CN103858768A - 一种鸡蛋花的组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鸡蛋花的组织培养方法，包括如下步骤：1）将经消毒的鸡蛋花种子培养成带芽小苗；2）从所述带芽小苗上切取带芽茎段作为外植体，将所述外植体诱导培养至长出丛生芽苗；3）切取所述丛生芽苗，将其壮苗生根培养至长成生根苗；4）对所述生根苗进行炼苗和移栽。本发明建立了一种鸡蛋花以芽繁芽的无菌快繁体系，其以鸡蛋花的带芽茎段作为外植体进行快速繁殖，不经过愈伤组织阶段，后代变异小，遗传性状稳定。

Description

一种鸡蛋花的组织培养方法

技术领域

本发明涉及组织培养方法，具体涉及一种鸡蛋花的组织培养方法。

背景技术

鸡蛋花（Plumeria rubra L.cv.Acutifolia），别名缅栀子、蛋黄花等，是夹竹桃科、鸡蛋花属落叶灌木或小乔木，原产自墨西哥、委内瑞拉及西印度群岛等美洲热带地区，现广植于亚洲热带及亚热带地区，在我国西双版纳以及东南亚一些国家，鸡蛋花是佛教寺院文化流行地区的重要风景树种，定为“五树六花”之一而被广泛栽植，故又名“庙树”或“塔树”。目前，常见的鸡蛋花品种包括黄花鸡蛋花、红花鸡蛋花、白花鸡蛋花、粉红鸡蛋花等。

鸡蛋花具有极高的观赏价值，整株树婆娑匀称、苍劲挺拔、自然美观，花期为4～12月，每年4～5月开始开花，经久不衰，优雅别致，花开后香气清香淡雅，香味持久，深受人们喜爱，已成为中国南方绿化中不可或缺的优良树种。在中国华南地区的广东、广西、云南等地被广泛应用于公园、庭院、绿带、草坪等的绿化、美化。而在中国的北方，鸡蛋花大都是用于盆栽观赏。

除了观赏价值外，鸡蛋花还具有极高的经济价值和药用价值。例如，可以从其提取香精供制造高级化妆品、香皂和食品添加剂；因其木材白色、质轻而软，因此可制作乐器、餐具或家具等；其在晒干后可以作为中药材，具有清热解暑、润肺润喉咙等功效，在广东地区常用来制作凉茶饮料等。此外，有研究表明，从鸡蛋花根中可提取到抗菌成分鸡蛋花素（plumericin）、鸡蛋花甙等，具有很强的抗真菌作用，对革兰阳性和阴性细菌以及结核杆菌都有明显抑制效果，还具有明显通便和利尿作用；红花鸡蛋花的茎、皮、叶及带皮茎的水提取液还具有局麻作用和解痉作用等。

鸡蛋花的常规繁殖方法包括扦插繁殖、压条繁殖、种子繁殖、嫁接繁殖等，然而这些常规方法繁殖速度慢、周期长，远远不能满足需求。目前，也有一些采用组织培养快速繁殖鸡蛋花的相关研究，如公开号为CN103444540A的中国发明专利公开了一种组织培养快速繁育红花鸡蛋花的方法，其以红花鸡蛋花叶片为外植体，在诱导形成愈伤组织后，再经愈伤组织分化、芽增殖和生根培养，形成完整植株小苗，最后进行炼苗和移栽。然而，其采用叶片作为外植体，该外植体大多由已分化的细胞组成，其再生成植株通常需要经历从分化状态恢复到分生组织状态的脱分化过程，而经脱分化的细胞在一定条件下经愈伤组织阶段再分化出芽或胚状体而形成植株时，其后代易发生变异。

发明内容

本发明提供一种鸡蛋花的组织培养方法，以带芽茎段作为外植体进行快速繁殖，其不经过愈伤组织阶段，后代变异小，遗传性稳定。

本发明提供的鸡蛋花的组织培养方法，包括如下步骤：

1）将经消毒的鸡蛋花种子培养成带芽小苗；

2）从所述带芽小苗上切取带芽茎段作为外植体，将所述外植体诱导培养至长出丛生芽苗；

3）切取所述丛生芽苗，将其壮苗生根培养至长成生根苗；

4）对所述生根苗进行炼苗和移栽。

本发明所述的组织培养方法建立了一种鸡蛋花以芽繁芽的无菌快繁体系，其以带芽茎段作为外植体，利用该外植体内源激素含量高、细胞活力强、分裂速度快、繁殖率高等特点，不经愈伤阶段即可进行快速繁育，后代变异小，遗传性状稳定。

根据本发明所述的组织培养方法，在所述步骤1）中，所述鸡蛋花种子为新鲜成熟的鸡蛋花种子，其可以从尚未采摘的成熟的鸡蛋花果实中进行采摘。特别是，所述鸡蛋花种子在采摘后应尽快进行后续处理，从而避免种子老化。进一步地，可以采用酒精、双氧水、次氯酸钠、漂白粉、升汞、抗生素等常规消毒剂对所述鸡蛋花种子进行消毒。

进一步地，在所述步骤1）中，可以将经消毒的鸡蛋花种子接种至种子培养基进行所述培养，其中所述种子培养基为在MS培养基中添加30～40g/L糖和8～10g/L卡拉胶，并且调节所述种子培养基的pH为5.8～6.0。

进一步地，所述步骤1）中，所述培养具体包括：首先，在黑暗条件及20～26℃的温度下将所述鸡蛋花种子培养5～7天，然后将所述鸡蛋花种子转到温度为22～27℃，光照强度为1500～2500lx，光照时间为10～14h/d的培养条件下继续培养10～20天。本领域技术人员可以根据所述鸡蛋花种子的生长情况对所述的培养条件进行适当地调节。

本发明所述MS培养基为Murashige和Skoog于1962年所设计的培养基，其配方为公知；本发明所述的糖为常规用于组织培养的糖，例如蔗糖；并且，本发明所述的带芽小苗为带有顶芽和/或侧芽的小苗；本发明对所述带芽小苗所带的芽的个数没有严格限制，1个以上即可，例如1～5个。

本发明所述方法采用新鲜成熟的鸡蛋花种子进行培养，种子活力好，并且所述种子培养基能够使该鸡蛋花种子快速萌发，并长成带芽小苗，种子萌发率高，几乎达到100%，从而有利于保证外植体的取材。

根据本发明所述的组织培养方法，在所述步骤2）中，将所述外植体接种至诱导培养基进行所述诱导培养，其中所述诱导培养基为在1/2MS培养基中添加30～40g/L糖、8～10g/L卡拉胶、0.5～1.5mg/L6-BA和0.05～0.15mg/LIBA，并且调节所述诱导培养基的pH为5.8～6.0。

除了上述诱导培养基外，本发明还可以采用另一诱导培养基进行所述诱导培养，其具体为1/2MS培养基中添加30～40g/L糖、8～10g/L卡拉胶、0.5～2.0mg/L6-BA和0.1～0.5mg/L IAA，并且调节诱导培养基的pH为5.8～6.0。

进一步地，所述步骤2）中，所述诱导培养具体包括：在温度为24～26℃，光照强度为1500～2500lx，光照时间为10～14h/d的培养条件对所述外植体进行诱导培养，并且每隔20～30天继代培养一次，将所述外植体诱导培养至长出3～6株高度为8～10cm的丛生芽苗。

本发明所述的带芽茎段可以是带顶芽的茎段（即茎尖）或带侧芽的茎段，所述带芽茎段的长度可以为0.1～1cm，例如0.5～1cm，过长的外植体容易造成污染，过短则存活率较低；本发明所述的丛生芽苗指的是所述外植体经诱导培养所形成的丛生芽所长成的芽苗。

本发明所述的1/2MS培养基为成分减半的MS培养基，其配方也为公知；本发明所述的6-BA（6-苄基腺嘌呤）主要用于促进芽的形成，IBA（吲哚-3-乙酸）、IAA（吲哚乙酸）为常规的植物生长素。本发明所述的两种诱导培养基均可以较好地诱导所述外植体长出从生芽，并且诱导生成的丛生芽数量多，增殖率（即丛生芽数）高达3～6倍。

根据本发明所述的组织培养方法，在所述步骤3）中，将所述丛生芽苗接种至壮苗生根培养基中进行所述壮苗生根培养，其中所述壮苗生根培养基为在1/2MS培养基中添加30～40g/L糖、8～10g/L卡拉胶、0.1～0.3mg/L NAA和0.1～0.3%活性炭，并且调节所述壮苗生根培养基的pH为5.8～6.0。

进一步地，所述步骤3）中，所述壮苗生根培养具体包括：在温度为24～26℃，光照强度为1500～2500lx，光照时间为10～14h/d的培养条件将所述丛生芽苗壮苗生根培养至大量生根成为生根苗。

本发明所述的NAA（萘乙酸）为广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根。本发明所述的壮苗生根培养基在培养10～20天后即可促进所述丛生芽苗大量生根，生根率高达100%。

根据本发明所述的组织培养方法，所述步骤4）具体包括：将所述生根苗移至室外炼苗7～10天后取出，经清洗、消毒后，移至1：1的甘蔗渣和腐殖土的基质中进行培养。经本发明所述炼苗和移栽的生根苗的移栽成活率高。

根据本发明所述的组织培养方法，所述鸡蛋花的品种为黄花鸡蛋花、红花鸡蛋花、白花鸡蛋花或粉红鸡蛋花。

本发明的实施，至少具有以下优点：

1、本发明所述的鸡蛋花的组织培养方法，采用新鲜成熟的鸡蛋花种子培养的小苗作为外植体的原材料，其种子萌发率高达100%，从而有效保证了外植体的取材。

2、本发明所述的鸡蛋花的组织培养方法，以带芽茎段作为外植体进行快速繁育，生长速度快、繁殖率高，特别是该外植体不经愈伤组织阶段即可进行繁育，后代变异小，遗传性状稳定。

3、本发明所述的鸡蛋花的组织培养方法，通过对各种培养基和培养条件进行优化，从而极大地缩短了培养时间、提高了培养效率，其中种子萌发率达100%，增值率达3～6倍，生根率达100%，移栽成活率达90%以上。

4、本发明所述的鸡蛋花的组织培养方法，操作简单、成本低廉，并且适合大多数鸡蛋花品种的快速繁殖，培养产生的鸡蛋花组培苗能够保持原品种的优良性状，从而为鸡蛋花的繁育和产业化生产奠定了基础。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图和实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所采用的鸡蛋花种子均采自中国热带农业科学院。

实施例1

1、培养基配制

向MS培养基中添加30g/L蔗糖和9g/L卡拉胶，调节其pH为5.8～6.0，制成种子培养基；

向1/2MS培养基中添加30g/L蔗糖、9g/L卡拉胶、0.5mg/L6-BA和0.05mg/L IBA，调节其pH为5.8～6.0，制成诱导培养基；

向1/2MS培养基中添加30g/L糖、9g/L卡拉胶、0.2mg/L NAA和0.2%活性炭，调节其pH为5.8～6.0，制成壮苗生根培养基；

对种子培养基、诱导培养基和壮苗生根培养基进行常规的灭菌处理。

2、种子消毒

从成熟的红花鸡蛋花果实（果实尚未采摘）中采摘新鲜成熟的红花鸡蛋花种子，并在采摘后的六个小时内对种子进行处理，先用自来水将种子冲洗干净，然后用洗衣粉水清洗一遍，再在自来水下冲洗30分钟左右；在无菌操作台中用75%的酒精浸泡清洗后的种子约3分钟，对其表面进行消毒，然后用无菌水清洗一次，再放到体积浓度为5%的次氯酸钠溶液中浸泡20分钟左右，最后用无菌水清洗3～5次。

3、种子培养

将10粒经消毒的红花鸡蛋花种子分别接种于上述灭菌的种子培养基中，首先在黑暗条件及24～26℃的温度下培养5天，然后转至温度为25～27℃，光照强度约为2000lx，光照时间约为12h/d的培养条件下继续培养10～20天，至种子萌发成带有至少1个顶芽的带芽小苗，其中种子萌发率达到100%。

4、诱导培养

从带芽小苗上切取长度约为0.5cm的带有顶芽的茎段（即带芽茎段）作为外植体，将外植体接种至上述灭菌的诱导培养基中，在温度为24～26℃，光照强度约为2000lx，光照时间约为12h/d的培养条件进行诱导培养，并且每隔20～30天继代培养一次，至长出5～6个丛生芽后，继续培养，使丛生芽长成高度为8～10cm的丛生芽苗。

5、壮苗生根培养

切取单株丛生芽苗，将其分别接种至上述灭菌的壮苗生根培养基中，在温度为24～26℃，光照强度约为2000lx，光照时间约为12h/d的培养条件进行壮苗生根培养，培养15～20天后，大量生根，其中生根率达到100%，培养至30天后，成为生根苗。

6、炼苗和移栽

将生根苗移至室外散射光下炼苗7～10天后，取出生根苗，用清水洗净生根苗上的培养基后，放入浓度为0.01%的高锰酸钾溶液中消毒3～5分钟，移至甘蔗渣：腐殖土=1:1的基质中，并按常规方法进行保水、保肥、光照、遮阴等管理，待长出新叶并产生大量须根时，即获得红花鸡蛋花种苗，其中移栽存活率达到95%以上。

实施例2

1、培养基配制

向MS培养基中添加40g/L蔗糖和10g/L卡拉胶，调节其pH为5.8～6.0，制成种子培养基；

向1/2MS培养基中添加30g/L蔗糖、9g/L卡拉胶、1mg/L6-BA和0.5mg/LIAA，调节其pH为5.8～6.0，制成诱导培养基；

向1/2MS培养基中添加35g/L糖、10g/L卡拉胶、0.3mg/L NAA和0.2%活性炭，调节其pH为5.8～6.0，制成壮苗生根培养基；

对种子培养基、诱导培养基和壮苗生根培养基进行常规的灭菌处理。

2、种子培养

从成熟的黄花鸡蛋花果实（果实尚未采摘）中采摘新鲜成熟的黄花鸡蛋花种子后进行常规清洗和消毒，选取10粒种子分别接种于上述灭菌的种子培养基中，首先在黑暗条件及20～22℃的温度下培养5～7天，然后转至温度为22～24℃，光照强度为1800～2200lx，光照时间为10～12h/d的培养条件下继续培养10～20天，至种子萌发成带有顶芽和侧芽的带芽小苗，其中种子萌发率达到100%。

3、诱导培养

从带芽小苗上切取0.9～1cm带有侧芽的茎段（即带芽茎段）作为外植体，将外植体接种至上述灭菌的诱导培养基中，在温度为24～26℃，光照强度为1800～2200lx，光照时间为10～12h/d的培养条件进行诱导培养，并且每隔20～30天继代培养一次，至长出5～6个丛生芽后，继续培养，使丛生芽长成高度为8～10cm的丛生芽苗。

4、壮苗生根培养

切取单株丛生芽苗，将其分别接种至上述灭菌的壮苗生根培养基中，在温度为24～26℃，光照强度为1800～2200lx，光照时间为10～12h/d的培养条件进行壮苗生根培养，培养15～20天后，大量生根，其中生根率达到100%，培养至30天后，成为生根苗。

5、炼苗和移栽

将生根苗移至室外散射光下炼苗7～10天后，取出生根苗，用清水洗净苗上的培养基后，经常规消毒处理，移至装有甘蔗渣：腐殖土=1:1的基质的育苗杯中，并按常规方法进行保水、保肥、光照、遮阴等管理，待长出新叶并产生大量须根时，即获得黄花鸡蛋花种苗，其中移栽存活率达到95%以上。

实施例3

1、培养基配制

向MS培养基中添加35g/L蔗糖和8g/L卡拉胶，调节其pH为5.8～6.0，制成种子培养基；

向1/2MS培养基中添加40g/L蔗糖、10g/L卡拉胶、1mg/L6-BA和0.1mg/LIBA，调节其pH为5.8～6.0，制成诱导培养基；

向1/2MS培养基中添加40g/L糖、8g/L卡拉胶、0.3mg/L NAA和0.1%活性炭，调节其pH为5.8～6.0，制成壮苗生根培养基；

对种子培养基、诱导培养基和壮苗生根培养基进行常规的灭菌处理。

2、种子培养

从成熟的粉红鸡蛋花果实（果实尚未采摘）中采摘新鲜成熟的粉红鸡蛋花种子后进行常规清洗和消毒，选取10粒种子分别接种于上述灭菌的种子培养基中，首先在黑暗条件及24～26℃的温度下培养5～7天，然后转至温度为24～26℃，光照强度为2500lx，光照时间为10h/d的培养条件下继续培养10～20天，至种子萌发成带有顶芽的带芽小苗，其中种子萌发率达到100%。

3、诱导培养

从带芽小苗上切取约0.5cm带顶芽的茎段（即带芽茎段）作为外植体，将外植体接种至上述灭菌的诱导培养基中，在温度为24～26℃，光照强度为2500lx，光照时间为10h/d的培养条件进行诱导培养，并且每隔20～30天继代培养一次，至长出3～4个丛生芽后，继续培养，使丛生芽长成8～10cm的丛生芽苗。

4、壮苗生根培养

切取单株丛生芽苗，将其分别接种至上述灭菌的壮苗生根培养基中，在温度为24～26℃，光照强度为2500lx，光照时间为10h/d的培养条件进行壮苗生根培养，培养15～20天后，大量生根，其中生根率达到100%，培养至30天后，成为生根苗。

5、炼苗和移栽

将生根苗移至室外散射光下炼苗7～10天后，取出生根苗，用清水洗净苗上的培养基后，常规消毒，移至甘蔗渣：腐殖土=1:1的基质中，并按常规方法进行保水、保肥、光照、遮阴等管理，待长出新叶并产生大量须根时，即获得粉红鸡蛋花种苗，其中移栽存活率达到92%以上。

实施例4

1、培养基配制

向MS培养基中添加30g/L蔗糖和9g/L卡拉胶，调节其pH为5.8～6.0，制成种子培养基；

向1/2MS培养基中添加40g/L蔗糖、10g/L卡拉胶、2mg/L6-BA和0.1mg/LIAA，调节其pH为5.8～6.0，制成诱导培养基；

向1/2MS培养基中添加30g/L糖、9g/L卡拉胶、0.1mg/L NAA和0.3%活性炭，调节其pH为5.8～6.0，制成壮苗生根培养基；

对种子培养基、诱导培养基和壮苗生根培养基进行常规的灭菌处理。

2、种子培养

从成熟的白花鸡蛋花果实（果实尚未采摘）中采摘新鲜成熟的白花鸡蛋花种子后进行常规清洗和消毒，选取10粒种子分别接种于上述灭菌的种子培养基中，首先在黑暗条件及20～26℃的温度下培养5～7天，然后转至温度为22～27℃，光照强度为1500～2500lx，光照时间为10～14h/d的培养条件下继续培养10～20天，至种子萌发成带有1～3个芽的带芽小苗，其中种子萌发率达到100%。

3、诱导培养

从带芽小苗上切取0.5～0.6cm带顶芽的茎段（即带芽茎段）作为外植体，将外植体接种至上述灭菌的诱导培养基中，在温度为24～26℃，光照强度为1500～2500lx，光照时间为10～14h/d的培养条件进行诱导培养，并且每隔20～30天继代培养一次，至长出4～5个丛生芽后，继续培养，使丛生芽长成8～10cm的丛生芽苗。

4、壮苗生根培养

切取单株丛生芽苗，将其分别接种至上述灭菌的壮苗生根培养基中，在温度为24～26℃，光照强度为1500～2500lx，光照时间为10～14h/d的培养条件进行壮苗生根培养，培养15～20天后，大量生根，其中生根率达到100%，培养至30天后，成为生根苗。

5、炼苗和移栽

将生根苗移至室外散射光下炼苗7～10天后，取出生根苗，用清水洗净苗上的培养基后，放入浓度为0.01%的高锰酸钾溶液中消毒3～5分钟，移至甘蔗渣：腐殖土=1:1的基质中，并按常规方法进行保水、保肥、光照、遮阴等管理，待苗叶长出新叶并产生大量须根时，即获得白花鸡蛋花种苗，其中移栽存活率达到95%以上。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种鸡蛋花的组织培养方法，包括如下步骤：

1）将经消毒的鸡蛋花种子培养成带芽小苗；

2）从所述带芽小苗上切取带芽茎段作为外植体，将所述外植体诱导培养至长出丛生芽苗；

3）切取所述丛生芽苗，将其壮苗生根培养至长成生根苗；

4）对所述生根苗进行炼苗和移栽。

2.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述步骤1）中，将经消毒的鸡蛋花种子接种至种子培养基进行所述培养，其中所述种子培养基为在MS培养基中添加30～40g/L糖和8～10g/L卡拉胶，并且调节所述种子培养基的pH为5.8～6.0。

3.根据权利要求2所述的组织培养方法，其特征在于，所述步骤1）中，所述培养具体包括：首先，在黑暗条件及20～26℃的温度下将所述鸡蛋花种子培养5～7天，然后将所述鸡蛋花种子转到温度为22～27℃，光照强度为1500～2500lx，光照时间为10～14h/d的培养条件下继续培养10～20天。

4.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述步骤2）中，将所述外植体接种至诱导培养基进行所述诱导培养，其中所述诱导培养基为在1/2MS培养基中添加30～40g/L糖、8～10g/L卡拉胶、0.5～1.5mg/L6-BA和0.05～0.15mg/L IBA，并且调节所述诱导培养基的pH为5.8～6.0。

5.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述步骤2）中，将所述外植体接种至诱导培养基进行所述诱导培养，其中所述诱导培养基为在1/2MS培养基中添加30～40g/L糖、8～10g/L卡拉胶、0.5～2.0mg/L6-BA和0.1～0.5mg/L IAA，并且调节所述诱导培养基的pH为5.8～6.0。

6.根据权利要求4或5所述的组织培养方法，其特征在于，所述步骤2）中，所述诱导培养具体包括：在温度为24～26℃，光照强度为1500～2500lx，光照时间为10～14h/d的培养条件对所述外植体进行诱导培养，并且每隔20～30天继代培养一次，将所述外植体诱导培养至长出3～6株高度为8～10cm的丛生芽苗。

7.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述步骤3）中，将所述丛生芽苗接种至壮苗生根培养基中进行所述壮苗生根培养，其中所述壮苗生根培养基为在1/2MS培养基中添加30～40g/L糖、8～10g/L卡拉胶、0.1～0.3mg/L NAA和0.1～0.3%活性炭，并且调节所述壮苗生根培养基的pH为5.8～6.0。

8.根据权利要求7所述的组织培养方法，其特征在于，所述步骤3）中，所述壮苗生根培养具体包括：在温度为24～26℃，光照强度为1500～2500lx，光照时间为10～14h/d的培养条件将所述丛生芽苗壮苗生根培养至大量生根成为生根苗。

9.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述步骤4）具体包括：将所述生根苗移至室外炼苗7～10天后取出，经清洗、消毒后，移至1：1的甘蔗渣和腐殖土的基质中进行培养。

10.根据权利要求1至9任一所述的组织培养方法，其特征在于，所述鸡蛋花的品种为黄花鸡蛋花、红花鸡蛋花、白花鸡蛋花或粉红鸡蛋花。