CN105557515A - 一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法 - Google Patents

一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法，包括以下步骤：愈伤组织诱导：将外植体材料清洗后，在氯化汞溶液中表面灭菌7-10min，用水冲洗，切成块状接种于诱导培养基，45天后诱导产生愈伤组织；增殖培养：将愈伤组织接种于增殖培养基进行增殖；孢子体诱导：将增殖培养后的愈伤组织接种于分化培养基，处理30天后获得发芽的孢子体；生根培养：待孢子体的叶片长到2-3cm后，接种于生根培养基培养成苗，30d后苗的基部长出棕色的根；炼苗移栽：待苗长有2～3条根，高度在4cm以上时，进行炼苗移栽。通过培养基配方改进，愈伤组织诱导率为65.29％，增殖率为8.71％，分化率为达到88.35％，生根率达到91.21％，成活率达95.3％以上。

Description

一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法。
背景技术
圆叶鸟巢蕨是一种拉丁名为Neottopterisniduscv."Avis"的中型附生蕨，是南洋巢蕨(Aspleniumaustralasicum)驯化出的一个圆叶盆栽品种，株形呈漏斗状或鸟巢状。根状茎短而直立，柄粗壮而密生大团海绵状须根，能吸收大量水分。叶簇生，辐射状排列于根状茎顶部，中空如巢形结构，能收集落叶及鸟粪；革质叶阔披针形，两面滑润，叶脉两面稍隆起，孢子囊群长条形。
圆叶鸟巢蕨具有四季常青、株形丰满、淡雅秀丽、叶色葱绿等特点，主要用作室内布景盆栽，其叶片是优良的花材；卷曲的嫩叶可以煮食、也可做泡菜；鸟巢蕨的性味微苦，清热解毒，可用于药材。
鸟巢蕨类植物传统的繁殖方法为营养繁殖、孢子繁殖和组织培养，营养繁殖通常需要切割母株，繁殖率低且易伤害母株，不适用于批量植苗。孢子繁殖对培育环境要求条件高且培育周期长，不适用商业化植苗。相对来说，组织培养生产成本低，条件可控，周期短，因此可大规模植苗。
目前，还未有一种适用圆叶鸟巢蕨组织培养并快速繁殖的方法，直接从叶子组织培养。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法，包括以下步骤：
(1)愈伤组织诱导：将外植体材料清洗后，在氯化汞溶液中表面灭菌7-10min，用水冲洗，切成块状接种于诱导培养基，45天后诱导产生愈伤组织；外植体材料为未展开的圆叶鸟巢蕨嫩叶，诱导培养基成分为MS改良培养基、1、0-2.0mg/L6-BA和0.5-1.0mg/LNAA；
(2)增殖培养：将愈伤组织接种于增殖培养基进行增殖，增殖培养基成分为MS基本培养基、0.5-1.0mg/L6-BA和0.1-0.5mg/LNAA。
(3)孢子体诱导：将增殖培养后的愈伤组织接种于分化培养基，处理30天后获得发芽的孢子体，分化培养基成分为MS基本培养基，0.4-0.5mg/L6-BA和0.1-0.2mg/LNAA；
(4)生根培养：待孢子体的叶片长到2-3cm后，接种于生根培养基培养成苗，30d后苗的基部长出棕色的根，生根培养基成分为MS改良培养基、0.1-0.2mg/LNAA、10-20g/L蔗糖和0.5-0.8g/L活性炭；
(5)炼苗移栽：待苗长有2～3条根，高度在4cm以上时，进行炼苗移栽，置于太阳光下炼苗5-7d后，取出瓶苗，洗净根部附着的生根培养基，晾干并种植于灭菌后的培养基质中，培养基质为椰糠、泥炭土和火山岩的混合物。
本发明的一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法，通过培养基的改进，通过培养基配方改进，愈伤组织诱导率为65.29％，增殖率为8.71％，分化率为达到88.35％，生根率达到91.21％，成活率达到95.3％。
本发明工艺流程简单，以原叶体形式进行增殖，可获得大量的原叶体，通过增殖、孢子体诱导、生根、移栽等过程，获得大量可用于生产栽培的种苗，且获得的种苗生理年龄一致，生长整齐，适合工厂化育苗和规模化栽培。
附图说明
图1为一种圆叶鸟巢蕨增殖培养效果图；
图2为一种圆叶鸟巢蕨孢子体诱导培养效果图；
图3为一种圆叶鸟巢蕨生根培养效果图；
图4为一种圆叶鸟巢蕨炼苗移栽效果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
本发明的MS基本培养基是实验室常用的培养基，MS改良培养基在基本培养基的基础上改良，MS基本培养基包含1650mg/LNH4N03和1900mg/LKNO3，1/2MS改良培养基包含825mg/LNH4N03和950mg/LKNO3，2/3MS改良培养基包含1100mg/LNH4N03和1266mg/LKNO3，1/3MS改良培养基包含550mg/LNH4N03和633mg/LKNO3，6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，NAA为a-萘乙酸。
实施例一：
1、愈伤组织诱导培养：以未展开的圆叶鸟巢蕨嫩叶为外植体材料，用适量的洗洁精清洗后，在流水中冲洗0.5h，在0.1％氯化汞溶液中表面灭菌7min，在无菌水中冲洗3次，切成1×1cm大小接种于初始诱导培养基上，诱导培养基成分为：1/2MS改良培养基+2.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA，处理接种30个外植体，并重复3次。45d诱导产生愈伤组织，统计愈伤组织诱导率。
愈伤组织诱导率＝诱导出愈伤组织的外植体数/未污染外植体数×100％。
2、增殖培养：愈伤组织接种于增殖培养基上，成分为：MS基本培养基+1.0mg/L6-BA+0.10mg/LNAA。处理接种50个外植体，并重复3次，30d后观察，统计其增殖率。
增殖率＝愈伤组织鲜重/接种鲜重。
3、孢子体诱导培养：愈伤组织接种于分化培养基中，分化培养基成分为：MS基本培养基+0.50mg/L6-BA+0.20mg/LNAA。处理接种50个外植体，并重复3次，30d后观察，愈伤组织分化出叶片，形成丛生芽。统计分化率，分化率＝已分化植株总数/外植体总数×100％。
4、生根培养：待孢子体的叶片长到2-3cm后接种于生根培养基上培养，生根培养基成分为：1/2MS改良培养基+0.2mg/LNAA+蔗糖20g/L+活性炭0.5g/L，处理接种30个外植体，并重复3次。30d后在苗的基部形成棕色的根，根上有根毛和叉根，统计其生根率，平均根数为3.74±0.03。
生根率＝生根苗数/接种数×100％；
平均根数＝生根条数/生根苗数。
5、炼苗移栽：待无菌苗长有2～3条根，高度在4cm以上时，进行炼苗移栽，揭开培养瓶的瓶盖，于室内自然光下炼苗5d后，小心取出瓶苗，洗净根部附着的培养基，稍晾干，种植于灭好菌的1:1:1的椰糠，泥炭土，火山岩的基质中。温度控制在24-26℃，湿度保持在90％左右，统计其成活率。施肥：15～20d后幼苗生新根，晴天上午采用0.2％～0.3％尿素溶液喷雾后，并用清水淋洗，每7d施肥1次。病虫害防治：利用500倍多菌灵(50％)、600倍甲霜灵复合防病，利用菊酯类杀虫剂除虫。
实施例二：
1、愈伤组织诱导培养：以未展开的圆叶鸟巢蕨嫩叶为外植体材料，用适量的洗洁精清洗后，在流水中冲洗0.5h，在0.1％氯化汞溶液中表面灭菌10min，在无菌水中冲洗3-5次，切成1×1cm大小接种于初始诱导培养基上，诱导培养基成分为：1/2MS改良培养基+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA，处理接种50个外植体，并重复3次。45d诱导产生愈伤组织，统计愈伤组织诱导率。愈伤组织诱导率＝诱导出愈伤组织的外植体数/未污染外植体数×100％。
2、增殖培养：愈伤组织接种于增殖培养基上，成分为：MS基本培养基+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA。处理接种50个外植体，并重复3次，30d后观察，统计其增殖率。圆叶鸟巢蕨增殖培养的效果如图1所示。
增殖率＝愈伤组织鲜重/接种鲜重。
3、孢子体诱导培养：愈伤组织接种于分化培养基中，分化培养基成分为：MS基本培养基+0.40mg/L6-BA+0.1mg/LNAA。处理接种50个外植体，并重复3次，30d后观察，愈伤组织分化出叶片，形成丛生芽。统计其分化率，分化率＝已分化植株总数/外植体总数×100％。圆叶鸟巢蕨孢子体诱导培养效果如图2所示。
4、生根培养：待孢子体的叶片长到2-3cm后接种于生根培养基上培养，生根培养基成分为：1/2MS改良培养基+0.1mg/LNAA+蔗糖10g/L+活性炭0.8g/L，处理接种30个外植体，并重复3次。30d后在苗的基部形成棕色的根，根上有根毛和叉根，统计其生根率，平均根数为3.74±0.03。圆叶鸟巢蕨生根培养效果如图3所示。
生根率＝生根苗数/接种数×100％；
平均根数＝生根条数/生根苗数。
5、炼苗移栽：待无菌苗长有2～3条根，高度在4cm以上时，进行炼苗移栽，揭开培养瓶的瓶盖，于室内自然光下炼苗5-7d后，小心取出瓶苗，洗净根部附着的培养基，稍晾干，种植于灭好菌的1:1:1的椰糠，泥炭土，火山岩的基质中。温度控制在24-26℃，湿度保持在90％左右，统计其成活率。施肥：15～20d后幼苗生新根，晴天上午采用0.2％～0.3％尿素溶液喷雾后，并用清水淋洗，每7d施肥1次。病虫害防治：利用500倍多菌灵(50％)、600倍甲霜灵复合防病，利用菊酯类杀虫剂除虫。圆叶鸟巢蕨炼苗移栽效果如图4所示。
实施例三：
实施例三和实施例一的区别在于：愈伤组织诱导培养步骤的诱导培养基选用1/3MS改良培养基；生根培养步骤的生根培养基也选用1/3改良培养基。
实施例四：
实施例四和实施例一的区别在于：愈伤组织诱导培养步骤的诱导培养基选用2/3MS改良培养基；生根培养步骤的生根培养基也选用2/3改良培养基。
对比例1：
对比例1与实施例1的区别在于：愈伤组织诱导培养步骤的诱导培养基选用MS基本培养基；生根培养步骤的生根培养基也选用MS基本培养基。
对比例2:
对比例2与实施例1的区别在于：愈伤组织诱导培养步骤的诱导培养基选用MS基本培养基，增殖培养步骤选用MS基本培养基+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L。
将实施例1-4、对比例1-2的生长情况记录，结果汇总成表1.
表1
本发明的一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法，通过培养基配方改进和培养条件的改变，愈伤组织诱导率为65.29％，增殖率为8.71％，分化率为达到88.35％，生根率达到91.21％，成活率达到95.3％。
本发明工艺流程简单，以原叶体形式进行增殖，可获得大量的原叶体，通过增殖、孢子体诱导、生根、移栽等过程，获得大量可用于生产栽培的种苗，且获得的种苗生理年龄一致，生长整齐，适合工厂化育苗和规模化栽培。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (3)

1.一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)愈伤组织诱导：将外植体材料清洗后，在氯化汞溶液中表面灭菌7-10min，用水冲洗，切成块状接种于诱导培养基，45天后诱导产生愈伤组织；所述外植体材料为未展开的圆叶鸟巢蕨嫩叶，所述诱导培养基成分为1/2MS改良培养基、1.0-2.0mg/L6-BA和0.5-1.0mg/LNAA；
(2)增殖培养：将愈伤组织接种于增殖培养基进行增殖，增殖培养基成分为MS基本培养基、0.5-1.0mg/L6-BA和0.1-0.5mg/LNAA；
孢子体诱导：将增殖培养后的愈伤组织接种于分化培养基，处理30d天后获得发芽的孢子体，分化培养基成分为MS基本培养基，0.4-0.5mg/L6-BA和0.1-0.2mg/LNAA；
(3)生根培养：待孢子体的叶片长到2-3cm后，接种于生根培养基培养成苗，30d后苗的基部长出棕色的根，生根培养基成分为1/2MS改良培养基、0.1-0.2mg/LNAA、10-20g/L蔗糖和0.5-0.8g/L活性炭；
(4)炼苗移栽：待苗长有2～3条根，高度在4cm以上时，进行炼苗移栽，置于太阳光下炼苗5-7d后，取出瓶苗，洗净根部附着的生根培养基，晾干并种植于灭菌后的培养基质中，培养基质为椰糠、泥炭土和火山岩的混合物；
其中，所述1/2MS改良培养基包含825mg/LNH4N03和950mg/LKNO3。
2.根据权利要求1所述的一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法，其特征在于，所述氯化汞溶液浓度为0.1％。
3.根据权利要求1所述的一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法，其特征在于，所述椰糠、泥炭土和火山岩的体积比为1:1:1。
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