CN105961197A - 一种辣木高效再生方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种辣木高效再生方法。本发明方法通过优化培养基和培养条件，克服了辣木叶片再生难的问题，提供一种以辣木叶片为外植体的辣木高效再生方法。该方法可摆脱外界条件的影响，规模化和工厂化生产出健壮、整齐一致的辣木组培幼苗；与已经报道的以下胚轴、茎节、茎尖作为外植体构建再生体系相比，具有操作方便、取材广泛、可重复性强及效率高等优势；不仅能满足市场对种苗的需求，并且可以通过转基因研究对辣木种质资源进行改良和创新，为辣木种质资源可持续利用奠定基础。

Description

一种辣木高效再生方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种辣木高效再生方法。
背景技术
辣木(Moringa Oleifera)是一种有独特经济价值的辣木科(Moringaceae)辣木属植物。原产于印度喜马拉雅山、非洲等热带地区，后来被很多国家引种栽培。目前，在巴基斯坦、印度、中国、美国、巴西、东南亚等热带、亚热带国家和地区都有分布。辣木为多年生常绿或落叶小乔木，喜温耐旱，抗逆性强。它是一种典型的多功能植物，营养价值高，全身是宝，有着悠久的食用历史，在国外有“神奇之树”、“母亲最好的朋友”、“医药百宝箱”等美名，是一种极具发展前景的树种。
目前辣木主要是通过播种育苗繁育，但种子不耐贮藏，一年后种子活力就下降50％，随着贮藏时间延长，种子萌发率越来越低，而且辣木种子价格昂贵。为了节约生产成本，提高苗木质量和移栽成活率，国内外开始对提高辣木种苗繁殖率进行深入研究。扦插对木本需求量大，且目前也还未建立起高效的辣木扦插繁殖体系。因此，采用传统的种子繁殖和扦插繁殖均不能在短时间内获得大量的种苗满足市场需求，而通过组织培养的方式可以解决该问题。随着辣木全基因组测序的完成，辣木育种也必将进入分子育种时代，辣木遗传转化体系的构建显得尤为重要，而高效的再生体系是遗传转化体系构建的前提。
关于辣木的组织培养，国内外已有几篇成功报道，主要以茎节、茎尖、下胚轴为外植体建立再生体系，认为茎节和下胚轴的再生能力最好，而以叶片为外植体建立辣木再生体系的研究则无成功报道。相对于茎节和下胚轴，叶片作为再生及遗传转化的外植体有其优势，取材方便、操作容易、来源广泛，有利于再生及遗传转化的重复进行等。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的辣木叶片再生难的问题，提供一种操作更简便、取材更广泛的以辣木叶片为外植体的辣木高效再生方法，利用该方法能够在短期内快速获得大量优质的辣木种苗，提高辣木再生能力，并为种质资源保护和基因工程研究提供有效的参考价值。
本发明的辣木高效再生方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、无菌苗的获得：将辣木种子去壳，在水中浸泡8～24h，经消毒后将种子播种于固体MS培养基上培养得到无菌苗，切取无菌苗的小叶作为外植体；培养温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。
B、芽的诱导及伸长：将小叶接种到芽诱导培养基上培养诱导不定芽，接种时小叶远轴面朝上，培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d；培养至外植体上有芽点出现时，将外植体转移到芽伸长培养基上在相同条件下培养诱导不定芽伸长。
所述的芽诱导培养基：每升含有BA 0.8～1.2mg、KT 0.05～0.2mg、NAA0.05mg、蔗糖30g和琼脂4.5g，余量为MS培养基。
所述的芽伸长培养基：每升含有BA0.4～0.6mg、NAA 0.05mg、蔗糖30g和琼脂4.5g，余量为MS培养基。
C、生根培养：待不定芽伸长到3～4cm时，切取不定芽，接种于生根培养基上培养诱导生根，得到生根苗；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。
所述的生根培养基：每升含有NAA0.1～0.2mg、蔗糖30g和琼脂4.5g，余量为MS培养基，pH 5.8～6.0。
D、炼苗及移栽：将生根苗取出，洗净根上的培养基，将生根苗在水中浸泡2h，移栽到泥炭土上，进行培养管理，得到辣木植株。
优选，所述的步骤A的消毒是将辣木种子用体积分数75％酒精灭菌50s，无菌水冲洗1-3次，再用质量分数0.1％升汞灭菌15～20min，无菌水冲洗3～5次。
优选，所述的步骤D的进行培养管理是在移栽的生根苗上套上塑料袋保湿，在移栽3d后逐渐移开塑料袋，适时浇水。
优选，所述的步骤D的泥炭土为高温灭菌过的泥炭土。
所述的步骤A的固体MS培养基每升含有蔗糖30g和琼脂4.5g，余量为MS培养基。
所述的MS培养基为国际通用的培养基，其成份和配置方法见Murashige T,Skoog F(1962)A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures.Physiol Plant 15:473–497。
本发明的辣木高效再生方法，可摆脱外界条件的影响，规模化和工厂化生产出健壮、整齐一致的辣木组培幼苗；与已经报道的以下胚轴、茎节、茎尖作为外植体构建再生体系相比，具有操作方便、取材广泛、可重复性强及效率高等优势。该方法不仅能满足市场对种苗的需求，并且可以通过转基因研究对辣木种质资源进行改良和创新，为辣木种质资源可持续利用奠定基础。
附图说明
图1为消毒后种子在MS培养基上培养25d天后得到的无菌苗。
图2为小叶外植体在芽诱导培养基上培养20d后长出的芽。
图3为长芽的外植体在芽伸长培养基上培养20d后伸长的不定芽。
图4为伸长的不定芽在生根培养基上培养后诱导生出的根。
图5为炼苗成活的辣木植株。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
A、无菌苗的获得：将辣木种子去壳，在水中浸泡24h；在无菌超净台上，用体积分数75％酒精灭菌50s，无菌水冲洗3次，质量分数0.1％升汞灭菌20min，无菌水彻底冲洗5次，将种子播种于固体MS培养基上培养，培养温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。种子培养7d左右开始萌芽，25d后，无菌苗(如图1所示)叶片舒展开来，切取单个小叶作为外植体。
B、芽的诱导及伸长：将小叶接种到芽诱导培养基上培养诱导不定芽，接种时小叶远轴面朝上；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。培养20d后，外植体上开始有芽点出现(如图2所示)，将长芽的外植体转移到芽伸长培养基上在相同条件下培养诱导不定芽伸长，培养20d后伸长的不定芽如图3所示。所述的芽诱导培养基：每升含有BA1.2mg、KT0.2mg、NAA0.05mg、蔗糖30g和琼脂4.5g，余量为MS培养基；配制方法是将上述成份混合均匀，然后灭菌备用。所述的芽伸长培养基：每升含有BA0.6mg、NAA0.05mg、蔗糖30g和琼脂4.5g，余量为MS培养基；配制方法是将上述成份混合均匀，然后灭菌备用。
C、生根培养：待不定芽伸长到4cm时，切取不定芽，接种于生根培养基上培养诱导生根，生根培养20d后，不定芽长出多条根得到生根苗，生根情况如图4所示；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。所述的生根培养基：每升含有NAA0.2mg、蔗糖30g和琼脂4.5g，余量为MS培养基，pH6.0；配制方法是将上述成份混合均匀后，调pH值，然后灭菌备用。
D、炼苗及移栽：小心将生根苗从培养瓶中挖出，洗净根上的培养基，将生根苗在自来水中浸泡2h，移栽到灭菌过的泥炭土上，在营养杯上套上塑料袋保湿，3d后慢慢地移开塑料袋，按生长需求浇水。炼苗成活的辣木植株如图5所示。
实施例2
A、无菌苗的获得：将辣木种子去壳，在水中浸泡16h；在无菌超净台上，用体积分数75％酒精灭菌50s，无菌水冲洗3次，质量分数0.1％升汞灭菌18min，无菌水彻底冲洗5次，将种子播种于固体MS培养基上培养，培养温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。种子培养7d左右开始萌芽，20d后，无菌苗叶片舒展开来，切取单个小叶作为外植体。
B、芽的诱导及伸长：将小叶接种到芽诱导培养基上培养诱导不定芽，接种时小叶远轴面朝上；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。培养25d后，外植体上开始有芽点出现，将长芽的外植体转移到芽伸长培养基上在相同条件下培养诱导不定芽伸长。所述的芽诱导培养基：每升含有BA 1.0mg、KT 0.12mg、NAA0.05mg、蔗糖30g和琼脂4.5g，余量为MS培养基；配制方法是将上述成份混合均匀，然后灭菌备用。所述的芽伸长培养基：每升含有BA0.5mg、NAA 0.05mg、蔗糖30g和琼脂4.5g，余量为MS培养基；配制方法是将上述成份混合均匀，然后灭菌备用。
C、生根培养：待不定芽伸长到4cm时，切取不定芽，接种于生根培养基上培养诱导生根，生根培养20d后，不定芽长出多条根得到生根苗；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。所述的生根培养基：每升含有NAA0.15mg、蔗糖30g和琼脂4.5g，余量为MS培养基，pH5.9；配制方法是将上述成份混合均匀后，调pH值，然后灭菌备用。
D、炼苗及移栽：小心将生根苗从培养瓶中挖出，洗净根上的培养基，将生根苗在自来水中浸泡2h，移栽到灭菌过的泥炭土上，在营养杯上套上塑料袋保湿，3d后慢慢地移开塑料袋，按生长需求浇水。由此培养得到健康成活的辣木植株。
实施例3
A、无菌苗的获得：将辣木种子去壳，在水中浸泡8h；在无菌超净台上，用体积分数75％酒精灭菌50s，无菌水冲洗1次，质量分数0.1％升汞灭菌15min，无菌水彻底冲洗3次，将种子播种于固体MS培养基上培养，培养温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。种子培养7d左右开始萌芽，15d后，无菌苗叶片舒展开来，切取单个小叶作为外植体。
B、芽的诱导及伸长：将小叶接种到芽诱导培养基上培养诱导不定芽，接种时小叶远轴面朝上；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。培养15d后，外植体上开始有芽点出现，将长芽的外植体转移到芽伸长培养基上在相同条件下培养诱导不定芽伸长。所述的芽诱导培养基：每升含有BA 0.8mg、KT 0.05mg、NAA0.05mg、蔗糖30g和琼脂4.5g，余量为MS培养基；配制方法是将上述成份混合均匀，然后灭菌备用。所述的芽伸长培养基：每升含有BA0.4mg、NAA 0.05mg、蔗糖30g和琼脂4.5g，余量为MS培养基；配制方法是将上述成份混合均匀，然后灭菌备用。
C、生根培养：待不定芽伸长到3cm时，切取不定芽，接种于生根培养基上培养诱导生根，生根培养20d后，不定芽长出多条根得到生根苗；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。所述的生根培养基：每升含有NAA0.1mg、蔗糖30g和琼脂4.5g，余量为MS培养基，pH5.8。
D、炼苗及移栽：小心将生根苗从培养瓶中挖出，洗净根上的培养基，将生根苗在自来水中浸泡2h，移栽到灭菌过的泥炭土上，在营养杯上套上塑料袋保湿，3d后慢慢地移开塑料袋，按生长需求浇水。由此培养得到健康成活的辣木植株。

Claims (6)

1.一种辣木高效再生方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、无菌苗的获得：将辣木种子去壳，在水中浸泡8～24h，经消毒后将种子播种于固体MS培养基上培养得到无菌苗，切取无菌苗的小叶作为外植体；
B、芽的诱导及伸长：将小叶接种到芽诱导培养基上培养诱导不定芽，接种时小叶远轴面朝上，培养至外植体上有芽点出现时，将外植体转移到芽伸长培养基上在相同条件下培养诱导不定芽伸长；所述的芽诱导培养基：每升含有BA 0.8～1.2mg、KT 0.05～0.2mg、NAA0.05mg、蔗糖30g和琼脂4.5g，余量为MS培养基；所述的芽伸长培养基：每升含有BA0.4～0.6mg、NAA 0.05mg、蔗糖30g和琼脂4.5g，余量为MS培养基；
C、生根培养：待不定芽伸长到3～4cm时，切取不定芽，接种于生根培养基上培养诱导生根，得到生根苗；所述的生根培养基：每升含有NAA0.1～0.2mg、蔗糖30g和琼脂4.5g，余量为MS培养基，pH 5.8～6.0；
D、炼苗及移栽：将生根苗取出，洗净根上的培养基，将生根苗在水中浸泡2h，移栽到泥炭土上，进行培养管理，得到辣木植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤A的消毒是将辣木种子用体积分数75％酒精灭菌50s，无菌水冲洗1-3次，再用质量分数0.1％升汞灭菌15～20min，无菌水冲洗3～5次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤A的固体MS培养基每升含有蔗糖30g和琼脂4.5g，余量为MS培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤A、B和C的培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤D的进行培养管理是在移栽的生根苗上套上塑料袋保湿，在移栽3d后逐渐移开塑料袋，适时浇水。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤D的泥炭土为高温灭菌过的泥炭土。
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