CN103975855A - 一种铁皮石斛的单倍体育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铁皮石斛的单倍体育种方法，包括下述步骤：a.取铁皮石斛开花3-6天的花朵，在常温下接种花粉后在低温4℃的花药愈伤组织诱导培养基中处理45-50小时，再进行常规培养；b.用NaCIO溶液灭菌15分钟，将消毒后的花蕾在无菌环境下剥出花药，接种于花药愈伤组织诱导培养基中，用保鲜膜封口；c.在25℃下进行黑暗恒温培养，2-3天，再在进行黑暗震荡培养12-15天，得到胚状体；d.收集胚状体，接种至分化培养基，得到单倍体植株；e.用秋水仙碱对单倍体植株的根系进行加倍处理。本发明可以很好的解决目前铁皮野生品系的保存和优质品种的开发的问题；从而可以改良铁皮石斛品种，同时可以选育铁皮石斛新品种。
Description
技术领域
本发明属于单倍体育种领域，尤其涉及一种铁皮石斛的单倍体育种方法。
背景技术
铁皮石斛是我国常用传统中药，具有养胃生津、滋阴清热等独特功效。在唐代医学经典《道藏》中，铁皮石斛被列为“中华九大仙草之首”，自唐宋以来，一直被列为皇室贡品。近年来大量深层次的研究开发发现铁皮石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用。因此人们对铁皮石斛的需求量大大增加，由于人们长期无限制，掠夺性和毁灭性的采挖，再加上石斛属的物种在自然界结实率低，种子因无胚乳，萌发率5％以下。铁皮石斛的国内自然野生资源已经枯竭，现已被国家列为二级保护植物。现有石斛生产企业盲目追求生产种苗速度，在品种选育上盲目选择产量高，生长快的品种进行种植。其品种抗病、抗逆行差，容易受到病害的侵袭。发病后用农药进行防治，这样生产的铁皮石斛药用价值低，甚至还有农药残留，远不能与野生的铁皮石斛相比。难以保证铁皮石斛的药用质量。严重阻碍了石斛行业的可持续性发展，石斛野生品系的保存和优质品种的开发迫在眉睫。
随着植物组培技术的发展，植物细胞具有“全能性”得到了广泛的证实，因此，在离体条件下用离体的方法培养花药，人为的改变小孢子的发育途径，使其配子体发育途径终止，转向孢子体发育，通过 器官发生或胚发生的途径，形成完整的单倍体植株，为人工大量生产单倍体提供有效的手段。通过这一途径再生的单倍体植株，经自发加倍或者人工诱发加倍，获得纯合二倍体植株，从而为进一步的育种和遗传研究提供有用材料。利用花药花粉培养获得单倍体进行育种是植物育种技术上的一项重大改革，它可以与目前所采用的杂交育种，人工诱变育种，远缘杂交育种的方法结合，用以克服这些方法中的一些不足，也可以直接用此法创造新的类型。利用花药培养产生单倍体植株的方法已经在许多具有经济价值和观赏价值的植物上取得了成功，这不但为植物育种手段增添了一项新内容，同时也使园艺植物的有效性进一步在遗传上得到加强。因为单倍体只含有一套染色体，这套染色体存在着所有基因，所以即使隐性基因也能在表型中的到表达。加倍的单倍体容易获得纯合且能育的二倍体，这就使得一些天然的基因得到有效的保存。
发明内容
本发明为了解决上述现有技术存在的缺陷和不足，提供了一种可以改良铁皮石斛品种，同时可以选育铁皮石斛新品种的铁皮石斛的单倍体育种方法。
本发明的技术方案：1.一种铁皮石斛的单倍体育种方法，包括下述步骤：
a.取铁皮石斛开花3-6天的花朵，培养前在常温下接种花粉后在低温4℃的花药愈伤组织诱导培养基中处理45-50小时，再进行常规培养；
b.用浓度为5％-6％的NaCIO溶液灭菌15分钟，无菌水冲洗5次，将消毒后的花蕾在无菌环境下剥出花药，尽量防止花药受到伤害，接种于花药愈伤组织诱导培养基中，用保鲜膜封口；
c.在25℃下进行黑暗恒温培养，2-3天，再在进行黑暗震荡培养12-15天，得到胚状体；
d.收集胚状体，接种至分化培养基，再在组培室中光照培养12小时/天，温度控制在24-26℃；待植株发育良好，开盖炼苗5天；炼苗后移入营养基质中培养，得到单倍体植株；
e.用秋水仙碱对单倍体植株的根系进行加倍处理，利用流式细胞仪对所有幼苗新长出的叶片进行倍性分析，如果是单倍体则进行秋水仙碱加倍处理；植株恢复正常后移入大田进行正常栽培。
本发明采用铁皮石斛成熟的花粉进行培养。铁皮石斛的花为总状花序，常从落了叶的老茎上部发出，具2-3朵花；花序柄长5-10毫米，基部具2-3枚短鞘；花序轴回折状弯曲，长2-4厘米；花苞片干膜质，浅白色，卵形，长5-7毫米，先端稍钝；花梗和子房长2-2.5厘米；萼片和花瓣黄绿色，近相似，长圆状披针形，长约1.8厘米，宽4-5毫米，先端锐尖，具5条脉；侧萼片基部较宽阔，宽约1厘米；萼囊圆锥形，长约5毫米，末端圆形；唇瓣白色，基部具1个绿色或黄色的胼胝体，卵状披针形，比萼片稍短，中部反折，先端急尖，不裂或不明显3裂，中部以下两侧具紫红色条纹，边缘多少波状；唇盘密布细乳突状的毛，并且在中部以上具1个紫红色斑块；蕊柱黄绿色，长约3毫米，先端两侧各具1个紫点；蕊柱足黄绿色带紫红色条纹， 疏生毛；药帽白色，长卵状三角形，长约2.3毫米，顶端近锐尖并且2裂。随着花的成熟，黄颜色会渐渐加深。从而选取开花3-6天的花药进行培养。
本发明方法在胚状体诱导过程当中，对花蕾进行了低温诱导，提高了胚状体发生频率和胚成活率，其胚成活率高达95％以上。
本发明利用秋水仙碱对单倍体植株的根系进行加倍处理，通过筛选秋水仙碱的浓度，其有效加倍率可达80％左右。
优选地，步骤a中花朵培养前在常温下接种花粉后在低温4℃的花药愈伤组织诱导培养基中处理的时间为48小时。
本发明中花药愈伤组织的诱导效果显著高于其他的处理，愈伤诱导率达到24.7％。
优选地，步骤b中NaCIO溶液的浓度为5.6％。
优选地，所述花药愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+2％BA+1.5％NAA。
优选地，所述分化培养基的配方为：1/2MS+0.5％BA+1％NAA。
优选地，步骤e中在幼苗健壮时采用浓度为150～300mg/L的秋水仙碱溶液进行根系浸根处理15—30h。
优选地，在幼苗健壮时采用浓度为150mg/L的秋水仙碱溶液进行根系浸根处理30h。
优选地，在幼苗健壮时采用浓度为300mg/L的秋水仙碱溶液进行根系浸根处理15h。
优选地，所述MS培养基的配方为：
本发明中NaCIO溶液为次氯酸钠溶液；本发明中的BA为乙酸丁酯；本发明中的NAA为萘乙酸。
本发明通过对铁皮石斛的花药进行离体培养，获得由雄性配子体细胞发育而来的单倍体胚状体，然后对单倍体胚状体进行再生培养、染色体加倍，从而获得纯系。该育种方法避免了铁皮石斛的授精过程，从而避免了杂合体的出现，简化了杂合体的纯合程序，大幅缩短了育种进程，提高了育种的效率，解决了现有铁皮石斛优质品种很难纯合的问题。
本发明单倍体育种的方法是利用花粉经过诱导愈伤后再分化为植株，从而获得铁皮石斛单倍体植株；可以很好的解决目前铁皮野生品系的保存和优质品种的开发的问题；从而可以改良铁皮石斛品种，同时可以选育铁皮石斛新品种具有巨大的潜在商业价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明，但并不是对本发明保护范围的限制。
实施例1
一种铁皮石斛的单倍体育种方法，包括下述步骤：
a.取铁皮石斛开花3-6天的花朵，培养前在常温下接种花粉后在低温4℃的花药愈伤组织诱导培养基中处理48小时，再进行常规培养；
b.用浓度为5.6％的NaCIO溶液灭菌15分钟，无菌水冲洗5次，将消毒后的花蕾在无菌环境下剥出花药，尽量防止花药受到伤害，接 种于花药愈伤组织诱导培养基中，用保鲜膜封口；
c.在25℃下进行黑暗恒温培养，2-3天，再在进行黑暗震荡培养12-15天，得到胚状体；
d.收集胚状体，接种至分化培养基，再在组培室中光照培养12小时/天，温度控制在24-26℃；待植株发育良好，开盖炼苗5天；炼苗后移入营养基质中培养，得到单倍体植株；
e.用秋水仙碱对单倍体植株的根系进行加倍处理，利用流式细胞仪对所有幼苗新长出的叶片进行倍性分析，如果是单倍体则进行秋水仙碱加倍处理；植株恢复正常后移入大田进行正常栽培。
所述花药愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+2％BA+1.5％NAA。
所述分化培养基的配方为：1/2MS+0.5％BA+1％NAA。
步骤e中在幼苗健壮时采用浓度为150mg/L的秋水仙碱溶液进行根系浸根处理30h。
实施例2
一种铁皮石斛的单倍体育种方法，包括下述步骤：
a.取铁皮石斛开花3-6天的花朵，培养前在常温下接种花粉后在低温4℃的花药愈伤组织诱导培养基中处理48小时，再进行常规培养；
b.用浓度为5.6％的NaCIO溶液灭菌15分钟，无菌水冲洗5次，将消毒后的花蕾在无菌环境下剥出花药，尽量防止花药受到伤害，接种于花药愈伤组织诱导培养基中，用保鲜膜封口；
c.在25℃下进行黑暗恒温培养，2-3天，再在进行黑暗震荡培养 12-15天，得到胚状体；
d.收集胚状体，接种至分化培养基，再在组培室中光照培养12小时/天，温度控制在24-26℃；待植株发育良好，开盖炼苗5天；炼苗后移入营养基质中培养，得到单倍体植株；
e.用秋水仙碱对单倍体植株的根系进行加倍处理，利用流式细胞仪对所有幼苗新长出的叶片进行倍性分析，如果是单倍体则进行秋水仙碱加倍处理；植株恢复正常后移入大田进行正常栽培。
所述花药愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+2％BA+1.5％NAA。
所述分化培养基的配方为：1/2MS+0.5％BA+1％NAA。
步骤e中在幼苗健壮时采用浓度为300mg/L的秋水仙碱溶液进行根系浸根处理15h。
本发明中MS培养基配方见表1：
表1。
Claims (9)
1.一种铁皮石斛的单倍体育种方法，其特征在于：其包括下述步骤：
a.取铁皮石斛开花3-6天的花朵，培养前在常温下接种花粉后在低温4℃的花药愈伤组织诱导培养基中处理45-50小时，再进行常规培养；
b.用浓度为5％-6％的NaCIO溶液灭菌15分钟，无菌水冲洗5次，将消毒后的花蕾在无菌环境下剥出花药，尽量防止花药受到伤害，接种于花药愈伤组织诱导培养基中，用保鲜膜封口；
c.在25℃下进行黑暗恒温培养，2-3天，再在进行黑暗震荡培养12-15天，得到胚状体；
d.收集胚状体，接种至分化培养基，再在组培室中光照培养12小时/天，温度控制在24-26℃；待植株发育良好，开盖炼苗5天；炼苗后移入营养基质中培养，得到单倍体植株；
e.用秋水仙碱对单倍体植株的根系进行加倍处理，利用流式细胞仪对所有幼苗新长出的叶片进行倍性分析，如果是单倍体则进行秋水仙碱加倍处理；植株恢复正常后移入大田进行正常栽培。
2.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛的单倍体育种方法，其特征在于：步骤a中花朵培养前在常温下接种花粉后在低温4℃的花药愈伤组织诱导培养基中处理的时间为48小时。
3.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛的单倍体育种方法，其特征在于：步骤b中NaCIO溶液的浓度为5.6％。
4.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛的单倍体育种方法，其特征在于：所述花药愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+2％BA+1.5％NAA。
5.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛的单倍体育种方法，其特征在于：所述分化培养基的配方为：1/2MS+0.5％BA+1％NAA。
6.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛的单倍体育种方法，其特征在于：步骤e中在幼苗健壮时采用浓度为150～300mg/L的秋水仙碱溶液进行根系浸根处理15—30h。
7.根据权利要求6所述的一种铁皮石斛的单倍体育种方法，其特征在于：在幼苗健壮时采用浓度为150mg/L的秋水仙碱溶液进行根系浸根处理30h。
8.根据权利要求6所述的一种铁皮石斛的单倍体育种方法，其特征在于：在幼苗健壮时采用浓度为300mg/L的秋水仙碱溶液进行根系浸根处理15h。
9.根据权利要求4或5所述的一种铁皮石斛的单倍体育种方法，其特征在于：所述MS培养基的配方为：
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| CN107624647A (zh) * | 2017-10-20 | 2018-01-26 | 皖西学院 | 一种抗白绢病的霍山石斛纯合体株系的培育方法 |
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| CN108464184A (zh) * | 2018-04-03 | 2018-08-31 | 昆明健格中药材种植有限公司 | 一种林下中药材立体复合种植方法 |
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