CN104221861B - 一种利用幼胚拯救实现小豆和饭豆远缘杂交的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用幼胚拯救实现小豆和饭豆远缘杂交的方法，包括：1)材料准备：母本选用较早熟的饭豆材料，父本选用综合性状优良的小豆品种，精选无病饱满的籽粒以备种植；2)材料种植；3)杂交授粉；4)幼胚拯救；以及5)杂种幼苗移栽。本发明通过选用较早熟的饭豆材料作为母本，选用综合性状优良的小豆品种作为父本，获得的杂种幼胚可以直接长成幼苗，幼苗生长发育良好，移栽成活率高，远缘杂交F₁植株成株期可以正常开花结实，并且能够收获F₂种子。本发明方法能使大量远缘杂交胚继续发育成正常种子，有效避免远缘杂种胚败育，同时获得大量的远缘杂交后代，最终实现小豆和饭豆的种间远缘杂交。

Description

一种利用幼胚拯救实现小豆和饭豆远缘杂交的方法

技术领域

本发明涉及一种小豆和饭豆远缘杂交的方法，特别涉及一种利用幼胚拯救实现小豆和饭豆远缘杂交的方法，本发明属于生物技术育种领域。

背景技术

小豆[Vignaangularis(Willd.)Ohwi&Ohashi]原产于中国，除个别高寒地区,在我国各地均有种植,主产区在华北、东北和江淮地区。我国是世界上最大的小豆生产国，总产量和出口量均居世界第1位。豆象是小豆生产过程中的一种仓储性害虫，受豆象危害后的小豆重量降低、营养丧失、质量严重下降。生产上防治豆象危害的方法主要为磷化铝熏蒸法，这不仅增加了小豆生产的成本，而且容易导致农药残留，造成环境污染，影响食用者身体健康。防治豆象危害最为经济且环保的方法是培育抗豆象品种，利用作物本身的抗性防止豆象危害。但迄今为止，在现有的小豆种质资源中没有发现抗豆象种质材料，大部分小豆种质资源表现为完全感豆象。

栽培饭豆[Vignaumbellata(Thunb.)Ohwi&Ohashi]与小豆同属于豇豆属(Vigna)亚洲豇豆亚属(Ceratotropis)，它们的亲缘关系较近。研究表明大部分饭豆种质具有抗豆象的特性。因此，利用远缘杂交将饭豆的抗豆象基因导入小豆中是小豆抗豆象育种的有效途径。小豆与饭豆杂交后，幼荚一般能够正常发育，但生长10-20天即开始干枯掉落，不能获得有活力的杂交籽粒。剥开掉落的杂交荚可见发生败育的幼胚。因此在幼胚败育前采取幼胚拯救的途径有可能获得杂交后代植株，实现小豆和饭豆的远缘杂交。然而，小豆在我国作为一种小作物，其育种和遗传研究相对落后，目前的主要育种方法仍以自然变异选择和种内杂交选育等方法为主，远缘杂交育种方面的研究报道十分缺乏。国内未见小豆和饭豆远缘杂交方面的研究报道。

发明内容

针对以上问题，本发明提供了一种利用幼胚拯救实现小豆和饭豆远缘杂交的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的一种利用幼胚拯救实现小豆和饭豆远缘杂交的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)材料准备：母本选用较早熟的饭豆材料，父本选用综合性状优良的小豆品种，精选无病饱满的籽粒以备种植；

2)材料种植：小豆亲本分批错期播种，以保证两亲本花期相遇并有足够的花蕾进行杂交；

3)杂交授粉：当父母本均开花时，于每天下午4-6时进行去雄，第二天7-9时进行授粉；

4)幼胚拯救：取授粉后10-15天的杂交荚，用蒸馏水将杂交荚表面清洗干净，用尖头镊子将其剥开，取幼嫩籽粒；将幼嫩的杂交籽粒用70％酒精灭菌1分钟，0.1％升汞灭菌15分钟，灭菌蒸馏水冲洗3-5次；在解剖镜下剥取幼胚，将幼胚接种于装有灭菌培养基的组培瓶中，其中培养基为添加10μM6-苄基腺嘌呤的MS基本培养基，以上整个操作过程在超净工作台中完成；接种好的幼胚转移到光照培养箱中，培养条件为温度25℃，湿度55-65％，12小时光照，12小时暗环境，直至杂种幼苗长出；

5)杂种幼苗移栽。

在本发明中，饭豆生长期较长，为便于能够与小豆的花期相遇，优选的，所述的母本为播种至开花期为50-60天的饭豆材料，更优选为河北保定的较早熟的饭豆亲本材料F021，所述的父本为综合性状较好的吉林省小豆品种白红2号。

其中，所述的河北保定的较早熟的饭豆亲本材料F021由河北省农林科学院粮油作物研究所保存，提供。

在本发明中，优选的，小豆亲本材料白红2号分两批错期播种，第一批与饭豆材料同期播种，第二批错后3-15天播种(具体错期播种天数视亲本材料而定)，以保证两亲本花期相遇并有足够的花蕾进行杂交。

在本发明中，优选的，所述的杂交授粉的具体操作方法为选取第二天即将开放的花蕾，用酒精消毒过的尖头镊子剥开龙骨瓣，将10个花药全部去除，仅留柱头；去雄后将整个植株罩上防虫网，以防昆虫传粉，授粉时选取当天刚开放的花朵，用尖头镊子将整个包含柱头、花药和花丝的龙骨瓣取下，从龙骨瓣细的开口一端将其套在母本的柱头上。

在本发明中，优选的，所述的杂种幼苗移栽包括待幼苗长至8-12厘米高且生根良好时，打开培养瓶口，炼苗48小时；炼苗结束后小心地用镊子将幼苗从组培瓶中取出，洗净根上残留的培养基，将其移栽到花盆中，将整个花盆用透光性好的聚乙烯袋罩上，以保持高湿环境，促进幼苗成活。

相较于现有技术本发明的有益效果为：

1、通过利用本发明所述的杂交授粉方法，可以有效的保证杂交成荚率，为后续幼胚拯救提供材料保障。

2、通过选用较早熟的饭豆材料作为母本，选用综合性状优良的小豆品种作为父本，在本发明所述的幼胚拯救条件下，杂种幼胚可以直接长成幼苗。该方法可以有效避免远缘杂种胚败育，同时获得大量的远缘杂交后代，实现小豆和饭豆的种间远缘杂交。

3、获得的幼苗生长发育良好，移栽成活率高。

4、远缘杂交F₁植株成株期可以正常开花结实，并且能够收获F₂种子。

5、小豆初生叶为心形，较短圆，饭豆初生叶为披针形，较狭长，杂种植株的初生叶形介于两者之间，从幼苗初生叶形可以直观判断是否为真杂种。

附图说明

图1为利用幼胚拯救获得的小豆与饭豆远缘杂交幼苗照片；

图2为小豆与饭豆远缘杂交植株成株期照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1小豆和饭豆远缘杂交幼苗的获得

一、试验材料

选择收集自河北保定的较早熟的饭豆亲本材料F021和综合性状较好的吉林省小豆品种白红2号作为杂交亲本。

其中，所述的河北保定的较早熟的饭豆亲本材料F021由河北省农林科学院粮油作物研究所保存，提供。

白红2号为吉林省育成小豆品种，可从吉林白城市农科院申请或购买。

二、试验方法

材料种植：将亲本材料播种于花盆中，其中母本材料饭豆F021种植5盆，每盆留苗3株。父本材料白红2号分两批播种，第一批与饭豆同期播种，第二批错后7天播种，每批各5盆，每盆留苗3株，以保证花期相遇并有足够的花蕾进行杂交。

杂交授粉：当父母本均开花时，利用小豆和饭豆亲本进行正反杂交。具体操作方法为于每天下午4-6时选取母本第二天即将开放的花蕾，用酒精消毒过的尖头镊子剥开龙骨瓣，将10个花药全部去除，仅留柱头。去雄后将整个植株罩上防虫网，以防昆虫传粉。第二天7-9时，选取父本当天刚开放的花朵，用尖头镊子将整个龙骨瓣(包含柱头、花药和花丝)取下，从龙骨瓣细的开口一端将其套在母本的柱头上。

幼胚拯救：各取正反杂交授粉后10-15天的杂交荚，用蒸馏水将杂交荚表面清洗干净，用尖头镊子将其剥开，取幼嫩籽粒。在超净工作台中，将幼嫩的杂交籽粒用70v/v％酒精灭菌1分钟，0.1v/v％升汞灭菌15分钟，灭菌蒸馏水冲洗4次；在解剖镜下剥取幼胚，将幼胚接种于装有灭菌培养基的组培瓶中。培养基为MS基本培养基+10μM6-苄基腺嘌呤。接种好的幼胚转移到光照培养箱中，培养条件为温度25℃，湿度60％左右，12小时光照，12小时暗环境，直至杂种幼苗长出。

杂种幼苗移栽：待幼苗长至8-12厘米高且生根良好时，将培养瓶口渐进打开，炼苗48小时。小心地用镊子将幼苗从组培瓶中取出，洗净根上残留的培养基，将其移栽到花盆中。将整个花盆用透光性好的聚乙烯袋罩上，以保持高湿环境，促进幼苗成活。

真假杂种鉴定：小豆初生叶为心形，较短圆，饭豆初生叶为披针形，较狭长，杂种植株的初生叶形介于两者之间，从幼苗初生叶形可以直观判断是否为真杂种。

三、试验结果

图1为利用幼胚拯救获得的小豆与饭豆远缘杂交幼苗照片，图2为小豆与饭豆远缘杂交植株成株期照片。以上结果表明，采用本发明方法获得的杂种幼胚可以直接长成幼苗，且幼苗生长发育良好，移栽成活率高，远缘杂交F₁植株成株期可以正常开花结实，能够收获F₂种子。

试验例1、正反杂交的幼胚拯救结果的对比试验

1.通过对正反杂交的幼胚拯救结果进行比较(表1)，表明小豆做母本时，杂种幼胚多分化为愈伤组织；饭豆做母本时，杂种幼胚可以直接长成幼苗(图1)。因此利用饭豆做母本时更利于获得小豆与饭豆间的远缘杂交后代植株。

表1小豆与饭豆正反杂交幼胚拯救结果比较

杂交组合	拯救幼胚个数	形成愈伤个数	获得幼苗数
				白红2号×饭豆F021	56	43	2
饭豆F021×白红2号	53	3	28

2.白红2号做母本形成的2棵幼苗生长势弱，在移栽前死亡。饭豆F021做母本形成的28棵幼苗生长发育良好，16棵移栽成活。

3.小豆白红2号和饭豆F021的远缘杂交F₁植株成株期可以正常开花结实(图2)，能够收获F₂种子。

Claims (3)

1.一种利用幼胚拯救实现小豆和饭豆远缘杂交的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)材料准备：母本选用较早熟的，从播种至开花期为50-60天的饭豆材料，父本选用综合性状优良的吉林省小豆品种白红2号，精选无病饱满的籽粒以备种植；

2)材料种植：小豆亲本分批错期播种，以保证两亲本花期相遇并有足够的花蕾进行杂交；

3)杂交授粉：当父母本均开花时，于每天下午4-6时进行去雄，第二天7-9时进行授粉，所述的杂交授粉的具体操作方法为选取第二天即将开放的花蕾，用酒精消毒过的尖头镊子剥开龙骨瓣，将10个花药全部去除，仅留柱头；去雄后将整个植株罩上防虫网，以防昆虫传粉，授粉时选取当天刚开放的花朵，用尖头镊子将整个包含柱头、花药和花丝的龙骨瓣取下，从龙骨瓣细的开口一端将其套在母本的柱头上；

4)幼胚拯救：取授粉后10-15天的杂交荚，用蒸馏水将杂交荚表面清洗干净，用尖头镊子将其剥开，取幼嫩籽粒；将幼嫩的杂交籽粒用70％酒精灭菌1分钟，0.1％升汞灭菌15分钟，灭菌蒸馏水冲洗3-5次；在解剖镜下剥取幼胚，将幼胚接种于装有灭菌培养基的组培瓶中，其中培养基为添加10μM6-苄基腺嘌呤的MS基本培养基，以上整个操作过程在超净工作台中完成；接种好的幼胚转移到光照培养箱中，培养条件为温度25℃，湿度55-65％，12小时光照，12小时暗环境，直至杂种幼苗长出；

5)杂种幼苗移栽。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于小豆亲本材料白红2号分两批错期播种，第一批与饭豆材料同期播种，第二批错后3-15天播种，以保证两亲本花期相遇并有足够的花蕾进行杂交。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的杂种幼苗移栽包括待幼苗长至8-12厘米高且生根良好时，打开培养瓶口，炼苗48小时；炼苗结束后小心地用镊子将幼苗从组培瓶中取出，洗净根上残留的培养基，将其移栽到花盆中，将整个花盆用透光性好的聚乙烯袋罩上，以保持高湿环境，促进幼苗成活。