CN107466862A - 一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法，是以鼓槌石斛成熟蒴果为外植体取材对象，设计各培养阶段专用培养基配方，通过种子‑原球茎‑芽达到快速繁殖目的，包括以下步骤：外植体的选择和消毒、种子萌发培养、壮苗培养、生根培养及试管苗移栽。采用本发明方法仅需115d至135d就能获得鼓槌石斛种苗；本发明种子萌发与芽分化同步进行，简化了培养环节、降低了培养成本，且种子萌发率高，成苗时间短，即繁殖效率高，进而提高了整个种苗培养的效率；另外，本发明培养的试管苗健壮、根系发达，且通过驯化炼苗，其环境适应能力较强，从而提高了种苗移栽成活率，从而实现鼓槌石斛种苗快速繁育的目的。

Description

一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法
【技术领域】
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法。
【背景技术】
鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxum Lindl.)为兰科石斛属多年生植物，别名金弓石斛，兼具观赏、药用价值，全株可食；据《中国药典》记载：其味淡、性微寒，有滋阴养胃，清热解毒的功效，含有鼓槌菲、毛兰素等抗肿瘤活性成分，是脉络宁、通塞脉片、石斛液光丸等著名中成药的主要原料之一，在临床上多用于治疗慢性咽喉炎、眼科疾病、血栓闭塞性疾病，效果十分明显；同时，鼓槌石斛也是一种观赏性极佳的兰科植物，其花总状花序，金黄色，具清香，艳丽多姿，其茎呈纺锤形，奇特，其可作切花与盆栽观赏。
近年来，人们过度采挖，加上自然条件下种子萌发率低，导致鼓槌石斛的野生资源濒临枯竭；目前，鼓槌石斛种苗生产主要靠分株繁殖，繁殖速度慢，难以满足市场需求。因利用植物组织培养技术可以实现鼓槌石斛种苗快速繁殖，尤其鼓槌石斛果荚种子量大，有成千上万粒种子，种子的成功萌发与快速成苗问题，近年愈来愈受到从业人员的重视。
现有虽然出现一些关于鼓槌石斛组培快速繁殖的报道，但在规模化生产时，往往存在着种胚萌发率低(75％以下)、种苗繁殖周期长(8个月以上)、移栽成活率低(85％以下)等问题，这对鼓槌石斛优质种苗的获得极为不利。为了解决这些鼓槌石斛种子组培快繁中存在的问题，申请号为CN201410674752.6、名称为“一种鼓槌石斛种子组织培养快速繁殖方法”的中国专利中，公开了以鼓槌石斛种子为材料，采用培养基进行种子萌发、分化继代培养及生根培养并获得种苗；其虽然建立了鼓槌石斛的组织培养繁殖技术，但其萌发率、成苗率、繁殖效率与移栽成活率并不理想；另外，申请号为CN201410392173.2、名称为“鼓槌石斛种苗商品化生产方法”的中国专利中，提出了以鼓槌石斛果荚为材料，采用改良培养基建立了鼓槌石斛无菌快繁体系，其虽然具有较为理想的种子萌发率(98％以上)、生长周期(155d)及移栽成活率(95％以上)，但却存在着操作过程相对较为繁复的缺陷。
由鉴于此，研究或优化，以期得到一种操作过程相对便捷、萌发率高、培养效率与移栽成活率均较为理想的鼓槌石斛种苗的组织培养快速繁殖方法，是从业人员所迫切希望地。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法，该方法包括如下具体操作步骤：
(1)外植体的选择与消毒：以鼓槌石斛成熟蒴果为外植体取材对象，先将蒴果清洗干净，并剔除宿存花被、果柄；然后在超净工作台上将外植体放入灭菌后的无菌容器中，先用75％的酒精浸泡60s，随后转入0.1％HgCl2溶液中浸泡消毒8～10min，再用装有已灭菌无菌水的超声波清洗器震荡清洗8～10min，取出备用；
(2)种子萌发：取经步骤(1)处理过的蒴果，将果荚平切打开果皮，露出种子，夹取种子并均匀撒播于种子萌发培养基表面进行培养；种子播种培养5～7d，开始由黄转绿，接种10～15d萌发成原球茎，随后原球茎逐渐长大，接种30～35d分化出芽，获得小芽团，小芽团的芽大小0.5～0.8cm；
(3)壮苗培养：将步骤(2)获得的小芽团接种于壮苗培养基中培养，培养30～40d即可获得株高2.0～3.0cm、根长0.2～0.5cm、根数1～2条的健壮小苗；
(4)生根培养：将步骤(3)获得的健壮小苗接种于生根培养基中培养，培养55～60d即获得株高6.0～7.0cm、根长3.0～4.0cm、根数5～7条的完整植株即种苗；
(5)试管苗移栽：移栽前，将步骤(4)获得的苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净苗根部粘连的培养基，之后将苗置于浓度为0.8～1.0g/L的多菌灵溶液中浸泡消毒3～5min，取出晾干后种植于发酵过的基质中，且基质在种植前均匀铺在温室苗床上，最后进行常规栽培管理即可；
其中，种子萌发培养基的组分为：Ca(NO3)2 1.0g/L、(NH4)2SO4 0.8g/L、KH2PO40.25g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、TDZ 0.3～0.5mg/L、NAA 0.1～0.2mg/L、活性炭0.5～0.8g/L、香蕉粉2.5～3.0g/L、白糖30～35g/L、凝固剂4.5～5.0g/L；
壮苗培养基的组分为：花宝1号1.5～2.0g/L、KNO3 1.0g/L、NH4NO3 0.8g/L、KH2PO40.1g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、CaCl2·2H2O 0.4g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB1 5.0～8.0mg/L、VB6 1.0mg/L、肌醇100～150mg/L、白糖30～35g/L、凝固剂6.0～6.6g/L；
生根培养基的组分为：花宝1号1.2～1.5g/L、KNO3 0.8～1.0g/L、NH4NO30.5～0.8g/L、KH2PO4 0.1～0.15g/L、MgSO4·7H2O 0.15～0.2g/L、CaCl2·2H2O 0.2～0.4g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、VB1 1.0～2.0mg/L、VB6 3.0～5.0mg/L、肌醇100～150mg/L、白糖20～25g/L、凝固剂6.3～7.0g/L、吲哚丁酸0.3～0.5mg/L、活性炭1.0～1.5g/L、及香蕉粉3.0～4.0g/L。
进一步地，所述步骤(1)中，鼓槌石斛成熟蒴果为优良鼓槌石斛母株进行人工杂交异株授粉180～210d未开裂的果荚。
进一步地，所述步骤(1)中，蒴果清洗的具体操作为：先蒴果将置于自来水水龙头流水下冲洗3～5min，后用洗洁精溶液浸泡5min，再用自来水冲洗干净。
进一步地，所述步骤(1)中，震荡清洗的摇床振荡转速为90r/min；外植体取材时间为3～5月份。
进一步地，所述步骤(1)中，无菌水与无菌容器的灭菌操作均具体为：将无菌水或无菌容器置于121℃下灭菌40min即可。
进一步地，所述种子萌发培养基、壮苗培养基、生根培养基中的凝固剂均为琼脂粉与卡拉胶的混合物，且琼脂粉与卡拉胶质量比1：1。
进一步地，所述种子萌发培养基、壮苗培养基、生根培养基的pH值均为5.6～5.8；且种子萌发培养的培养条件为：培养温度为24±3℃，在刚接种时暗培养3～5d，之后在1200～1500lx的光强下培养，光照10h/d；壮苗培养基的培养条件为：培养温度为24±3℃，且于1500～1800lx的关强下培养，光照10h/d；生根培养的培养条件为：培养温度为24±3℃，且于1800～2000lx的关强下培养，光照12h/d。
进一步地，所述步骤(5)中，炼苗是在遮光率为70～80％、温度为22～28℃的温室中进行，且闭口15～20d、半敞口3～5d、全敞口2～3d。
进一步地，所述步骤(5)中，基质由质量比为2：1的椰壳与树皮混合而成。
本发明一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法的有益效果在于：
利用本发明方法，仅需115d至135d就能获得鼓槌石斛种苗；且本发明中种子萌发培养能够使得种子萌发与芽分化同步进行，简化了培养环节、降低了培养成本，且种子萌发率高，成苗时间短，即繁殖效率高，进而提高了整个种苗培养的效率；另外，利用本发明壮苗培养基配方与生根培养基配方培养的试管苗健壮、根系发达，且通过驯化炼苗，其环境适应能力较强，从而提高了种苗移栽成活率，2个月移栽成活率达96.8％以上；换而言之，本发明方法克服了现有技术中鼓槌石斛种苗培养操作过程相对较为繁复、效率低、组培苗抗性差，移栽成活率低的缺陷。
【具体实施方式】
本发明一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法，该方法包括如下具体操作步骤：
(1)外植体的选择与消毒：以鼓槌石斛成熟蒴果为外植体取材对象(外植体取材时间为3～5月份，能够更有利于移栽种苗的成活)，先将蒴果清洗干净，并剔除宿存花被、果柄；然后在超净工作台上将外植体放入灭菌后的无菌容器中，先用75％的酒精浸泡60s，随后转入0.1％HgCl2溶液中浸泡消毒8～10min，再用装有已灭菌无菌水的超声波清洗器震荡(摇床振荡转速为90r/min)清洗8～10min，取出备用；
(2)种子萌发：取经步骤(1)处理过的蒴果，将果荚平切打开果皮，露出种子，夹取种子并均匀撒播于种子萌发培养基表面进行培养；种子播种培养5～7d，开始由黄转绿，接种10～15d萌发成原球茎(萌发率高达100.0％)，随后原球茎逐渐长大，接种30～35d分化出芽，获得小芽团，小芽团的芽大小0.5～0.8cm；即种子萌发与芽分化同步进行；
(3)壮苗培养：将步骤(2)获得的小芽团接种于壮苗培养基中培养，培养30～40d即可获得株高2.0～3.0cm、根长0.2～0.5cm、根数1～2条的健壮小苗；
(4)生根培养：将步骤(3)获得的健壮小苗接种于生根培养基中培养，培养55～60d即获得株高6.0～7.0cm、根长3.0～4.0cm、根数5～7条的完整植株即种苗(生根率达100.0％，且种苗健壮)；
(5)试管苗移栽：移栽前，将步骤(4)获得的苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净苗根部粘连的培养基，之后将苗置于浓度为0.8～1.0g/L的多菌灵溶液中浸泡消毒3～5min，取出晾干后种植于发酵过的基质中，且基质在种植前均匀铺在温室苗床上，最后进行常规栽培管理即可；
其中，种子萌发培养基的组分为：Ca(NO3)2 1.0g/L、(NH4)2SO4 0.8g/L、KH2PO40.25g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、TDZ 0.3～0.5mg/L、NAA 0.1～0.2mg/L、活性炭0.5～0.8g/L、香蕉粉2.5～3.0g/L、白糖30～35g/L、凝固剂4.5～5.0g/L；
壮苗培养基的组分为：花宝1号1.5～2.0g/L、KNO3 1.0g/L、NH4NO3 0.8g/L、KH2PO40.1g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、CaCl2·2H2O 0.4g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB1 5.0～8.0mg/L、VB6 1.0mg/L、肌醇100～150mg/L、白糖30～35g/L、凝固剂6.0～6.6g/L；
生根培养基的组分为：花宝1号1.2～1.5g/L、KNO3 0.8～1.0g/L、NH4NO30.5～0.8g/L、KH2PO4 0.1～0.15g/L、MgSO4·7H2O 0.15～0.2g/L、CaCl2·2H2O 0.2～0.4g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、VB1 1.0～2.0mg/L、VB6 3.0～5.0mg/L、肌醇100～150mg/L、白糖20～25g/L、凝固剂6.3～7.0g/L、吲哚丁酸0.3～0.5mg/L、活性炭1.0～1.5g/L、及香蕉粉3.0～4.0g/L。
在本发明具体实施例中，鼓槌石斛成熟蒴果为优良鼓槌石斛母株进行人工杂交异株授粉180～210d未开裂的果荚。蒴果清洗的具体操作为：先蒴果将置于自来水水龙头流水下冲洗3～5min，后用洗洁精溶液浸泡5min，再用自来水冲洗干净；能够使得蒴果清洗的更为干净。无菌水与无菌容器的灭菌操作均具体为：将无菌水或无菌容器置于121℃下灭菌40min即可。种子萌发培养基、壮苗培养基、生根培养基中的凝固剂均为琼脂粉与卡拉胶的混合物，且琼脂粉与卡拉胶质量比1：1，成本较低。种子萌发培养基、壮苗培养基、生根培养基的pH值均为5.6～5.8；且种子萌发培养的培养条件为：培养温度为24±3℃，在刚接种时暗培养3～5d，之后在1200～1500lx的光强下培养，光照10h/d；壮苗培养基的培养条件为：培养温度为24±3℃，且于1500～1800lx的关强下培养，光照10h/d；生根培养的培养条件为：培养温度为24±3℃，且于1800～2000lx的关强下培养，光照12h/d。炼苗是在遮光率为70～80％、温度为22～28℃的温室中进行，且闭口15～20d、半敞口3～5d、全敞口2～3d。基质由质量比为2：1的椰壳与树皮混合而成，使得基质在确保营养的同时，具有成本低廉的特点。
另外，需要说明的是，在无特殊说明的情况下，本发明中的百分数均为质量百分数。
为了对本发明方法进行进一步的阐述说明，申请人给出了如下几个实施例，且这些实施例仅是示例性的，并不用于限制本发明的保护范围。
实施例一
外植体的选择与消毒：以人工授粉195d的鼓槌石斛成熟蒴果为外植体取材对象，先将蒴果置于自来水水龙头流水下冲洗3min，后用洗洁精溶液浸泡5min，再用自来水冲洗干净，并剔除宿存花被、果柄；然后在超净工作台上将外植体放入灭菌后的无菌容器中，先用75％的酒精浸泡60s，随后转入0.1％HgCl2溶液中浸泡消毒8～10min，再用装有已灭菌无菌水的超声波清洗器震荡(摇床振荡转速为90r/min)清洗8～10min，取出备用；
种子萌发：取清洗消毒过的蒴果，将果荚平切打开果皮，露出种子，用镊子夹取种子并均匀撒播于种子萌发培养基表面进行培养；种子播种培养5d，开始由黄转绿，接种10d萌发成原球茎(萌发率高达100.0％)，随后原球茎逐渐长大，接种30d分化出芽，瓶底长满密密麻麻小芽团即获得小芽团，小芽团的芽大小0.5～0.6cm；种子萌发培养基的组分为：Ca(NO3)2 1.0g/L、(NH4)2SO4 0.8g/L、KH2PO4 0.25g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、TDZ 0.3mg/L、NAA 0.1mg/L、活性炭0.5g/L、香蕉粉2.5g/L、白糖30g/L、凝固剂4.5g/L；
壮苗培养：将获得的小芽团接种于壮苗培养基中培养，培养30d即可获得株高2.0～3.0cm、根长0.2～0.5cm、根数1～2条的健壮小苗；壮苗培养基的组分为：花宝1号1.5g/L、KNO3 1.0g/L、NH4NO3 0.8g/L、KH2PO4 0.1g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、CaCl2·2H2O 0.4g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、VB1 5.0mg/L、VB6 1.0mg/L、肌醇120mg/L、白糖30g/L、凝固剂6.0g/L；
生根培养：将获得的健壮小苗接种于生根培养基中培养，培养55d即获得株高6.0～6.5cm、根长3.0～3.5cm、根数5～6条的完整植株即种苗(生根率达100.0％，且种苗健壮)；生根培养基的组分为：花宝1号1.5g/L、KNO3 1.0g/L、NH4NO30.8g/L、KH2PO4 0.15g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、CaCl2·2H2O 0.4g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、VB12.0mg/L、VB6 5.0mg/L、肌醇150mg/L、白糖25g/L、凝固剂7.0g/L、吲哚丁酸0.5mg/L、活性炭1.5g/L、及香蕉粉4.0g/L；
试管苗移栽：移栽前，将生根培养后获得的苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净苗根部粘连的培养基，之后将苗置于浓度为0.9g/L的多菌灵溶液中浸泡消毒4min，取出晾干后种植于发酵过的基质中，且基质在种植前均匀铺在温室苗床上，最后进行常规栽培管理，2个月移栽成活率达96.8％。
实施例二
外植体的选择与消毒：以人工授粉180d的鼓槌石斛成熟蒴果为外植体取材对象，先将蒴果置于自来水水龙头流水下冲洗5min，后用洗洁精溶液浸泡5min，再用自来水冲洗干净，并剔除宿存花被、果柄；然后在超净工作台上将外植体放入灭菌后的无菌容器中，先用75％的酒精浸泡60s，随后转入0.1％HgCl2溶液中浸泡消毒9min，再用装有已灭菌无菌水的超声波清洗器震荡(摇床振荡转速为90r/min)清洗9min，取出备用；
种子萌发：取清洗消毒过的蒴果，将果荚平切打开果皮，露出种子，用镊子夹取种子并均匀撒播于种子萌发培养基表面进行培养；种子播种培养6d，开始由黄转绿，接种12d萌发成原球茎(萌发率高达100.0％)，随后原球茎逐渐长大，接种33d分化出芽，瓶底长满密密麻麻小芽团即获得小芽团，小芽团的芽大小0.5～0.8cm；种子萌发培养基的组分为：Ca(NO3)2 1.0g/L、(NH4)2SO4 0.8g/L、KH2PO4 0.25g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、TDZ 0.4mg/L、NAA 0.1mg/L、活性炭0.7g/L、香蕉粉2.8g/L、白糖33g/L、凝固剂4.8g/L；
壮苗培养：将获得的小芽团接种于壮苗培养基中培养，培养35d即可获得株高2.0～3.0cm、根长0.2～0.5cm、根数1～2条的健壮小苗；壮苗培养基的组分为：花宝1号1.8g/L、KNO3 1.0g/L、NH4NO3 0.8g/L、KH2PO4 0.1g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、CaCl2·2H2O 0.4g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、VB1 7.0mg/L、VB6 1.0mg/L、肌醇120mg/L、白糖33g/L、凝固剂6.3g/L；
生根培养：将获得的健壮小苗接种于生根培养基中培养，培养58d即获得株高6.0～6.5cm、根长3.0～4.0cm、根数5～7条的完整植株即种苗(生根率达100.0％，且种苗健壮)；生根培养基的组分为：花宝1号1.3g/L、KNO3 0.9g/L、NH4NO3 0.7g/L、KH2PO4 0.13g/L、MgSO4·7H2O 0.18g/L、CaCl2·2H2O 0.3g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、VB11.5mg/L、VB6 4.0mg/L、肌醇100mg/L、白糖23g/L、凝固剂6.5g/L、吲哚丁酸0.4mg/L、活性炭1.2g/L、及香蕉粉3.5g/L；
试管苗移栽：移栽前，将生根培养后获得的苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净苗根部粘连的培养基，之后将苗置于浓度为1.0g/L的多菌灵溶液中浸泡消毒5min，取出晾干后种植于发酵过的基质中，且基质在种植前均匀铺在温室苗床上，最后进行常规栽培管理，2个月移栽成活率达97.5％。
实施例三
外植体的选择与消毒：以人工授粉210d的鼓槌石斛成熟蒴果为外植体取材对象，先将蒴果置于自来水水龙头流水下冲洗4min，后用洗洁精溶液浸泡5min，再用自来水冲洗干净，并剔除宿存花被、果柄；然后在超净工作台上将外植体放入灭菌后的无菌容器中，先用75％的酒精浸泡60s，随后转入0.1％HgCl2溶液中浸泡消毒10min，再用装有已灭菌无菌水的超声波清洗器震荡(摇床振荡转速为90r/min)清洗10min，取出备用；
种子萌发：取清洗消毒过的蒴果，将果荚平切打开果皮，露出种子，用镊子夹取种子并均匀撒播于种子萌发培养基表面进行培养；种子播种培养7d，开始由黄转绿，接种15d萌发成原球茎(萌发率高达100.0％)，随后原球茎逐渐长大，接种35d分化出芽，瓶底长满密密麻麻小芽团即获得小芽团，小芽团的芽大小0.6～0.8cm；种子萌发培养基的组分为：Ca(NO3)2 1.0g/L、(NH4)2SO4 0.8g/L、KH2PO4 0.25g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、TDZ 0.5mg/L、NAA 0.2mg/L、活性炭0.8g/L、香蕉粉3.0g/L、白糖35g/L、凝固剂5.0g/L；
壮苗培养：将获得的小芽团接种于壮苗培养基中培养，培养40d即可获得株高2.5～3.0cm、根长0.3～0.5cm、根数1～2条的健壮小苗；壮苗培养基的组分为：花宝1号2.0g/L、KNO3 1.0g/L、NH4NO3 0.8g/L、KH2PO4 0.1g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、CaCl2·2H2O 0.4g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、VB1 8.0mg/L、VB6 1.0mg/L、肌醇150mg/L、白糖35g/L、凝固剂6.6g/L；
生根培养：将获得的健壮小苗接种于生根培养基中培养，培养60d即获得株高6.5～7.0cm、根长3.5～4.0cm、根数6～7条的完整植株即种苗(生根率达100.0％，且种苗健壮)；生根培养基的组分为：花宝1号1.2g/L、KNO3 0.8g/L、NH4NO3 0.5g/L、KH2PO4 0.1g/L、MgSO4·7H2O 0.15g/L、CaCl2·2H2O 0.2g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、VB11.0mg/L、VB63.0mg/L、肌醇100mg/L、白糖20g/L、凝固剂6.3g/L、吲哚丁酸0.3mg/L、活性炭1.0g/L、及香蕉粉3.0g/L；
试管苗移栽：移栽前，将生根培养后获得的苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净苗根部粘连的培养基，之后将苗置于浓度为0.8g/L的多菌灵溶液中浸泡消毒5min，取出晾干后种植于发酵过的基质中，且基质在种植前均匀铺在温室苗床上，最后进行常规栽培管理，2个月移栽成活率达98.5％。
综上，利用本发明方法仅需115d至135d就能获得鼓槌石斛种苗；且本发明中种子萌发培养能够使得种子萌发与芽分化同步进行，简化了培养环节、降低了培养成本，且种子萌发率高，成苗时间短，即繁殖效率高，进而提高了整个种苗培养的效率；另外，利用本发明壮苗培养基配方与生根培养基配方培养的试管苗健壮、根系发达，且通过驯化炼苗，其环境适应能力较强，从而提高了种苗移栽成活率，2个月移栽成活率达96.8％以上；换而言之，本发明方法克服了现有技术中鼓槌石斛种苗培养操作过程相对较为繁复、效率低、组培苗抗性差，移栽成活率低的缺陷。

Claims (9)

1.一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法，其特征在于：该方法包括如下具体操作步骤：
(1)外植体的选择与消毒：以鼓槌石斛成熟蒴果为外植体取材对象，先将蒴果清洗干净，并剔除宿存花被、果柄；然后在超净工作台上将外植体放入灭菌后的无菌容器中，先用75％的酒精浸泡60s，随后转入0.1％HgCl2溶液中浸泡消毒8～10min，再用装有已灭菌无菌水的超声波清洗器震荡清洗8～10min，取出备用；
(2)种子萌发：取经步骤(1)处理过的蒴果，将果荚平切打开果皮，露出种子，夹取种子并均匀撒播于种子萌发培养基表面进行培养；种子播种培养5～7d，开始由黄转绿，接种10～15d萌发成原球茎，随后原球茎逐渐长大，接种30～35d分化出芽，获得小芽团，小芽团的芽大小0.5～0.8cm；
(3)壮苗培养：将步骤(2)获得的小芽团接种于壮苗培养基中培养，培养30～40d即可获得株高2.0～3.0cm、根长0.2～0.5cm、根数1～2条的健壮小苗；
(4)生根培养：将步骤(3)获得的健壮小苗接种于生根培养基中培养，培养55～60d即获得株高6.0～7.0cm、根长3.0～4.0cm、根数5～7条的完整植株即种苗；
(5)试管苗移栽：移栽前，将步骤(4)获得的苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净苗根部粘连的培养基，之后将苗置于浓度为0.8～1.0g/L的多菌灵溶液中浸泡消毒3～5min，取出晾干后种植于发酵过的基质中，且基质在种植前均匀铺在温室苗床上，最后进行常规栽培管理即可；
其中，种子萌发培养基的组分为：Ca(NO3)2 1.0g/L、(NH4)2SO4 0.8g/L、KH2PO4 0.25g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、TDZ 0.3～0.5mg/L、NAA0.1～0.2mg/L、活性炭0.5～0.8g/L、香蕉粉2.5～3.0g/L、白糖30～35g/L、凝固剂4.5～5.0g/L；
壮苗培养基的组分为：花宝1号1.5～2.0g/L、KNO3 1.0g/L、NH4NO3 0.8g/L、KH2PO40.1g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、CaCl2·2H2O 0.4g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB1 5.0～8.0mg/L、VB6 1.0mg/L、肌醇100～150mg/L、白糖30～35g/L、凝固剂6.0～6.6g/L；
生根培养基的组分为：花宝1号1.2～1.5g/L、KNO3 0.8～1.0g/L、NH4NO30.5～0.8g/L、KH2PO4 0.1～0.15g/L、MgSO4·7H2O 0.15～0.2g/L、CaCl2·2H2O 0.2～0.4g/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、VB1 1.0～2.0mg/L、VB6 3.0～5.0mg/L、肌醇100～150mg/L、白糖20～25g/L、凝固剂6.3～7.0g/L、吲哚丁酸0.3～0.5mg/L、活性炭1.0～1.5g/L、及香蕉粉3.0～4.0g/L。
2.根据权利要求1所述一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，鼓槌石斛成熟蒴果为优良鼓槌石斛母株进行人工杂交异株授粉180～210d未开裂的果荚。
3.根据权利要求1所述一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，蒴果清洗的具体操作为：先蒴果将置于自来水水龙头流水下冲洗3～5min，后用洗洁精溶液浸泡5min，再用自来水冲洗干净。
4.根据权利要求1所述一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，震荡清洗的摇床振荡转速为90r/min；外植体取材时间为3～5月份。
5.根据权利要求1所述一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，无菌水与无菌容器的灭菌操作均具体为：将无菌水或无菌容器置于121℃下灭菌40min即可。
6.根据权利要求1所述一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法，其特征在于：所述种子萌发培养基、壮苗培养基、生根培养基中的凝固剂均为琼脂粉与卡拉胶的混合物，且琼脂粉与卡拉胶质量比1：1。
7.根据权利要求1所述一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法，其特征在于：所述种子萌发培养基、壮苗培养基、生根培养基的pH值均为5.6～5.8；且种子萌发培养的培养条件为：培养温度为24±3℃，在刚接种时暗培养3～5d，之后在1200～1500lx的光强下培养，光照10h/d；壮苗培养基的培养条件为：培养温度为24±3℃，且于1500～1800lx的关强下培养，光照10h/d；生根培养的培养条件为：培养温度为24±3℃，且于1800～2000lx的关强下培养，光照12h/d。
8.根据权利要求1所述一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，炼苗是在遮光率为70～80％、温度为22～28℃的温室中进行，且闭口15～20d、半敞口3～5d、全敞口2～3d。
9.根据权利要求1所述一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，基质由质量比为2：1的椰壳与树皮混合而成。
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Assignor: CROP Research Institute OF FUJIAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

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Denomination of invention: A method for rapid propagation of tissue culture seedlings of Dendrobium drumstick

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