CN106942059A - 一种香樟的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种香樟的组织培养方法,涉及植物培育繁殖技术领域,本发明的香樟的组织培养方法包括如下步骤:(一)外植体的准备、(二)外植体的预处理、(三)培养基的培养、(四)大棚炼苗;其中,步骤(三)还包括(1)诱导培养、(2)增殖培养和(3)生根培养的步骤;本发明的香樟的组织培养方法在含有不同激素配比的WPM培养基上诱导香樟的愈伤组织,通过诱导培养基、增殖培养基以及生根培养基的培养,获得香樟的再生苗,其培养方法取材方便,材料来源、数量充足,容易获得无菌材料,能够用较少的优良母本,繁殖出大批量的种苗,适用于规模化生产。
Description
【技术领域】
本发明涉及植物培育繁殖技术领域,具体涉及一种香樟的组织培养方法。
【背景技术】
香樟树是一种重要的多种用途生态和经济树种,其木材致密美观,具有芳香味,防虫击蚊之用;香樟树树姿秀丽,四季常青且枝叶茂密,具有很强吸尘能力和抗雾霾能力;香樟树的木材、根、叶及果实皆含精油,是天然樟脑,芳香油和芳香醇的重要来源,其精油和芳香醇价格每吨18-32万之间,其精加工产品涉及众多领域和行业。
在培育过程中,香樟树通常以种子进行繁殖,后代变异极大,扦插繁殖和分蘖繁殖等能最大限度保持母本优良特性,生产成本相对较低,而随着香樟树特色资源利用水平的不断提高,特别是产业脱贫项目上,扦插繁殖难于在短时间内满足规模化生产的需求,还具有根系不发达,浪费枝条等缺点,因此,研究出一种缩短其育苗时间、提高出芽存活率,满足规模化生产的香樟组培技术有着十分重要的意义。
【发明内容】
有鉴于此,本发明的目的在于,提供一种香樟的组织培养方法,本发明的香樟的组织培养方法在含有不同激素配比的WPM培养基上诱导香樟的愈伤组织,通过诱导培养基、增殖培养基以及生根培养基的培养,获得香樟的再生苗,其培养方法取材方便,材料来源、数量充足,容易获得无菌材料,能够用较少的优良母本,繁殖出大批量的种苗,适用于规模化生产。
为了解决上述技术问题,本发明采用了如下的技术方案:
一种香樟的组织培养方法,具体包括如下步骤:
(一)外植体的预处理:剪取经过挖根处理后长出的嫩芽作为外植体,将外植体剪成4-6cm的条状物,然后用大蒜汁将外植体浸泡15-30min(浸泡时间长短视材料木质化程度而定),浸泡过程不断进行振荡,浸泡完成后用无菌水将外植体冲洗4-6次,然后放置于无菌接种盘吹干其表面水分,切去叶片以及旧的切口,切成2-2.5cm带3个芽的茎段,将带芽茎段置于自来水下冲洗30min,用滤纸吸干带芽茎段备用;
(二)培养基的培养:
(1)诱导培养:将上述步骤获得的带芽茎段先接种到诱导培养基上,黑暗条件下培养5-10天,然后按光照和黑暗时间比为2:1交替进行诱导培养,诱导新芽长高至4-5cm后,将新芽的叶片切去,切成2-3cm的茎段;
所述诱导培养基含有WPM培养基+2.5mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA+4.5g/L琼脂+30g/L蔗糖;
(2)增殖培养:将步骤(1)培养后处理得到的茎段接种到增殖培养基上培养35-40天后,将新芽转到新的增殖培养基培养,增殖倍数达到3-4倍;
所述增殖培养基的成分为:WPM+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+3.5g/L琼脂+25g/L蔗糖;
(3)生根培养:将经步骤(2)增殖培养得到的丛芽切除其多余的侧面芽或不定芽,按照高度为1.5-3cm将具有单芽的小枝剪切下来,然后将剪切后的小枝放到生根培养基进行生根培养,培养24-26天后即可出瓶炼苗;
所述生根培养基的成分为:WPM+2.0mg/L生根粉+4.5g/L琼脂+30g/L蔗糖;
上述三种培养基的制备方法是将组成培养基的原料混合搅拌均匀后,将其煮沸至PH值调节至5.6-6.0,然后装入培养器皿中,在120-123℃高温下蒸汽灭菌15-20min后进行冷却,得到培养基备用;
(三)大棚炼苗:用镊子将小苗从培养器皿中取出,用自来水将小苗根部的培养基洗净,然后种植到培养土苗盘里并喷淋定根水,待叶面干后,喷施800-1000倍液的农用链霉毒,7-15天后喷施20-30倍的沼气液,在大棚内培育3-5个月后进行移栽。
优选地,所述组织培养方法还包括外植体准备的步骤,具体为:通过检测取含精油量和芳香醇高的香樟树作为母体,将母体进行挖根处理,经过挖根处理待断根处长出嫩芽后,取断根位置新长出的嫩芽作为外植体。
优选地,步骤(1)所述诱导培养是在温度为26-28℃,湿度为65-80%,PH值为5.6-6.0的条件下进行的,诱导培养中的光照为自然光照2000-2500Lux。
优选地,步骤(2)所述增殖培养是在温度为26-28℃,湿度为50-75%,PH值为5.6-6.0的条件下进行的,所述增殖培养光照强度为2000-3000Lux,光照时度为12-14h/天。
优选地,步骤(3)所述生根培养是在温度为24-27℃,湿度为40-60%,PH值为5.6-6.0,光照强度为2000-3000Lux,光照时度为12-14h/天的条件下进行的。
优选地,步骤(3)所述生根粉为ABT1号生根粉。
优选地,所述作为外植体的嫩芽为4-6月份非下雨天期间长出的嫩芽。
本发明经大棚炼苗得到的香樟苗从大棚内取出,放入清水盆中,洗去根部琼脂,然后捞出,用多菌灵处理后移栽至营养土中,营养土上层为2cm河沙,下层为4cm珍珠岩、蛭石及腐殖质混合物,待有新叶长出后按常规苗圃育苗措施管理。
综上所述,由于采用了上述技术方案,本发明的有益效果是:
1、本发明的一种香樟的组织培养方法在选择外植体时,选择通过检测取含精油量和芳香醇高的香樟树作为母体,将母体进行挖根处理,经过挖根处理待断根处长出嫩芽后,取断根位置新长出的嫩芽作为外植体,用上述方法得到的外植体可以有效的保持了优良母本的稳定性状,通过组织培养对外植体进行处理,与常规的扦插和压条繁殖相比,组织培养能够用较少的优良母本,繁殖出大批量的种苗,适用于规模化生产。
2、本发明的香樟的组织培养方法在含有不同激素配比的WPM培养基上诱导愈伤组织,通过诱导培养基、增殖培养基以及生根培养基的培养,获得香樟的再生苗,其培养方法取材方便,材料来源、数量充足,容易获得无菌材料;筛选获得植株再生的香樟无性系,可大大提高农杆菌介导遗传转化的转基因获得率,有效缩短香樟的遗传转化周期,是一套易于掌握、简便节约、快速高效的再生体系。
【具体实施方式】
下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明,但不可以以任何方式限制本发明。
实施例1
本实施例提供一种香樟的组织培养方法,具体包括如下步骤:
(一)外植体的准备:通过检测取含精油量和芳香醇高的香樟树作为母体,将母体进行挖根处理,经过挖根处理待断根处长出嫩芽后,取断根位置新长出的嫩芽作为外植体,其中,嫩芽为4-6月份非下雨天期间长出的嫩芽;
(二)外植体的预处理:剪取经过挖根处理后长出的嫩芽作为外植体,将外植体剪成4cm的条状物,然后用大蒜汁将外植体浸泡15min,浸泡过程不断进行振荡,浸泡完成后用无菌水将外植体冲洗4次,然后放置于无菌接种盘吹干其表面水分,切去叶片以及旧的切口,切成2cm带3个芽的茎段,将带芽茎段置于自来水下冲洗30min,用滤纸吸干带芽茎段备用;
(三)培养基的培养:
(1)诱导培养:将上述步骤获得的带芽茎段先接种到诱导培养基上,黑暗条件下培养5天,然后按光照和黑暗时间比为2:1交替进行诱导培养,诱导新芽长高至4cm后,将新芽的叶片切去,切成2cm的茎段;诱导培养是在温度为26℃,湿度为65%,PH值为5.6的条件下进行的,诱导培养中的光照为自然光照2000Lux;其中,诱导培养基含有WPM培养基+2.5mg/L6-BA+0.25mg/L NAA+4.5g/L琼脂+30g/L蔗糖;
(2)增殖培养:将步骤(1)培养后处理得到的茎段接种到增殖培养基上培养35天后,将新芽转到新的增殖培养基培养,增殖倍数达到3倍;增殖培养是在温度为26℃,湿度为50%,PH值为5.6的条件下进行的,所述增殖培养光照强度为2000Lux,光照时度为12h/天;其中,增殖培养基的成分为:WPM+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+3.5g/L琼脂+25g/L蔗糖;
(3)生根培养:将经步骤(2)增殖培养得到的丛芽切除其多余的侧面芽或不定芽,按照高度为1.5cm将具有单芽的小枝剪切下来,然后将剪切后的小枝放到生根培养基进行生根培养,培养24天后即可出瓶炼苗;生根培养是在温度为24℃,湿度为40%,PH值为5.6,光照强度为2000Lux,光照时度为12h/天的条件下进行的;其中,生根培养基的成分为:WPM+2.0mg/L ABT1号生根粉+4.5g/L琼脂+30g/L蔗糖;
上述三种培养基的制备方法是将组成培养基的原料混合搅拌均匀后,将其煮沸至PH值调节至5.6,然后装入培养器皿中,在120℃高温下蒸汽灭菌15min后进行冷却,得到培养基备用;
(四)大棚炼苗:用镊子将小苗从培养器皿中取出,用自来水将小苗根部的培养基洗净,然后种植到培养土苗盘里并喷淋定根水,待叶面干后,喷施800倍液的农用链霉毒,7天后喷施20倍的沼气液,在大棚内培育3个月后进行移栽。
实施例2
本实施例提供一种香樟的组织培养方法,具体包括如下步骤:
(一)外植体的准备:通过检测取含精油量和芳香醇高的香樟树作为母体,将母体进行挖根处理,经过挖根处理待断根处长出嫩芽后,取断根位置新长出的嫩芽作为外植体,其中,嫩芽为4-6月份非下雨天期间长出的嫩芽;
(二)外植体的预处理:剪取经过挖根处理后长出的嫩芽作为外植体,将外植体剪成5cm的条状物,然后用大蒜汁将外植体浸泡22min,浸泡过程不断进行振荡,浸泡完成后用无菌水将外植体冲洗5次,然后放置于无菌接种盘吹干其表面水分,切去叶片以及旧的切口,切成2.2cm带3个芽的茎段,将带芽茎段置于自来水下冲洗30min,用滤纸吸干带芽茎段备用;
(三)培养基的培养:
(1)诱导培养:将上述步骤获得的带芽茎段先接种到诱导培养基上,黑暗条件下培养7天,然后按光照和黑暗时间比为2:1交替进行诱导培养,诱导新芽长高至4cm后,将新芽的叶片切去,切成2cm的茎段;诱导培养是在温度为27℃,湿度为75%,PH值为5.8的条件下进行的,诱导培养中的光照为自然光照2250Lux;其中,诱导培养基含有WPM培养基+2.5mg/L6-BA+0.25mg/L NAA+4.5g/L琼脂+30g/L蔗糖;
(2)增殖培养:将步骤(1)培养后处理得到的茎段接种到增殖培养基上培养38天后,将新芽转到新的增殖培养基培养,增殖倍数达到3倍;增殖培养是在温度为27℃,湿度为65%,PH值为5.8的条件下进行的,所述增殖培养光照强度为2500Lux,光照时度为13h/天;其中,增殖培养基的成分为:WPM+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+3.5g/L琼脂+25g/L蔗糖;
(3)生根培养:将经步骤(2)增殖培养得到的丛芽切除其多余的侧面芽或不定芽,按照高度为1.9cm将具有单芽的小枝剪切下来,然后将剪切后的小枝放到生根培养基进行生根培养,培养25天后即可出瓶炼苗;生根培养是在温度为25℃,湿度为50%,PH值为5.8,光照强度为2500Lux,光照时度为13h/天的条件下进行的;其中,生根培养基的成分为:WPM+2.0mg/L ABT1号生根粉+4.5g/L琼脂+30g/L蔗糖;
上述三种培养基的制备方法是将组成培养基的原料混合搅拌均匀后,将其煮沸至PH值调节至5.8,然后装入培养器皿中,在122℃高温下蒸汽灭菌17min后进行冷却,得到培养基备用;
(四)大棚炼苗:用镊子将小苗从培养器皿中取出,用自来水将小苗根部的培养基洗净,然后种植到培养土苗盘里并喷淋定根水,待叶面干后,喷施900倍液的农用链霉毒,12天后喷施25倍的沼气液,在大棚内培育4个月后进行移栽。
实施例3
本实施例提供一种香樟的组织培养方法,具体包括如下步骤:
(一)外植体的准备:通过检测取含精油量和芳香醇高的香樟树作为母体,将母体进行挖根处理,经过挖根处理待断根处长出嫩芽后,取断根位置新长出的嫩芽作为外植体,其中,嫩芽为4-6月份非下雨天期间长出的嫩芽;
(二)外植体的预处理:剪取经过挖根处理后长出的嫩芽作为外植体,将外植体剪成6cm的条状物,然后用大蒜汁将外植体浸泡30min,浸泡过程不断进行振荡,浸泡完成后用无菌水将外植体冲洗6次,然后放置于无菌接种盘吹干其表面水分,切去叶片以及旧的切口,切成2.5cm带3个芽的茎段,将带芽茎段置于自来水下冲洗30min,用滤纸吸干带芽茎段备用;
(三)培养基的培养:
(1)诱导培养:将上述步骤获得的带芽茎段先接种到诱导培养基上,黑暗条件下培养10天,然后按光照和黑暗时间比为2:1交替进行诱导培养,诱导新芽长高至5cm后,将新芽的叶片切去,切成3cm的茎段;诱导培养是在温度为28℃,湿度为80%,PH值为6.0的条件下进行的,诱导培养中的光照为自然光照2500Lux;其中,诱导培养基含有WPM培养基+2.5mg/L6-BA+0.25mg/L NAA+4.5g/L琼脂+30g/L蔗糖;
(2)增殖培养:将步骤(1)培养后处理得到的茎段接种到增殖培养基上培养40天后,将新芽转到新的增殖培养基培养,增殖倍数达到4倍;增殖培养是在温度为28℃,湿度为75%,PH值为6.0的条件下进行的,所述增殖培养光照强度为3000Lux,光照时度为12-14h/天;其中,增殖培养基的成分为:WPM+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+3.5g/L琼脂+25g/L蔗糖;
(3)生根培养:将经步骤(2)增殖培养得到的丛芽切除其多余的侧面芽或不定芽,按照高度为3cm将具有单芽的小枝剪切下来,然后将剪切后的小枝放到生根培养基进行生根培养,培养26天后即可出瓶炼苗;生根培养是在温度为27℃,湿度为60%,PH值为6.0,光照强度为3000Lux,光照时度为14h/天的条件下进行的;其中,生根培养基的成分为:WPM+2.0mg/L ABT1号生根粉+4.5g/L琼脂+30g/L蔗糖;
上述三种培养基的制备方法是将组成培养基的原料混合搅拌均匀后,将其煮沸至PH值调节至6.0,然后装入培养器皿中,在123℃高温下蒸汽灭菌20min后进行冷却,得到培养基备用;
(四)大棚炼苗:用镊子将小苗从培养器皿中取出,用自来水将小苗根部的培养基洗净,然后种植到培养土苗盘里并喷淋定根水,待叶面干后,喷施1000倍液的农用链霉毒,15天后喷施30倍的沼气液,在大棚内培育5个月后进行移栽。
效果验证
为了进一步说明本发明香樟的组织培养方法的应用价值,实施人分为以下四组做对比试验:
第一组:实施例1所述的组织培养方法;
第二组:实施例2所述的组织培养方法;
第三组:实施例3所述的组织培养方法;
第四组:培养基配方更换为WPM培养基+2.5mg/L 6-BA+0.5mg/L IBA-D+30g/L蔗糖,其他方式严格按照实施例2进行。
S1:观察上述四组在组培苗情况,记录各组的生根苗数、生根率和多根率,结果见表1;
表1四组香樟组培苗情况表
根据上表可知:采用本发明的组织培养方法培育得到的香樟种苗,生根苗数多,生根率以及多根率高,适用于大规模种植,值得推广。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种香樟的组织培养方法,其特征在于,具体包括如下步骤:
(一)外植体的预处理:剪取经过挖根处理后长出的嫩芽作为外植体,将外植体剪成4-6cm的条状物,然后用大蒜汁将外植体浸泡15-30min,浸泡过程不断进行振荡,浸泡完成后用无菌水将外植体冲洗4-6次,然后放置于无菌接种盘吹干其表面水分,切去叶片以及旧的切口,切成2-2.5cm带3个芽的茎段,将带芽茎段置于自来水下冲洗30min,用滤纸吸干带芽茎段备用;
(二)培养基的培养:
(1)诱导培养:将上述步骤获得的带芽茎段先接种到诱导培养基上,黑暗条件下培养5-10天,然后按光照和黑暗时间比为2:1交替进行诱导培养,诱导新芽长高至4-5cm后,将新芽的叶片切去,切成2-3cm的茎段;
所述诱导培养基含有WPM培养基+2.5mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA+4.5g/L琼脂+30g/L蔗糖;
(2)增殖培养:将步骤(1)培养后处理得到的茎段接种到增殖培养基上培养35-40天后,将新芽转到新的增殖培养基培养,增殖倍数达到3-4倍;
所述增殖培养基的成分为:WPM+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+3.5g/L琼脂+25g/L蔗糖;
(3)生根培养:将经步骤(2)增殖培养得到的丛芽切除其多余的侧面芽或不定芽,按照高度为1.5-3cm将具有单芽的小枝剪切下来,然后将剪切后的小枝放到生根培养基进行生根培养,培养24-26天后即可出瓶炼苗;
所述生根培养基的成分为:WPM+2.0mg/L生根粉+4.5g/L琼脂+30g/L蔗糖;
(三)大棚炼苗:用镊子将小苗从培养器皿中取出,用自来水将小苗根部的培养基洗净,然后种植到培养土苗盘里并喷淋定根水,待叶面干后,喷施800-1000倍液的农用链霉毒,7-15天后喷施20-30倍的沼气液,在大棚内培育3-5个月后进行移栽。
2.根据权利要求1所述的一种香樟的组织培养方法,其特征在于,所述组织培养方法还包括外植体准备的步骤,具体为:通过检测取含精油量和芳香醇高的香樟树作为母体,将母体进行挖根处理,经过挖根处理待断根处长出嫩芽后,取断根位置新长出的嫩芽作为外植体。
3.根据权利要求1所述的一种香樟的组织培养方法,其特征在于,步骤(1)所述诱导培养是在温度为26-28℃,湿度为65-80%,PH值为5.6-6.0的条件下进行的,诱导培养中的光照为自然光照2000-2500Lux。
4.根据权利要求1所述的一种香樟的组织培养方法,其特征在于,步骤(2)所述增殖培养是在温度为26-28℃,湿度为50-75%,PH值为5.6-6.0的条件下进行的,所述增殖培养光照强度为2000-3000Lux,光照时度为12-14h/天。
5.根据权利要求1所述的一种香樟的组织培养方法,其特征在于,步骤(3)所述生根培养是在温度为24-27℃,湿度为40-60%,PH值为5.6-6.0,光照强度为2000-3000Lux,光照时度为12-14h/天的条件下进行的。
6.根据权利要求1所述的一种香樟的组织培养方法,其特征在于,步骤(3)所述生根粉为ABT1号生根粉。
7.根据权利要求2所述的一种香樟的组织培养方法,其特征在于,所述作为外植体的嫩芽为4-6月份非下雨天期间长出的嫩芽。
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