CN104472365B - 富贵榕组培快繁育苗方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富贵榕组培快繁育苗方法，其通过外植体培育、外植体诱导、无菌材料驯化与继代扩繁、壮苗生根培养和温室种植五个步骤实现。其选择具有优良母本性状多年生、优良、健壮、无病虫害的富贵榕为母株；各步骤中的MS改良培养基是将标准MS培养基中KNO₃的用量改为950mg.L^‑1，NH₄NO₃的用量改为825mg.L^‑1，并在培育过程中及时剔出纯黄的芽和纯绿的芽。本发明的富贵榕组培快繁育苗方法，育苗成活率98％以上,变异率≤1.0％，在短期内即可获得大量优质苗木。

Description

富贵榕组培快繁育苗方法

技术领域

本发明涉及植物无性繁殖技术领域，具体为富贵榕[Ficus altissimacv.'YellowGem']组培快繁育苗方法。

技术背景

富贵榕又称金叶榕、马榕、鸡榕、大青树、大叶榕(海南岛)，为桑科榕属，多年生常木本观叶植物。原产中国海南、广西、云南(南部至中部、西北部)、江西南部、四川及印度(安达曼群岛)、缅甸、越南、泰国、马来西亚、印度尼西亚、菲律宾等国。其性喜高温多湿气候，耐贫瘠和干旱，抗风、污染能力强。生长迅速，移栽容易成活。

富贵榕叶片上散布黄色斑块，适合用作行道树、风景树和遮荫树。又为优良的紫胶虫寄主树。目前颇受广大消费者喜爱，市场上对于富贵榕优质苗木的需求不断增长。

现有的富贵榕组织培养中存在无菌体获得率低、外植体易褐化死亡、增殖繁殖系数低、组培变异高等影响种苗产业化生产等核心技术现象。

要加速富贵榕的产业开发，必须建立规模化生产基地，如何使富贵榕优良母株的各种优良性状在后代个体中遗传性稳定，提高成活率和生长整齐度，是实现富贵榕种苗产业开发、生产关键技术。

发明内容

本发明目的在于提供一种富贵榕组培快繁育苗方法，其可有效解决富贵榕组织培养中存在无菌体获得率低、外植体易褐化死亡、增殖繁殖系数低、组培变异高等现象，在短期内获得大量优质的富贵榕种苗。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

富贵榕组培快繁育苗方法，通过如下步骤实现：

一、外植体培育

选择具有优良母本性状多年生、优良、健壮、无病虫害的富贵榕为母株，在生长旺季4-8月份新芽萌动时先用20-200PPM的GA3按常规用量进行叶面喷施，隔天一次共3次后，去顶芽，防止水分进入，光强控制在5-10μmol·m^-2·s^-1，母株停止浇肥；约10-20天后从枝条新长出小芽，待新芽长至2-5cm且芽叶片有黄绿斑即可剪下1-2cm作为外植体；

二、外植体诱导

将采集好的外植体清洁漂洗后，切去全部叶片或切去枝条末梢的0.5-1.0cm，用消毒液进行消毒后,再用无菌水漂洗，然后切去截面变色部分立即接种于经灭菌好的培养基中进行第一代无菌材料的培养，此培养基采用MS改良培养基，并添加有6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.1-5.0mg·L^-1、a-萘乙酸(NAA)0.1-0.5mg·L^-1、益培灵0.01-2.0mg·L^-1、蔗糖20-35g·L^-1和卡拉胶6.5g·L^-1，调整pH值为5.7-6.3；

培养条件：温度26±1℃，光照14±1H/D,光强10-20μmol·m^-2·s^-1，湿度40-65％，培养周期35±3D；

三、无菌材料驯化与继代扩繁

(一)无菌材料的驯化

第一代无菌材料培养后当新芽叶片展开，待芽长到10mm时从芽基部切除，保留顶芽5-8mm，如有丛生芽按1-3芽/团进行方向性切割，只保留芽叶片黄绿相间的芽，纯黄的芽和纯绿的芽淘汰；

将切割好的芽/团接种于经灭菌好的培养基中，此培养基采用MS改良培养基，并添加维生素C 30-100mg·L^-1、6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.1-3.0mg·L^-1、氯吡脲(CPPU)0.1-2.0mg·L^-1、萘乙酸(NAA)0.1-0.4mg·L^-1、蔗糖20-30g·L^-1和卡拉胶6.5g·L^-1，调整pH值为5.7-6.3；

培养条件：温度26±1℃，光照14±1H/D,光强35-70μmol·m^-2·s^-1，湿度40-65％，培养周期30±3D；

经上述4-5次(代)驯化培养后，即完成驯化进入扩繁阶段；

(二)无菌材料的继代扩繁

进入扩繁阶段的材料长成6-10芽/团，按2-3芽/团切割，若团块芽高度大于10mm，则去顶留5-8mm；只保留芽叶片黄绿相间的芽，纯黄的芽和纯绿的芽淘汰，将切割好的芽团接种于培养基中，此培养基采用MS改良培养基，并添加6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.1-3.0mg·L^-1、氯吡脲(CPPU)0.01-0.1.0mg·L^-1、萘乙酸(NAA)0.01-0.3mg·L^-1、蔗糖20-35g·L^-1和卡拉胶6.5g·L^-1，调整pH值为5.7-6.3，扩繁倍率3.0-6.0；

培养条件：温度26±1℃，光照14±1H/D,光强35-70μmol·m^-2·s^-1，湿度40-65％，培养周期30±5D；

四、壮苗生根培养

(一)壮苗培养

将经扩繁培养后的芽团按3-4芽/团方向性切割后，接种到壮苗培养基中，壮苗培养基采用MS改良培养基，并添加萘乙酸(NAA)0.1-1g·L^-1、活性炭0.5g·L^-1、蔗糖15-35g·L^-1和卡拉胶6.5g·L^-1，调整pH值为5.7-6.3；

培养条件：温度24±1℃，光照14±1H/D，光强60-120μmol·m^-2·s^-1，湿度40-65％，培养周期25±3D；

(二)生根培养

当团块上的芽长度达15-25mm、茎粗度≥1mm、具有3片完整叶时，按单芽进行切割，切下来的单芽接种到生根培养基中，生根培养基采用MS改良培养基，并添加吲哚丁酸(IBA)1-3mg·L^-1、萘乙酸(NAA)0.01-0.5mg·L^-1、活性炭0.1-1g·L^-1、蔗糖15-35g·L^-1和卡拉胶6.5g·L^-1，调整pH值为5.7-6.3；

培养条件：温度23±1℃，光照14±1H/D，光强70-150μmol·m^-2·s^-1，湿度40-65％，培养周期15±2D；

生根培养7-10D后长根，2周后长根率达99.5％，根数2-8条，植株高度25-55mm，植物株健壮、叶片黄绿相间即可用于种植；

五、温室种植

将生根苗放置温室炼苗，炼苗场所要求光强80-160μmol·m^-2·s^-1，湿度60-80％，温度20-30℃，炼苗3-7天后取出苗，去除叶片纯黄的苗和叶片纯绿的苗,留下的苗将其上的培养基清洗干净并消毒后即可种植，基质采用体积比为3-5:0.5-1.5的泥炭土和珍珠岩的混合物，种植后做好遮阴、保湿，控制温度22-30℃，湿度80-95％，种植4-8个月，得到株高45-70mm，具有4片以上黄绿相间的完整植株，达到出货标准；

上述各步骤中的MS改良培养基是将标准MS培养基中KNO₃的用量改为950mg.L^-1，NH₄NO₃的用量改为825mg.L^-1。

上述步骤二中，对外植体的清洁漂洗采用如下方式：将采集好的外植体让其汁液流干后装于无菌容器中，用医用棉花沾质量百分比为0.01-0.03％的洗洁精轻擦芽上灰尘，再用无菌水冲洗干净。

上述步骤二中，切去全部叶片或切去枝条末梢的0.5-1.0cm后对外植体的消毒、漂洗采用如下方式：用质量百分比为1-3％的NaHClO溶液消毒3-5分钟后,再用无菌水漂洗3-5次，每次1-3分钟。

采用上述方案后，本发明的富贵榕组培快繁育苗方法，育苗成活率98％以上,变异率≤1.0％，在短期内即可获得大量优质苗木。其优点如下：

A、外植体的培育

选择具有优良母本性状多年生、优良、健壮、无病虫害的富贵榕为母株，在生长旺季4-8月份新芽萌动时先用20-200PPM的GA3按常规用量进行叶面喷施，隔天一次共3次后，去顶芽，防止水分进入，光强控制在5-10μmol·m^-2·s^-，母株停止浇肥；约10-20天后从枝条新长出小芽，待新芽长至2-5cm且芽叶片有黄绿斑剪下1-2cm作为外植体；这样保证母株遗传性状稳定,可大大提高无菌外植体获得率，克服了采用常规采用顶芽或茎段为外植体导致其褐化或细菌污染死亡率，同时这样处理品的外植体到产业化生产,内生菌污染极低,这是组培关键的培育措施。

B、外植体培育季节

本发明在生长季节即4-8月份采集外植体，有利于缩短驯化周期，无菌材料生长相对较快，及时发现培育过程中叶色的分离或变异，剔出纯黄的芽和纯绿的芽，保证诱导芽的品种特性，容易提高扩繁系数稳定。

C、各阶段培养基

本发明对诱导、扩繁、壮苗、生根的培养基改良及各类激素的合理利用，有效保证各阶段芽的稳定生长，芽团均匀，枝条变异低，各阶段系数稳定，保证了产业化快繁的需求。

D、切割方法

继代团块切割方法决定了后期材料长势与扩繁系数，本发明在组培快繁各阶段都有淘汰或剔出纯黄和纯绿的枝芽、芽团，增殖切割对芽数控制，过高芽去顶，芽团方向性切割等均影响到芽团的质量，降低变异增加及提升有效扩繁系数，如芽过高不去顶，主芽顶端优势明显，扩繁系数也会降低，纯黄或纯绿叶不及时去除会在增殖过渡中随代数增加，无效增殖芽产生更多，最终导致变异大，不具有母本性状。

E、组培苗各阶段培养条件，保证其能够稳定生长，尤其是植物有效光合作用光照度值、温度值确认，避免有效光照不足导致植株玻璃化，徒长，变异等，反之则不利于后期的种植，保证生根苗具有母本特性，提升其筛苗的成活率。

具体实施方式

本发明的富贵榕组培快繁育苗方法，通过如下步骤实现：

1、外植体培育

选择具有优良母本性状多年生、优良、健壮、无病虫害的富贵榕为母株，在生长旺季4-8月份新芽萌动时先用20-200PPM的GA3按常规用量进行叶面喷施，隔天一次共3次后，去顶芽，防止水分进入，光强控制在5-10μmol·m^-2·s^-1，母株停止浇肥；约10-20天后从枝条新长出小芽，待新芽长至2-5cm且芽叶片有黄绿斑即可剪下1-2cm作为外植体；

2、外植体诱导

将采集好的外植体让其汁液流干后装于无菌容器中，用医用棉花沾质量百分比为0.01-0.03％的洗洁精轻擦芽上灰尘，再用无菌水冲洗干净后转入净化工作台切去切去全部叶片或切去枝条末梢的0.5-1.0cm，用质量百分比为1-3％的NaHClO溶液消毒3-5分钟后,再用无菌水漂洗3-5次，每次1-3分钟；

将漂洗好的外植体切去截面变色部分立即接种于经灭菌好的培养基中进行第一代无菌材料的培养，此培养基采用MS改良培养基，并添加有6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.1-5.0mg·L^-1、a-萘乙酸(NAA)0.1-0.5mg·L^-1、益培灵0.01-2.0mg·L^-1、蔗糖20-35g·L^-1和卡拉胶6.5g·L^-1，调整pH值为5.7-6.3；

培养条件：温度26±1℃，光照14±1H/D,光强10-20μmol·m^-2·s^-1，湿度40-65％，培养周期35±3D。

经过多次测试采用此方法培育外植体，污染相对少,外植体培养后褐化程度轻，可缩短后期的驯化周期，多次测试按上述方法最高无菌材料获得率65％以上。

3、无菌材料驯化与继代扩繁

3.1无菌材料的驯化

第一代无菌材料培养后当新芽叶片展开，待芽长到10mm时从芽基部切除，保留顶芽5-8mm，如有丛生芽按1-3芽/团进行方向性切割，只保留芽叶片黄绿相间的芽，纯黄的芽和纯绿的芽淘汰；

将切割好的芽/团接种于经灭菌好的的培养基中，此培养基采用MS改良培养基，并添加维生素C 30-100mg·L^-1、6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.1-3.0mg·L^-1、氯吡脲(CPPU)0.1-2.0mg·L^-1、萘乙酸(NAA)0.1-0.4mg·L^-1、蔗糖20-30g·L^-1和卡拉胶6.5g·L^-1，调整pH值为5.7-6.3；

培养条件：温度26±1℃，光照14±1H/D,光强35-70μmol·m^-2·s^-1，湿度40-65％，培养周期30±3D。

经上述4-5次(代)驯化培养后，即完成驯化进入扩繁阶段。

3.2无菌材料的继代扩繁

进入扩繁阶段的材料长成6-10芽/团，按2-3芽/团切割，若团块芽高度大于10mm，则去顶留5-8mm，只保留芽叶片黄绿相间的芽，纯黄的芽和纯绿的芽淘汰，将切割好的芽团接种于培养基中，此培养基采用MS改良培养基，并添加6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.1-3.0mg·L^-1、氯吡脲(CPPU)0.01-0.1.0mg·L^-1、萘乙酸(NAA)0.01-0.3mg·L^-1、蔗糖20-35g·L^-1和卡拉胶6.5g·L^-1，调整pH值为5.7-6.3，扩繁倍率3.0-6.0。

继代团块切割方法以及纯黄纯绿芽的淘汰决定后期有效扩繁系数，如不去掉纯黄或绿芽，则培养芽团叶色会变成纯绿或纯黄，这样的芽或芽团培养后代所新抽芽不具有母本品种特性，如未去干净，后代变异随着代数增加影响其快繁效率。

培养条件：温度26±1℃，光照14±1H/D,光强35-70μmol·m^-2·s^-1，湿度40-65％，培养周期30±5D。

4、壮苗生根培养

4.1壮苗培养

将经扩繁培养后的芽团按3-4芽/团方向性(芽的生长方向一致性)切割后，接种到壮苗培养基中，壮苗培养基采用MS改良培养基，并添加萘乙酸(NAA)0.1-1g·L^-1、活性炭0.5g·L^-1、蔗糖15-35g·L^-1和卡拉胶6.5g·L^-1，调整pH值为5.7-6.3；

培养条件：温度24±1℃，光照14±1H/D，光强60-120μmol·m^-2·s^-1，湿度40-65％，培养周期25±3D。

4.2生根培养

当团块上的芽长度达15-25mm、茎粗度≥1mm、具有3片完整叶，按单芽(纯黄和纯绿芽淘汰)进行切割，切下来的单芽接种到生根培养基中，生根培养基采用MS改良培养基，并添加吲哚丁酸(IBA)1-3mg·L^-1、萘乙酸(NAA)0.01-0.5mg·L^-1、活性炭0.1-1g·L^-1、蔗糖15-35g·L^-1和卡拉胶6.5g·L^-1，调整pH值为5.7-6.3；

培养条件：温度23±1℃，光照14±1H/D，光强70-150μmol·m^-2·s^-1，湿度40-65％，培养周期15±2D。

生根培养7-10D后长根，2周后长根率达99.5％，根数2-8条，植株高度25-55mm，植物株健壮、叶片黄绿相间即可用于种植。

5、温室种植

将生根苗放置温室炼苗，炼苗场所要求：光强80-160μmol·m^-2·s^-1，湿度60-80％，温度20-30℃，炼苗3-7D后取出苗，去除叶片纯黄或纯绿的苗,留下的苗将其上的培养基清洗干净，并用800倍百菌清或多菌灵浸泡5-8分钟进行消毒,消毒后捞起种植,基质采用体积比为3-5:0.5-1.5的丹麦品氏泥炭土(粒度0-10mm)和珍珠岩的混合物，种植后做好遮阴、保湿，控制温度22-30℃，湿度80-95％，种植4-8个月，育苗成活率98％以上,变异率≤1.0％(变异是指植株主要叶片是纯黄或纯绿)，株高45-70mm，4片以上黄绿相间的完整植株，与品种特性一致，根系完整，达到出货标准。

本发明上述各步骤中，MS改良培养基是将标准MS培养基中KNO₃的用量改为950mg.L^-1，NH₄NO₃的用量改为825mg.L^-1。

Claims (3)

1.富贵榕组培快繁育苗方法，其特征在于，通过如下步骤实现：

一、外植体培育

选择具有优良母本性状多年生、优良、健壮、无病虫害的富贵榕为母株，在生长旺季4-8月份新芽萌动时先用20-200PPM的GA3按常规用量进行叶面喷施，隔天一次共3次后，去顶芽，防止水分进入，光强控制在5-10μmol·m^-2·s^-1，母株停止浇肥；10-20天后从枝条新长出小芽，待新芽长至2-5cm且芽叶片有黄绿斑即可剪下1-2cm作为外植体；

二、外植体诱导

将采集好的外植体清洁漂洗后，切去全部叶片或切去枝条末梢的0.5-1.0cm，用消毒液进行消毒后,再用无菌水漂洗，然后切去截面变色部分立即接种于经灭菌好的培养基中进行第一代无菌材料的培养，此培养基采用MS改良培养基，并添加有6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.1-5.0mg·L^-1、a-萘乙酸(NAA)0.1-0.5mg·L^-1、益培灵0.01-2.0mg·L^-1、蔗糖20-35g·L^-1和卡拉胶6.5g·L^-1，调整pH值为5.7-6.3；

培养条件：温度26±1℃，光照14±1H/D,光强10-20μmol·m^-2·s^-1，湿度40-65％，培养周期35±3D；

三、无菌材料驯化与继代扩繁

(一)无菌材料的驯化

第一代无菌材料培养后当新芽叶片展开，待芽长到10mm时从芽基部切除，保留顶芽5-8mm，如有丛生芽按1-3芽/团进行方向性切割，只保留芽叶片黄绿相间的芽，纯黄的芽和纯绿的芽淘汰；

将切割好的芽/团接种于经灭菌好的培养基中，此培养基采用MS改良培养基，并添加维生素C 30-100mg·L^-1、6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.1-3.0mg·L^-1、氯吡脲(CPPU)0.1-2.0mg·L^-1、萘乙酸(NAA)0.1-0.4mg·L^-1、蔗糖20-30g·L^-1和卡拉胶6.5g·L^-1，调整pH值为5.7-6.3；

培养条件：温度26±1℃，光照14±1H/D,光强35-70μmol·m^-2·s^-1，湿度40-65％，培养周期30±3D；

经上述4-5次驯化培养后，即完成驯化进入扩繁阶段；

(二)无菌材料的继代扩繁

进入扩繁阶段的材料长成6-10芽/团，按2-3芽/团切割，若团块芽高度大于10mm，则去顶留5-8mm；只保留芽叶片黄绿相间的芽，纯黄的芽和纯绿的芽淘汰，将切割好的芽团接种于培养基中，此培养基采用MS改良培养基，并添加6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.1-3.0mg·L^-1、氯吡脲(CPPU)0.01-0.1.0mg·L^-1、萘乙酸(NAA)0.01-0.3mg·L^-1、蔗糖20-35g·L^-1和卡拉胶6.5g·L^-1，调整pH值为5.7-6.3，扩繁倍率3.0-6.0；

培养条件：温度26±1℃，光照14±1H/D,光强35-70μmol·m^-2·s^-1，湿度40-65％，培养周期30±5D；

四、壮苗生根培养

(一)壮苗培养

将经扩繁培养后的芽团按3-4芽/团方向性切割后，接种到壮苗培养基中，壮苗培养基采用MS改良培养基，并添加萘乙酸(NAA)0.1-1g·L^-1、活性炭0.5g·L^-1、蔗糖15-35g·L^-1和卡拉胶6.5g·L^-1，调整pH值为5.7-6.3；

培养条件：温度24±1℃，光照14±1H/D，光强60-120μmol·m^-2·s^-1，湿度40-65％，培养周期25±3D；

(二)生根培养

当团块上的芽长度达15-25mm、茎粗度≥1mm、具有3片完整叶时，按单芽进行切割，切下来的单芽接种到生根培养基中，生根培养基采用MS改良培养基，并添加吲哚丁酸(IBA)1-3mg·L^-1、萘乙酸(NAA)0.01-0.5mg·L^-1、活性炭0.1-1g·L^-1、蔗糖15-35g·L^-1和卡拉胶6.5g·L^-1，调整pH值为5.7-6.3；

培养条件：温度23±1℃，光照14±1H/D，光强70-150μmol·m^-2·s^-1，湿度40-65％，培养周期15±2D；

生根培养7-10D后长根，2周后长根率达99.5％，根数2-8条，植株高度25-55mm，植物株健壮、叶片黄绿相间即可用于种植；

五、温室种植

将生根苗放置温室炼苗，炼苗场所要求光强80-160μmol·m^-2·s^-1，湿度60-80％，温度20-30℃，炼苗3-7天后取出苗，去除叶片纯黄的苗和叶片纯绿的苗,留下的苗将其上的培养基清洗干净并消毒后即可种植，基质采用体积比为3-5:0.5-1.5的泥炭土和珍珠岩的混合物，种植后做好遮阴、保湿，控制温度22-30℃，湿度80-95％，种植4-8个月，得到株高45-70mm，具有4片以上黄绿相间的完整植株，达到出货标准；

上述各步骤中的MS改良培养基是将标准MS培养基中KNO₃的用量改为950mg.L^-1，NH₄NO₃的用量改为825mg.L^-1。

2.根据权利要求1所述的富贵榕组培快繁育苗方法，其特征在于：上述步骤二中，对外植体的清洁漂洗采用如下方式：将采集好的外植体让其汁液流干后装于无菌容器中，用医用棉花沾质量百分比为0.01-0.03％的洗洁精轻擦芽上灰尘，再用无菌水冲洗干净。

3.根据权利要求1所述的富贵榕组培快繁育苗方法，其特征在于：上述步骤二中，切去全部叶片或切去枝条末梢的0.5-1.0cm后对外植体的消毒、漂洗采用如下方式：用质量百分比为1-3％的NaHClO溶液消毒3-5分钟后,再用无菌水漂洗3-5次，每次1-3分钟。