房沿腹缝线切开后，再将子房横切成2～3段后接种到胚挽救培养基上，使部分胚柄和子房壁组织与培养基相接触进行离体培养，培养6～9周后幼胚可发育成种子并萌发长成幼苗。
进一步地，本发明在所述步骤3)中，接种后先于25±2℃的黑暗条件下培养24～72小时，再进行光照培养，所述光照培养的温度为25±2℃、光照强度为30～60μmol·m-2·s-1、光照时间为8～12小时/天。
进一步地，本发明在所述步骤4)中，所述光照培养的温度为25±2℃、光照强度为30～60μmol·m-2·s-1、光照时间为8～12小时/天。
本发明的优点是：本发明以雌性不育的朱顶红‘苹果’做为母本进行杂交授粉，在幼胚败育前将其取出进行人工离体挽救培养，使杂交幼胚得以发育成正常种子，从而获得多种‘苹果’的杂交种后代。该方法有效地提高了杂种成活率并缩短了‘苹果’杂交后代的培育周期，为其育种工作的开展提高了有利的技术保障。该方法可操作性强，简单实用，胚抢救的效果显著，可以广泛应用于朱顶红杂交幼胚的挽救，对朱顶红的种质资源创新具有积极意义。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步阐述，实施例将帮助更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。
实施例1：
本发明的目的是提供一种通过幼胚离体挽救获得朱顶红‘苹果’杂交种的方法，其步骤如下：
1)、培养基的配制：
(1)基本培养基：MS培养基，其中蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH＝5.8；
(2)胚挽救培养基：MS+6-BA 0.1～0.5mg/L+NAA0.01～0.05mg/L+谷氨酰胺200～600mg/L+水解酪蛋白200～800mg/L+0.1～0.4g/L活性炭；
(3)壮苗生根培养基：MS+6-BA 0.01～0.03mg/L+NAA0.05～0.3mg/L；
2)、杂交授粉及外植体的选取：以‘苹果’做为母本，将父本花粉轻涂到‘苹果’开裂的柱头上进行杂交授粉并套袋，在授粉后2～3周左右摘取未成熟子房；
3)、外植体消毒及接种：以整个的未成熟子房为外植体材料，先用洗洁精溶液浸泡20min后再用自来水清洗，然后将其置于锥形瓶中进行消毒处理，依次在体积比为70％的酒精溶液和有效氯浓度为1％的次氯酸钠溶液中分别浸泡3min和6min，期间摇晃数次，最后用无菌水冲洗3～5遍，每遍1min；将消毒后的子房沿腹缝线切开后，再将子房横切成2～3段后接种到胚挽救培养基上，使部分胚柄和子房壁组织与培养基相接触进行离体培养，培养6～9周后幼胚可发育成种子并萌发长成幼苗；接种后先于25±2℃的黑暗条件下培养24～72小时，再进行光照培养，所述光照培养的温度为25±2℃、光照强度为30～60μmol·m-2·s-1、光照时间为8～12小时/天。
4)、壮苗生根培养：将步骤3)获得的幼苗转至壮苗生根培养基上进行生根壮苗培养；光照培养的温度为25±2℃、光照强度为30～60μmol·m-2·s-1、光照时间为8～12小时/天。
5)、炼苗移栽：将步骤4)中的生根壮苗从培养基中取出并洗掉根部的培养基，然后将其移栽至装有基质的营养钵中进行炼苗，1周后可移至田间种植从而获得‘苹果’的杂交后代植株。
实施例2：
本发明的目的是提供一种通过幼胚离体挽救获得朱顶红‘苹果’杂交种的方法，其步骤如下：
1)、培养基的配制：
(1)基本培养基：MS培养基，其中蔗糖20～30g/L，琼脂5～9g/L，pH＝5.8；
(2)胚挽救培养基：MS+6-BA 0.1mg/L+NAA 0.02mg/L+谷氨酰胺400mg/L+水解酪蛋白400mg/L+0.2g/L活性炭；
(3)壮苗生根培养基：MS+6-BA 0.02mg/L+NAA 0.2mg/L；
2)、杂交授粉及外植体的选取：以‘苹果’做为母本，将父本‘舞后’的花粉轻涂到‘苹果’开裂的柱头上进行杂交授粉并套袋，在授粉后2～3周左右摘取未成熟子房；
3)、外植体消毒及接种：以整个的未成熟子房为外植体材料，先用洗洁精溶液浸泡20min后再用自来水清洗，然后将其置于锥形瓶中进行消毒处理，依次在体积比为70％的酒精溶液和有效氯浓度为1％的次氯酸钠溶液中分别浸泡3min和6min，期间摇晃数次，最后用无菌水冲洗3～5遍，每遍1min；将消毒后的子房沿腹缝线切开后，再将子房横切成2～3段后接种到胚挽救培养基上，使部分胚柄和子房壁组织与培养基相接触进行离体培养，培养6～9周后幼胚可发育成种子并萌发长成幼苗；接种后先于25±2℃的黑暗条件下培养48小时，再进行光照培养，所述光照培养的温度为25±2℃、光照强度为60μmol·m-2·s-1、光照时间为8小时/天。
4)、壮苗生根培养：将步骤3)获得的幼苗转至壮苗生根培养基上进行生根壮苗培养；光照培养的温度为25±2℃、光照强度为60μmol·m-2·s-1、光照时间为8小时/天。
5)、炼苗移栽：将步骤4)中的生根壮苗从培养基中取出并洗掉根部的培养基，然后将其移栽至装有基质的营养钵中进行炼苗，1周后可移至田间种植从而获得‘苹果’的杂交后代植株。
实施例3
本发明的目的是提供一种通过幼胚离体挽救获得朱顶红‘苹果’杂交种的方法，其步骤如下：
1)、培养基的配制：
(1)基本培养基：MS培养基，其中蔗糖20～30g/L，琼脂5～9g/L，pH＝5.8；
(2)胚挽救培养基：MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.05mg/L+谷氨酰胺200mg/L+水解酪蛋白400mg/L+0.2g/L活性炭；
(3)壮苗生根培养基：MS+6-BA 0.01mg/L+NAA 0.1mg/L；
2)、杂交授粉及外植体的选取：以‘苹果’做为母本，将父本‘花孔雀’的花粉轻涂到‘苹果’开裂的柱头上进行杂交授粉并套袋，在授粉后2～3周左右摘取未成熟子房；
3)、外植体消毒及接种：以整个的未成熟子房为外植体材料，先用洗洁精溶液浸泡20min后再用自来水清洗，然后将其置于锥形瓶中进行消毒处理，依次在体积比为70％的酒精溶液和有效氯浓度为1％的次氯酸钠溶液中分别浸泡3min和6min，期间摇晃数次，最后用无菌水冲洗3～5遍，每遍1min；将消毒后的子房沿腹缝线切开后，再将子房横切成2～3段后接种到胚挽救培养基上，使部分胚柄和子房壁组织与培养基相接触进行离体培养，培养6～9周后幼胚可发育成种子并萌发长成幼苗；接种后先于25±2℃的黑暗条件下培养24小时，再进行光照培养，所述光照培养的温度为25±2℃、光照强度为40μmol·m-2·s-1、光照时间为12小时/天。
4)、壮苗生根培养：将步骤3)获得的幼苗转至壮苗生根培养基上进行生根壮苗培养；光照培养的温度为25±2℃、光照强度为40μmol·m-2·s-1、光照时间为12小时/天。
5)、炼苗移栽：将步骤4)中的生根壮苗从培养基中取出并洗掉根部的培养基，然后将其移栽至装有基质的营养钵中进行炼苗，1周后可移至田间种植从而获得‘苹果’的杂交后代植株。
最后需要说明的是，除本实施例外，本发明还可以有其它实施方式和变形，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。凡本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种通过幼胚离体挽救获得朱顶红‘苹果’杂交种的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)、培养基的配制,所述的培养基包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分具体为：
(1)基本培养基：MS培养基，其中蔗糖20～30g/L，琼脂5～9g/L，pH＝5.8；
(2)胚挽救培养基：MS+6-BA 0.1～0.5mg/L+NAA0.01～0.05mg/L+谷氨酰胺200～600mg/L+水解酪蛋白200～800mg/L+0.1～0.4g/L活性炭；
(3)壮苗生根培养基：MS+6-BA 0.01～0.03mg/L+NAA0.05～0.3mg/L；
2)、杂交授粉及外植体的选取：以‘苹果’作为母本进行杂交授粉，并于杂交幼胚败育前摘取子房作为外植体；
3)、外植体消毒及接种：将步骤2)中的子房进行消毒处理后于无菌条件下接种于胚挽救培养基上进行离体培养，至种子成熟并萌发成幼苗；
4)、壮苗生根培养：将步骤3)获得的幼苗转至壮苗生根培养基上进行生根壮苗培养；
5)、炼苗移栽：将步骤4)中的生根壮苗从培养基中取出并洗掉根部的培养基，然后将其移栽至装有基质的营养钵中进行炼苗，1周后移至田间种植从而获得‘苹果’的杂交后代植株。
2.根据权利要求1所述的通过幼胚离体挽救获得朱顶红‘苹果’杂交种的方法，其特征在于：在所述步骤2)中，杂交授粉是将父本花粉轻涂到母本‘苹果’开裂的柱头上后进行套袋，在授粉后2～3周摘取未成熟子房。
3.根据权利要求1所述的通过幼胚离体挽救获得朱顶红‘苹果’杂交种的方法，其特征在于：在所述步骤3)中，消毒处理是以整个的未成熟子房为外植体材料，先用洗洁精溶液浸泡20min后再用自来水清洗，然后将其置于锥形瓶中进行消毒处理，依次在体积比为70％的酒精溶液和有效氯浓度为1％的次氯酸钠溶液中分别浸泡3min和6min，期间摇晃数次，最后用无菌水冲洗3～5遍，每遍1min。
4.根据权利要求1所述的通过幼胚离体挽救获得朱顶红‘苹果’杂交种的方法，其特征在于：在所述步骤3)中，所述的胚挽救是将消毒后的子房沿腹缝线切开后，再将子房横切成2～3段后接种到胚挽救培养基上，使部分胚柄和子房壁组织与培养基相接触进行离体培养，培养6～9周后幼胚能够发育成种子并萌发长成幼苗。
5.根据权利要求1所述的通过幼胚离体挽救获得朱顶红‘苹果’杂交种的方法，其特征在于：在所述步骤3)中，接种后先于25±2℃的黑暗条件下培养24～72小时，再进行光照培养，所述光照培养的温度为25±2℃、光照强度为30～60μmol·m-2·s-1、光照时间为8～12小时/天。
6.根据权利要求1所述的通过幼胚离体挽救获得朱顶红‘苹果’杂交种的方法，其特征在于：在所述步骤4)中，生根壮苗培养的培养条件为：光照培养的温度为25±2℃、光照强度为30～60μmol·m-2·s-1、光照时间为8～12小时/天。
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