CN110663549B - 一种石斛兰杂交种子无菌播种育苗方法 - Google Patents

一种石斛兰杂交种子无菌播种育苗方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110663549B
CN110663549B CN201910903549.4A CN201910903549A CN110663549B CN 110663549 B CN110663549 B CN 110663549B CN 201910903549 A CN201910903549 A CN 201910903549A CN 110663549 B CN110663549 B CN 110663549B
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
seedling
culture medium
dendrobium
differentiation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910903549.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110663549A (zh
Inventor
叶秀仙
钟淮钦
林榕燕
罗远华
林兵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CROP Research Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
CROP Research Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CROP Research Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences filed Critical CROP Research Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201910903549.4A priority Critical patent/CN110663549B/zh
Publication of CN110663549A publication Critical patent/CN110663549A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110663549B publication Critical patent/CN110663549B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明提供一种石斛兰杂交种子无菌播种育苗方法，是以石斛兰成熟杂交种子为外植体，通过种子‑原球茎‑芽达到快速育苗的目的，包括以下步骤：种子的选择和消毒、种子萌发与分化同步培养、生根培养及试管苗移栽。采用本发明方法仅需135d至165d就能获得石斛兰杂交种苗；本发明种子萌发与芽分化同步进行，无需分步进行种子萌发及原球茎分化培养，简化了培养环节、极大地缩短了育苗时间、降低了育苗成本，进而提高了育苗效率；另外，本发明培养的试管苗健壮、根系发达，且通过驯化炼苗，其环境适应能力较强，从而提高了种苗移栽成活率，进一步为石斛兰新品种选育提供了物质保障。

Description

一种石斛兰杂交种子无菌播种育苗方法
【技术领域】
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种石斛兰杂交种子无菌播种育苗方法。
【背景技术】
石斛兰为兰科石斛属(Dendrobium)植物的总称，具有极高的观赏价值和药用价值，在花卉市场和药材市场扮演着重要角色。石斛属植物以花色丰富艳丽、花期长而著称，与蝴蝶兰、万代兰、卡特兰并列为观赏价值最高的四大观赏兰类，在我国和国际花卉市场上占有重要的地位。随着国内兰花消费水平的不断提高，对石斛兰新品种的需求不断增加。
目前我国大陆的石斛兰栽培品种主要依靠引进，自育品种极少，滞后的品种和技术创新严重影响了国内石斛兰产业的持续发展。杂交育种是石斛兰最主要的育种手段，通过无菌播种育苗技术，能够在短期内获得大量幼小植株。然而不同杂种胚的萌发差异较大，萌发培养基对种子的萌发率影响较大，当前技术仍存在萌发率低，成苗率低及育苗周期长等问题，直接影响了石斛兰杂交育种效率，导致石斛兰杂交育种进程缓慢。因此急需建立成熟稳定的石斛兰杂交种子无菌播种育苗技术，实现优质、高效地获得石斛兰杂交后代种苗，将为进一步开展石斛兰新品种培育奠定基础，成为从业人员的迫切需要。
为了解决石斛兰种子无菌播种育苗中存在的问题，申请号为CN201510337305.6、名称为“石斛兰快速繁殖成苗的培养基系列及组培方法”的中国专利中，提出了药用石斛以自交种子为外植体，研发出播种培养基、增殖培养基、壮苗培养基以及生根培养基等系列培养基配方，虽然建立了石斛兰快速繁殖成苗组培方法，但是种子萌发、原球茎增殖、壮苗培养、生根培养所能达到的培养效率未提及。另外，申请号为CN201310285055.7、名称为“一种石斛兰试管内杂交育种方法”的中国专利中，提出了石斛兰杂交种子的萌发培养基(组份为每升含花宝1号2～3克、蛋白胨0.5～2克、椰子汁50～100亳升、蔗糖15～30克、MS培养基的维生素成分、活性炭0.5～1克)，先种子萌发形成原球茎，直至形成2～3厘米高的完整的小植株，小植株再作为试管开花诱导材料，培养直至开花，再选择试管内花色、花形正常的不同品种的石斛兰花朵进行杂交授粉，获得杂交种子再进行无菌播种，诱导开花来选育新品种；其虽然公开了石斛兰无菌播种技术，但其萌发率、成苗率尚未提及，公开的技术仅作为一种育种选育手段的参考。
以上文献仅提供了石斛兰自交种子、及杂种胚培养组织培养育苗技术，但均为个例，且操作过程相对繁琐，种子萌发率、原球茎分化率等不理想，石斛兰杂交种子无菌播种育苗技术需进一步建立完善。
由鉴于此，研究或优化，以期得到一种操作过程相对便捷、种子萌发率、原球茎分化率、生根率、移栽成活率均较为理想的石斛兰杂交种子无菌播种快速育苗方法，是从业人员所迫切希望地。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种石斛兰杂交种子无菌播种育苗方法，不仅培养环节简化即操作过程相对便捷，而且种子萌发率高，成苗时间短，且大大提高了培养效率与移栽成活率。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种石斛兰杂交种子无菌播种育苗方法，该方法包括如下具体操作步骤：
(1)种子的选择与消毒：采收成熟、未开裂的石斛兰杂交蒴果，在蒴果移入超净工作台前，先用剪刀剔除柱头、残留的枯瓣；然后用75％酒精喷雾进行表面消毒，之后移入超净工作台进行二次表面消毒，即用75％酒精浸泡过的无菌棉花擦拭蒴果；最后将蒴果放入无菌容器中，再倒入0.1％HgCl2溶液浸泡消毒5～8min，再用无菌水冲洗3～5次，取出备用；
(2)种子萌发与分化同步培养：取步骤(1)消毒过的蒴果，用无菌纸巾擦干表面水分，在无菌接种盘上，将果荚平切打开果皮，露出种子，用镊子直接夹取种子均匀撒播于种子萌发与分化同步培养基表面，接种后放回培养室层架上先进行弱光培养；杂交种子播种10～15d，开始由黄转绿，接种15～20d萌发成原球茎，萌发率达100.0％，随后转入光培养，原球茎逐渐分化出芽，接种45～55d，分化芽大小可达0.5～1.0cm，成苗率95.0～98.5％；此培养过程均在同一培养基中进行，无需更换培养基，即种子萌发与芽分化同步进行；
(3)壮苗培养：将步骤(2)获得的小芽团接种于壮苗培养基中培养，培养30～35d即可获得株高2.0～3.0cm、根长0.2～0.5cm、根数1～2条的健壮小苗；
(4)生根培养：将步骤(3)获得的健壮小苗接种于生根培养基中培养，培养60～75d即获得株高5.0～7.0cm、根长2.0～4.0cm、根数3～5条的完整植株，获得的种苗健壮，且生根率达100.0％；
(5)试管苗移栽：移栽前，将步骤(4)获得的生根苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于1.0～1.5g/L多菌灵或百菌清杀菌剂水溶液中浸泡消毒5～6min，取出晾干，然后用水苔包住根部植入1.5寸育苗杯中，之后置于温室层架上进行常规栽培管理即可；
其中，种子萌发与分化培养基的组分为：花宝1号0.5～1.0g/L、Ca(NO3)2 0.8～1.0g/L、(NH4)2SO40.8～1.0g/L、KH2PO40.25g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O0.005mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、TDZ 0.5～0.8mg/L、6-BA1.5～2.5mg/L、NAA0.1～0.2mg/L、活性炭0.3～0.5g/L、香蕉粉3.0～3.5g/L、水解乳蛋白0.3～0.5g/L、水解酪蛋白0.5～0.8g/L、白糖30.0～35.0g/L、凝固剂6.2～6.6g/L；
壮苗培养基的组分为：花宝2号1.0～1.5g/L、KNO31.0g/L、(NH4)2SO4 0.8g/L、KH2PO40.2g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB1 3.0～5.0mg/L、VB52.0～3.0mg/L、VB6 1.0～2.0mg/L、肌醇150～200mg/L、马铃薯粉1.5～3.0g/L、白糖35.0～40.0g/L、凝固剂6.6～7.2g/L；
生根培养基的组分为：花宝1号1.3～1.8g/L、Ca(NO3)2 0.8～1.0g/L、(NH4)2SO40.6～0.8g/L、KH2PO4 0.1～0.2g/L、MgSO4·7H2O 0.3～0.5g/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB1 1.0mg/L、VB5 1.0～2.0mg/L、VB6 3.0～5.0mg/L、肌醇120～150mg/L、IBA0.3～0.5mg/L、NAA0.2～0.3mg/L、白糖20.0～25.0g/L、活性炭0.6～1.2g/L、香蕉粉2.5～3.5g/L、凝固剂6.6～7.2g/L。
进一步地，所述步骤(1)中，杂交蒴果为杂交授粉后150～240d的蒴果。
进一步地，所述种子萌发与分化培养基、壮苗培养基及生根培养基中的凝固剂均为琼脂粉与卡拉胶的混合物，且琼脂粉与卡拉胶质量比3:1。
进一步地，所述种子萌发与分化培养基、壮苗培养基及生根培养基的pH值均为5.6～5.8；且种子萌发与分化培养、壮苗培养及生根培养的培养温度均为(24±2)℃，种子萌发与分化培养，接种后弱光培养，即为培养室自然散射光培养，之后转入光培养，光强为1800～2000lx，光照10h/d，生根培养的光强为2000～2500lx，光照12h/d。
进一步地，所述步骤(4)中，炼苗是在遮光率为70～80％的温室中进行，且闭口14～21d、半敞口2～3d、全敞口1～2d。
进一步地，所述步骤(5)中，所述试管苗移栽的时间为4～5月份，所述水苔为智利进口水苔，且水苔在使用前需进行自来水浸泡10h以上，取出后再用自来水冲洗3～4次，之后挤干水分即可。
本发明的有益效果在于：
采用本发明方法，仅需135d至165d就能获得石斛兰杂交种苗；本发明种子萌发与芽分化同步进行，无需分步进行种子萌发及原球茎分化培养，简化了培养环节、极大地缩短了育苗时间、降低了育苗成本，进而提高了育苗效率；另外，本发明培养的试管苗健壮、根系发达，且通过驯化炼苗，其环境适应能力较强，从而提高了种苗移栽成活率，2个月移栽成活率达98.3％以上；换而言之，本发明方法克服了现有技术中石斛兰杂交种苗培养操作过程相对较为繁复、种子萌发率低、成苗率低、组培苗抗性差，移栽成活率低的缺陷。进一步为石斛兰新品种选育提供了物质保障。
【具体实施方式】
本发明涉及一种石斛兰杂交种子无菌播种育苗方法，该方法包括如下操作步骤：
(1)种子的选择与消毒：采收成熟、未开裂的石斛兰杂交蒴果，在蒴果移入超净工作台前，先用剪刀剔除柱头、残留的枯瓣；然后用75％酒精喷雾进行表面消毒，之后移入超净工作台进行二次表面消毒，即用75％酒精浸泡过的无菌棉花擦拭蒴果；最后将蒴果放入无菌容器中，再倒入0.1％HgCl2溶液浸泡消毒5～8min，再用无菌水冲洗3～5次，取出备用；
(2)种子萌发与分化同步培养：取步骤(1)消毒过的蒴果，用无菌纸巾擦干表面水分，在无菌接种盘上，将果荚平切打开果皮，露出种子，用镊子直接夹取种子均匀撒播于种子萌发与分化同步培养基表面，接种后放回培养室层架上先进行弱光培养；杂交种子播种10～15d，开始由黄转绿，接种15～20d萌发成原球茎，萌发率达100.0％，随后转入光培养，原球茎逐渐分化出芽，接种45～55d，分化芽大小可达0.5～1.0cm，成苗率95.0～98.5％；此培养过程均在同一培养基中进行，无需更换培养基，即种子萌发与芽分化同步进行；
(3)壮苗培养：将步骤(2)获得的小芽团接种于壮苗培养基中培养，培养30～35d即可获得株高2.0～3.0cm、根长0.2～0.5cm、根数1～2条的健壮小苗；
(4)生根培养：将步骤(3)获得的健壮小苗接种于生根培养基中培养，培养60～75d即获得株高5.0～7.0cm、根长2.0～4.0cm、根数3～5条的完整植株，获得的种苗健壮，且生根率达100.0％。
(5)试管苗移栽：移栽前，将步骤(4)获得的生根苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于1.0～1.5g/L多菌灵或百菌清杀菌剂水溶液中浸泡消毒5～6min，取出晾干，然后用水苔包住根部植入1.5寸育苗杯中，之后置于温室层架上进行常规栽培管理即可；
其中，种子萌发与分化培养基的组分为：花宝1号0.5～1.0g/L、Ca(NO3)20.8～1.0g/L、(NH4)2 SO40.8～1.0g/L、KH2PO4 0.25g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O0.005mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、TDZ 0.5～0.8mg/L、6-BA1.5～2.5mg/L、NAA0.1～0.2mg/L、活性炭0.3～0.5g/L、香蕉粉3.0～3.5g/L、水解乳蛋白0.3～0.5g/L、水解酪蛋白0.5～0.8g/L、白糖30.0～35.0g/L、凝固剂6.2～6.6g/L；
壮苗培养基的组分为：花宝2号1.0～1.5g/L、KNO3 1.0g/L、(NH4)2SO4 0.8g/L、KH2PO40.2g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、VB13.0～5.0mg/L、VB5 2.0～3.0mg/L、VB6 1.0～2.0mg/L、肌醇150～200mg/L、马铃薯粉1.5～3.0g/L、白糖35.0～40.0g/L、凝固剂6.6～7.2g/L；
生根培养基的组分为：花宝1号1.3～1.8g/L、Ca(NO3)20.8～1.0g/L、(NH4)2SO40.6～0.8g/L、KH2PO4 0.1～0.2g/L、MgSO4·7H2O 0.3～0.5g/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB1 1.0mg/L、VB5 1.0～2.0mg/L、VB63.0～5.0mg/L、肌醇120～150mg/L、IBA0.3～0.5mg/L、NAA0.2～0.3mg/L、白糖20.0～25.0g/L、活性炭0.6～1.2g/L、香蕉粉2.5～3.5g/L、凝固剂6.6～7.2g/L。
所述步骤(1)中，杂交蒴果为杂交授粉后150～240d的蒴果。
所述种子萌发与分化培养基、壮苗培养基及生根培养基中的凝固剂均为琼脂粉与卡拉胶的混合物，且琼脂粉与卡拉胶质量比3:1。
所述种子萌发与分化培养基、壮苗培养基及生根培养基的pH值均为5.6～5.8；且种子萌发与分化培养、壮苗培养及生根培养的培养温度均为(24±2)℃，种子萌发与分化培养，接种后弱光培养，即为培养室自然散射光培养，之后转入光培养，光强为1800～2000lx，光照10h/d，生根培养的光强为2000～2500lx，光照12h/d。
较优的，所述步骤(3)中，健壮小苗株高为2.0～2.5cm。
所述步骤(4)中，炼苗是在遮光率为70～80％的温室中进行，且闭口14～21d、半敞口2～3d、全敞口1～2d。
所述步骤(5)中，所述试管苗移栽的时间为4～5月份，所述水苔为智利进口水苔，且水苔在使用前需进行自来水浸泡10h以上，取出后再用自来水冲洗3～4次，之后挤干水分即可。
另外，需要说明的是，本发明中，花宝1号、花宝2号产地美国，其N、P、K质量分别比为7:6:19、20:20:20；化学试剂为分析纯试剂；琼脂粉、卡拉胶产地日本，强度分别为1400g/cm2、1500g/cm2；白糖为市售质量等级一级的袋装白砂糖。
为了对本发明方法进行进一步的阐述说明，申请人给出了如下几个实施例，且这些实施例仅是示例性的，并不用于限制本发明的保护范围。
实施例一
种子的选择与消毒：选择秋石斛‘四面佛’ב水芙蓉’杂交授粉后180d的未开裂蒴果，在蒴果移入超净工作台前，先用剪刀剔除柱头、残留的枯瓣；然后用75％酒精喷雾进行表面消毒，之后移入超净工作台进行二次表面消毒，即用75％酒精浸泡过的无菌棉花擦拭蒴果；最后将蒴果放入无菌容器中，再倒入0.1％HgCl2溶液浸泡消毒5min，再用无菌水冲洗3次，取出备用；
种子萌发与分化同步培养：取上述消毒过的蒴果，用无菌纸巾擦干表面水分，在无菌接种盘上，将果荚平切打开果皮，露出种子，用镊子直接夹取种子均匀撒播于种子萌发与分化同步培养基表面，接种后放回培养室层架上先进行弱光培养；杂交种子播种10～15d，开始由黄转绿，接种18d萌发成原球茎，萌发率达100.0％，随后转入光培养，原球茎逐渐分化出芽，接种50d，分化芽大小可达0.5～0.8cm，成苗率95.0％；培养基组分为：花宝1号0.5g/L、Ca(NO3)2 0.8g/L、(NH4)2SO4 0.8g/L、KH2PO40.25g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、KI0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、TDZ0.5mg/L、6-BA1.5mg/L、NAA0.1mg/L、活性炭0.3g/L、香蕉粉3.0g/L、水解乳蛋白0.3g/L、水解酪蛋白0.5g/L、白糖30.0g/L、凝固剂6.2g/L；
壮苗培养：将上述获得的小芽团接种于壮苗培养基中培养，培养33d即可获得株高2.5～3.0cm、根长0.2～0.5cm、根数1～2条的健壮小苗；培养基的组分为：花宝2号1.0g/L、KNO3 1.0g/L、(NH4)2SO4 0.8g/L、KH2PO4 0.2g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB1 3.0～5.0mg/L、VB5 2.0mg/L、VB61.0mg/L、肌醇150mg/L、马铃薯粉1.5g/L、白糖35.0g/L、凝固剂6.6g/L；
生根培养：将获得的健壮小苗接种于生根培养基中，培养60d即获得株高6.0～7.0cm、根长3.0～4.0cm、根数4～5条的完整植株，获得的种苗健壮，且生根率达100.0％；培养基的组分为：花宝1号1.3g/L、Ca(NO3)2 0.8g/L、(NH4)2SO4 0.6g/L、KH2PO4 0.1g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB1 1.0mg/L、VB51.0mg/L、VB6 3.0mg/L、肌醇120mg/L、IBA0.3mg/L、NAA0.2mg/L、白糖20.0g/L、活性炭0.6g/L、香蕉粉2.5g/L、凝固剂6.6g/L；
试管苗移栽：移栽前，将获得的生根苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于1.0g/L多菌灵水溶液中浸泡消毒5min，取出晾干，然后用水苔包住根部植入1.5寸育苗杯中，2个月移栽成活率达98.5％。
实施例二
种子的选择与消毒：选择铁皮石斛×鼓槌石斛杂交授粉后150d的未开裂蒴果，在蒴果移入超净工作台前，先用剪刀剔除柱头、残留的枯瓣；然后用75％酒精喷雾进行表面消毒，之后移入超净工作台进行二次表面消毒，即用75％酒精浸泡过的无菌棉花擦拭蒴果；最后将蒴果放入无菌容器中，再倒入0.1％HgCl2溶液浸泡消毒5～8min，再用无菌水冲洗4次，取出备用；
种子萌发与分化同步培养：取上述消毒过的蒴果，用无菌纸巾擦干表面水分，在无菌接种盘上，将果荚平切打开果皮，露出种子，用镊子直接夹取种子均匀撒播于种子萌发与分化同步培养基表面，接种后放回培养室层架上先进行弱光培养；杂交种子播种10d，开始由黄转绿，接种15d萌发成原球茎，萌发率达100.0％，随后转入光培养，原球茎逐渐分化出芽，接种45d，分化芽大小可达0.5～0.8cm，成苗率98.5％；培养基组分为：花宝1号0.8g/L、Ca(NO3)20.9g/L、(NH4)2SO4 0.9g/L、KH2PO4 0.25g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O0.005mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、TDZ 0.6mg/L、6-BA2.0mg/L、NAA0.15mg/L、活性炭0.4g/L、香蕉粉3.3g/L、水解乳蛋白0.4g/L、水解酪蛋白0.6g/L、白糖33.0g/L、凝固剂6.4g/L；
壮苗培养：将上述获得的小芽团接种于壮苗培养基中培养，培养30d即可获得株高2.0～2.5cm、根长0.2～0.3cm、根数1～2条的健壮小苗；培养基的组分为：花宝2号1.2g/L、KNO3 1.0g/L、(NH4)2SO4 0.8g/L、KH2PO4 0.2g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB1 4.0mg/L、VB5 2.5mg/L、VB6 1.5mg/L、肌醇180mg/L、马铃薯粉2.0g/L、白糖38.0g/L、凝固剂7.0g/L；
生根培养：将获得的健壮小苗接种于生根培养基中，培养60～75d即获得株高5.0～6.0cm、根长2.0～3.0cm、根数3～4条的完整植株，获得的种苗健壮，且生根率达100.0％；培养基的组分为：花宝1号1.5g/L、Ca(NO3)20.9g/L、(NH4)2SO4 0.7g/L、KH2PO4 0.15g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB1 1.0mg/L、VB5 1.5mg/L、VB6 4.0mg/L、肌醇130mg/L、IBA0.4mg/L、NAA0.25mg/L、白糖23.0g/L、活性炭0.9g/L、香蕉粉3.0g/L、凝固剂7.0g/L；
试管苗移栽：移栽前，将获得的生根苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于1.0g/L多菌灵水溶液中浸泡消毒5min，取出晾干，然后用水苔包住根部植入1.5寸育苗杯中，2个月移栽成活率达99.0％。
实施例三
种子的选择与消毒：选择血喉石斛×红蜻蜓石斛杂交授粉后240d的未开裂蒴果，在蒴果移入超净工作台前，先用剪刀剔除柱头、残留的枯瓣；然后用75％酒精喷雾进行表面消毒，之后移入超净工作台进行二次表面消毒，即用75％酒精浸泡过的无菌棉花擦拭蒴果；最后将蒴果放入无菌容器中，再倒入0.1％HgCl2溶液浸泡消毒8min，再用无菌水冲洗5次，取出备用；
种子萌发与分化同步培养：取上述消毒过的蒴果，用无菌纸巾擦干表面水分，在无菌接种盘上，将果荚平切打开果皮，露出种子，用镊子直接夹取种子均匀撒播于种子萌发与分化同步培养基表面，接种后放回培养室层架上先进行弱光培养；杂交种子播种15d，开始由黄转绿，接种20d萌发成原球茎，萌发率达100.0％，随后转入光培养，原球茎逐渐分化出芽，接种55d，分化芽大小可达0.8～1.0cm，成苗率96.5％；培养基组分为：花宝1号1.0g/L、Ca(NO3)2 1.0g/L、(NH4)2SO4 1.0g/L、KH2PO4 0.25g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O0.005mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、TDZ 0.8mg/L、6-BA2.5mg/L、NAA0.2mg/L、活性炭0.5g/L、香蕉粉3.5g/L、水解乳蛋白0.5g/L、水解酪蛋白0.8g/L、白糖35.0g/L、凝固剂6.6g/L；
壮苗培养：将上述获得的小芽团接种于壮苗培养基中培养，培养35d即可获得株高2.5～3.0cm、根长0.3～0.5cm、根数1～2条的健壮小苗；培养基的组分为：花宝2号1.5g/L、KNO3 1.0g/L、(NH4)2SO4 0.8g/L、KH2PO4 0.2g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB1 5.0mg/L、VB5 3.0mg/L、VB6 2.0mg/L、肌醇200mg/L、马铃薯粉3.0g/L、白糖40.0g/L、凝固剂7.2g/L；
生根培养：将获得的健壮小苗接种于生根培养基中，培养60～75d即获得株高6.5～7.0cm、根长3.0～4.0cm、根数4～5条的完整植株，获得的种苗健壮，且生根率达100.0％；培养基的组分为：花宝1号1.8g/L、Ca(NO3)2 1.0g/L、(NH4)2SO4 0.8g/L、KH2PO4 0.2g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB1 1.0mg/L、VB5 2.0mg/L、VB6 5.0mg/L、肌醇150mg/L、IBA0.5mg/L、NAA0.3mg/L、白糖25.0g/L、活性炭1.2g/L、香蕉粉3.5g/L、凝固剂7.2g/L；
试管苗移栽：移栽前，将获得的生根苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于1.0g/L多菌灵水溶液中浸泡消毒5min，取出晾干，然后用水苔包住根部植入1.5寸育苗杯中，2个月移栽成活率达98.3％。
综上，采用本发明方法，仅需135d至165d就能获得石斛兰杂交种苗；本发明种子萌发与芽分化同步进行，无需分步进行种子萌发及原球茎分化培养，简化了培养环节、极大地缩短了育苗时间、降低了育苗成本，进而提高了育苗效率；另外，本发明培养的试管苗健壮、根系发达，且通过驯化炼苗，其环境适应能力较强，从而提高了种苗移栽成活率，2个月移栽成活率达98.3％以上；换而言之，本发明方法克服了现有技术中石斛兰杂交种苗培养操作过程相对较为繁复、种子萌发率低、成苗率低、组培苗抗性差，移栽成活率低的缺陷。进一步为石斛兰新品种选育提供了物质保障。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (5)

1.一种石斛兰杂交种子无菌播种育苗方法，其特征在于：该方法包括如下操作步骤：
(1)种子的选择与消毒：采收成熟、未开裂的石斛兰杂交蒴果，在蒴果移入超净工作台前，先用剪刀剔除柱头、残留的枯瓣；然后用75％酒精喷雾进行表面消毒，之后移入超净工作台进行二次表面消毒，即用75％酒精浸泡过的无菌棉花擦拭蒴果；最后将蒴果放入无菌容器中，再倒入0.1％HgCl2溶液浸泡消毒5～8min，再用无菌水冲洗3～5次，取出备用；
(2)种子萌发与分化同步培养：取步骤(1)消毒过的蒴果，将果荚平切打开果皮，露出种子，用镊子直接夹取种子均匀撒播于种子萌发与分化同步培养基表面，接种后先进行弱光培养；杂交种子播种10～15d，开始由黄转绿，接种15～20d萌发成原球茎，随后转入光培养，原球茎逐渐分化出芽，接种45～55d，获得小芽团；此培养过程均在同一培养基中进行，无需更换培养基，即种子萌发与芽分化同步进行；
(3)壮苗培养：将步骤(2)获得的小芽团接种于壮苗培养基中培养，培养30～35d即可获得健壮小苗；
(4)生根培养：将步骤(3)获得的健壮小苗接种于生根培养基中培养，培养60～75d即获得生根苗；
(5)试管苗移栽：移栽前，将步骤(4)获得的生根苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后洗苗，洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于1.0～1.5g/L多菌灵或百菌清杀菌剂水溶液中浸泡消毒5～6min，取出晾干，然后用水苔包住根部植入育苗杯中，之后置于温室层架上进行常规栽培管理即可；所述试管苗移栽的时间为4～5月份，所述水苔为智利进口水苔，且水苔在使用前需进行自来水浸泡10h以上，取出后再用自来水冲洗3～4次，之后挤干水分即可；
其中，种子萌发与分化培养基的组分为：花宝1号0.5～1.0g/L、Ca(NO3)20.8～1.0g/L、(NH4)2SO4 0.8～1.0g/L、KH2PO4 0.25g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、H3BO3 6.2 mg/L、MnSO4·H2O8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、TDZ 0.5～0.8mg/L、6-BA 1.5～2.5mg/L、NAA 0.1～0.2mg/L、活性炭0.3～0.5g/L、香蕉粉3.0～3.5g/L、水解乳蛋白0.3～0.5g/L、水解酪蛋白0.5～0.8g/L、白糖30.0～35.0g/L、凝固剂6.2～6.6g/L；
壮苗培养基的组分为：花宝2号1.0～1.5g/L、KNO3 1.0 g/L、(NH4)2SO40.8g/L、KH2PO40.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3 mg/L、VB1 3.0～5.0mg/L、VB5 2.0～3.0mg/L、VB6 1.0～2.0mg/L、肌醇150～200mg/L、马铃薯粉1.5～3.0g/L、白糖35.0～40.0g/L、凝固剂6.6～7.2g/L；
生根培养基的组分为：花宝1号1.3～1.8g/L、Ca(NO3)2 0.8～1.0g/L、(NH4)2SO4 0.6～0.8g/L、KH2PO4 0.1～0.2g/L、MgSO4·7H2O 0.3～0.5g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3 mg/L、VB1 1.0mg/L、VB5 1.0～2.0mg/L、VB6 3.0～5.0mg/L、肌醇120～150mg/L、IBA 0.3～0.5mg/L、NAA 0.2～0.3mg/L、白糖20.0～25.0g/L、活性炭0.6～1.2g/L、香蕉粉2.5～3.5g/L、凝固剂6.6～7.2g/L。
2.根据权利要求1所述一种石斛兰杂交种子无菌播种育苗方法，其特征在于：所述步骤(1)中，杂交蒴果为杂交授粉后150～240d的蒴果。
3.根据权利要求1所述一种石斛兰杂交种子无菌播种育苗方法，其特征在于：所述种子萌发与分化培养基、壮苗培养基及生根培养基中的凝固剂均为琼脂粉与卡拉胶的混合物，且琼脂粉与卡拉胶质量比3:1。
4.根据权利要求1所述一种石斛兰杂交种子无菌播种育苗方法，其特征在于：所述种子萌发与分化培养基、壮苗培养基及生根培养基的pH值均为5.6～5.8；且种子萌发与分化培养、壮苗培养及生根培养的培养温度均为(24±2)℃，种子萌发与分化培养，接种后弱光培养，即为培养室自然散射光培养，之后转入光培养，光强为1800～2000lx，光照10h/d，生根培养的光强为2000～2500lx，光照12h/d。
5.根据权利要求1所述一种石斛兰杂交种子无菌播种育苗方法，其特征在于：所述步骤(4)中，炼苗是在遮光率为70～80％的温室中进行，且闭口14～21d、半敞口2～3d、全敞口1～2d。
CN201910903549.4A 2019-09-24 2019-09-24 一种石斛兰杂交种子无菌播种育苗方法 Active CN110663549B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910903549.4A CN110663549B (zh) 2019-09-24 2019-09-24 一种石斛兰杂交种子无菌播种育苗方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910903549.4A CN110663549B (zh) 2019-09-24 2019-09-24 一种石斛兰杂交种子无菌播种育苗方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110663549A CN110663549A (zh) 2020-01-10
CN110663549B true CN110663549B (zh) 2021-11-23

Family

ID=69078541

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910903549.4A Active CN110663549B (zh) 2019-09-24 2019-09-24 一种石斛兰杂交种子无菌播种育苗方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110663549B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113826549B (zh) * 2021-09-01 2022-06-28 海南大学 一种观赏石斛兰杂交育种方法
CN115005073B (zh) * 2022-06-22 2024-01-09 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 一种基于餐纸巾的秋石斛开放式播种方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102388797A (zh) * 2011-07-21 2012-03-28 玉林市林业科学研究所 铁皮石斛的杂交育种方法
CN105706900A (zh) * 2016-01-26 2016-06-29 福建省农业科学院作物研究所 杂交兰与西藏虎头兰杂交种子无菌播种育苗的方法
CN107466862A (zh) * 2017-09-30 2017-12-15 福建省农业科学院作物研究所 一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法
CN108651280A (zh) * 2018-03-16 2018-10-16 福建省农业科学院作物研究所 一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法
CN110089428A (zh) * 2019-04-10 2019-08-06 福建省农业科学院作物研究所 一种兜兰杂交种子无菌播种育苗方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101268759A (zh) * 2008-04-16 2008-09-24 中国林业科学研究院林业研究所 石斛兰原生种胚培养方法
CN103314861B (zh) * 2013-07-08 2015-09-23 中国科学院华南植物园 一种石斛兰试管内杂交育种方法
CN105028192B (zh) * 2015-06-17 2017-09-29 临沧市云瑞堂生物科技有限公司 石斛兰快速繁殖成苗的培养基系列及组培方法
CN104938338B (zh) * 2015-06-17 2017-09-29 临沧市云瑞堂生物科技有限公司 金钗石斛快速繁殖成苗的培养基系列及组培方法
CN107056414A (zh) * 2017-01-23 2017-08-18 中国林业科学研究院林业研究所 一种广谱性热带兰无菌播种培养基二

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102388797A (zh) * 2011-07-21 2012-03-28 玉林市林业科学研究所 铁皮石斛的杂交育种方法
CN105706900A (zh) * 2016-01-26 2016-06-29 福建省农业科学院作物研究所 杂交兰与西藏虎头兰杂交种子无菌播种育苗的方法
CN107466862A (zh) * 2017-09-30 2017-12-15 福建省农业科学院作物研究所 一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法
CN108651280A (zh) * 2018-03-16 2018-10-16 福建省农业科学院作物研究所 一种文心兰杂交种子无菌播种的育苗方法
CN110089428A (zh) * 2019-04-10 2019-08-06 福建省农业科学院作物研究所 一种兜兰杂交种子无菌播种育苗方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"鼓槌石斛杂交育种及组培育苗技术研究";高燕等;《热带农业科技》;20150115;第38卷(第1期);摘要、第16页第1.2.1-1.2.7节 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110663549A (zh) 2020-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110089428B (zh) 一种兜兰杂交种子无菌播种育苗方法
CN109220793B (zh) 一种蝴蝶兰新品种的选育方法
CN102550405A (zh) 一种杨树单倍体培育方法
CN107155898A (zh) 一种铁皮石斛利用茎段薄片进行扩繁的方法
CN110663549B (zh) 一种石斛兰杂交种子无菌播种育苗方法
CN1255022C (zh) 兜兰的无菌播种和组织培养方法
CN103210842A (zh) 一种铁皮石斛试管开花及结实的方法
CN104642141B (zh) 以根为外植体的非洲菊不定芽诱导和植株再生方法
CN109287487B (zh) 一种大花型兜兰的种子萌发率提高方法与栽培方法
CN107079817A (zh) 兜兰新品种“优优兜兰”组培快繁方法
CN117898209A (zh) 一种色素万寿菊制种过程中快速收集花粉的方法
CN102239801A (zh) 一种兰科植物试管内授粉及结实的方法
CN110663548B (zh) 一种鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.孢子无菌萌发育苗方法
CN106106178A (zh) 一种糖果鸢尾的组织培养方法
CN111134019B (zh) 一种齿叶冬青体细胞胚胎直接发生和植株再生的方法
CN110547196B (zh) 一种通过叶组培快繁空气凤梨种苗的方法
CN110651713B (zh) 一种铁线莲‘富士蓝’的组织培养的方法
CN110402818B (zh) 一种优种板栗成熟胚组织培养快繁育苗的方法
CN111758560A (zh) 一种蝴蝶兰新品种快速育成的方法
CN114532225B (zh) 一种德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法
CN114600772B (zh) 一种深山含笑的组培方法和快速繁殖方法
CN105010123B (zh) 通过离体挽救培养获得草莓远缘杂种的方法及培养基
CN100442971C (zh) 一种牡丹胚状体诱导方法
CN112931197A (zh) 一种菠萝组织培养苗的制备方法
CN115968783A (zh) 一种彩叶大戟的快速繁殖方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20200110

Assignee: SANMING QINGLONG ECOLOGICAL ORCHID CO.,LTD.

Assignor: CROP Research Institute OF FUJIAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

Contract record no.: X2023350000003

Denomination of invention: A method of sterile seeding and seedling raising for hybrid seeds of Dendrobium

Granted publication date: 20211123

License type: Common License

Record date: 20230112