CN101268759A

CN101268759A - 石斛兰原生种胚培养方法

Info

Publication number: CN101268759A
Application number: CNA2008101042203A
Authority: CN
Inventors: 李振坚; 王雁; 缪崑
Original assignee: Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2008-04-16
Filing date: 2008-04-16
Publication date: 2008-09-24

Abstract

本发明公开了一种石斛兰原生种胚培养方法，首先采集种胚已成熟、果荚未开裂的石斛兰蒴果，用70％的乙醇清洗1min～2min，再用10％的次氯酸钙上清液浸泡20min，之后用无菌水冲洗2～4次；然后切开果皮取出种胚；之后将种胚植入已灭菌培养基中培养。可以将种胚浸入无菌水中摇匀，用无菌吸管将所述种胚带水吸出，以微滴形式均匀滴入培养基中，也可以将种胚以粉末状均匀撒在培养基表面。采用无菌培养基对石斛兰的胚无菌播种，胚萌发形成茎和芽，再进行增殖、生根培养最后形成完整植株。本发明操作性强，简单实用，繁殖快、株间差异小、种苗整齐。

Description

石斛兰原生种胚培养方法

技术领域

本发明涉及一种兰科植物的培养方法，尤其涉及一种石斛兰原生种胚培养的方法。

背景技术

石斛兰属(Dendrobium)是兰科(0rchidaceae)植物中，原生种数量仅次于石豆兰属的第二大属，目前已发现有81个种(亚种)。全球分布区域北至印度、缅甸、中国以及日本，南至印度尼西亚、巴布亚新几内亚、澳大利亚和新西兰，马莱群岛和菲律宾群岛。石斛属植物具有较高的药用价值和观赏价值。作为药材的石斛兰，其药用价值有生津、止咳、润喉等功效。作为观赏的石斛兰，既美丽又芳香，是世界著名的花卉。

石斛兰附生于高山岩石和树上，近年来由于森林的破坏、环境变化及大量毁灭性的采收，使得野生石斛兰资源遭到严重破坏，种群数量和分布急剧减少。

石斛兰果实为蒴果，冬春季经过授粉，几个月后果实变为黄绿色，基本成熟。后随着成熟度的增加，种子变为淡黄色，后果皮干裂种子散出。每个果实中含种胚上万至几十万粒，种子胚小，种皮宽大，呈纺锤型。是一团未分化的胚细胞，不含胚乳，只达圆球胚阶段，无子叶、胚根、胚芽，没有贮藏营养物质的组织，极难萌发。

现有技术中主要的石斛兰繁殖手段集中在利用高芽分株和扦插等无性繁殖上。

上述现有技术至少存在以下缺点：对母株的依赖性较强，因母株数量和生长量有限，导致种苗繁殖缓慢、株间差异大、种苗不整齐。

发明内容

本发明的目的是提供一种繁殖快、株间差异小、种苗整齐的石斛兰原生种胚培养方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的石斛兰原生种胚培养方法，包括步骤：

首先，采集种胚已成熟、果荚未开裂的石斛兰蒴果，进行表面消毒处理；

然后，切开果皮取出种胚；

之后，将所述种胚植入已灭菌培养基中培养。

由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明所述的石斛兰原生种胚培养方法，由于首先采集种胚已成熟且果荚未开裂的石斛兰蒴果，进行表面消毒处理后，切开果皮取出种胚；之后，直接将种胚植入已灭菌培养基中培养。繁殖快、株间差异小、种苗整齐。

具体实施方式

本发明的石斛兰原生种胚培养方法，其较佳的具体实施方式是，首先，采集种胚已成熟、果荚未开裂的石斛兰蒴果，进行表面消毒处理；然后，切开果皮取出种胚；之后，将种胚植入已灭菌培养基中培养。

在进行表面消毒处理时，可以先将石斛兰蒴果用70％左右的乙醇擦洗1～2min，再用约10％的次氯酸钙上清液浸泡20min左右，之后用无菌水冲洗2～4次左右。

切开果皮取出种胚后，将种胚植入已灭菌培养基中的方法包括两种：

一种是将种胚浸入无菌水中摇匀，用无菌吸管将所述种胚带水吸出，以微滴形式均匀的滴入所述培养基中；另一种是将种胚以粉末状均匀撒在所述培养基表面。种胚植入的培养基可为N₆培养基。

当种胚植入已灭菌培养基中培养大约3个月后，可生成种胚苗，然后可将种胚苗移入继代培养基中培养。继代培养基为N₆培养基，可在培养基中附加0.2～0.3％的活性炭、1.5～2.5％的蔗糖、0.6～1.0％的琼脂等。

种胚苗移入继代培养基中培养8～10周之后，再移入生根壮苗的培养基中培养6～8周。生根壮苗的培养基为MS+萘乙酸+6-苄基嘌呤0.5mg/L。根据需要也可以选用其它的培养基。

种胚从植入到培养成苗过程中的培养条件为：培养温度25℃～28℃，每日光照10～12小时，光照强度1600～2000勒克斯。

本发明提供的石斛兰原生种胚的无菌胚培养技术可应用于石斛兰原生种、杂交种的种苗生产、保存和育种工作中，下面通过具体实施例对本发明的方法进行详细描述：

石斛兰蒴果在种子成熟未开裂前，蒴果内种子成熟到可相互分离，容易播种，不致播种成块状。另外灭菌容易，只对果实表皮灭菌，萌发也快。蒴果开裂后，粉末状种子灭菌较为困难。切取蒴果注意勿切破果实，防止灭菌的液体渗入果实中，导致果实种子连成块，给播种增加难度。胚培养以不开裂的果荚进行消毒比较容易。

当果实变为黄绿色时，要及时采收，否则易裂果。把种胚已成熟还未开裂的石斛兰蒴果，去除宿存花被、果柄，进行表面消毒。先用70％乙醇擦洗1～2min，再用10％的次氯酸钙上清液浸泡20min后，用无菌水冲洗3次。对种皮消毒后，在无菌超净工作台上，切开果皮，用无菌解剖刀将两端各切1cm，中间段纵向切开。把种子浸入小半瓶无菌水中，摇动使之扩散均匀，用无菌吸管将种子带水吸出，以微滴形式均匀滴入培养基。或直接把粉末状的种子撒入已灭菌培养基，均匀分布于培养基表面。播种胚量不可太多，过多则增加转瓶次数，胚萌发后会出现拥挤，影响生长。

蒴果内胚的成熟度影响胚萌芽率，胚成熟度高则出苗率也高，当圆球胚沿纵轴细胞有大小细胞区别后，就可进行培养。当胚龄在3个月内，萌发率极低，萌发时间长，即使萌发也难形成胚状体成苗。随着胚龄增长，其萌发期逐渐缩短，萌发率逐渐升高，成苗率也逐渐升高。但达一定胚龄后，差异并不明显。种子成熟时(8～10个月)其胚达到最大萌发率、最短萌发期和最高成苗率。胚颜色以金黄色者胚培养效果最佳，果荚内种子胚颜色为金黄色时，播种后发芽率高生长较快。果荚内种子胚颜色为乳黄色和淡黄色的，播种后生长较慢，部分胚变黑、老化死亡。荚果内种子胚的颜色为乳白色和淡白色，播种后生长很慢。

如种子过熟(11个月以上)，则消毒灭菌时容易开裂，胚失落，灭菌不彻底，污染率高。果荚内种子在果荚无虫孔或未开裂时为无菌状态，不需消毒。消毒完成前，果荚不可切破，消毒液进入果荚内，将影响幼嫩种子的发芽率，如用无菌水冲洗则会洗掉种子，种子粘附在果荚上不容易进入培养基。

胚的播种密度影响苗的生长速度。播种以种子相互接触而又不出现堆积为宜。每瓶胚量不能太多。种子肧播种的培养基为N₆培养基，不需要添加外源激素。种肧苗生长的继代培养基为N₆培养基，需要附加活性炭0.25％，蔗糖2％，琼脂0.8％，蔗糖浓度均以20g/L最佳。不需要添加外源激素。无菌播种一周后。胚由金黄色转为淡黄色。这是由于胚吸水膨胀，撑破种皮形成淡黄色胚，然后胚由淡黄色转为绿色，2个月后形成第一个芽鞘。经3个月后，均能萌发。

胚培养的生根壮苗的培养基为MS+萘乙酸1mg/L+6-苄基嘌呤0.5mg/L，附加香蕉汁15％和活性炭0.4％，蔗糖3％，琼脂10g/L，pH5.4。培养条件温度不要超过28℃。各种蔗糖浓度均以20g/L最佳。继代培养基可添加10％的香蕉汁，加速幼苗的生长及促进生根。

胚培养过程中的温度可以为25℃～28℃，每日光照10h～12h(小时)，光照强度1600lx～2000lx(勒克斯)。转接2次即可出苗，出苗时间要掌握在春季为好。

本发明通过石斛兰种子胚培养，可在短期内获得大量幼小植株，可用于杂交育种和原生种的繁殖。具有萌发率高，苗壮、出苗快，种苗品质好等优势。进行授粉与种胚培养，不仅加速种苗的工厂化生产，且可选育出奇特、优质的新品种。

胚培养播种过程中消毒灭菌方式、播种方式、播种密度等操作方式和手段，根据条件和需要可采用不同的手段，皆能获得一定的胚培养效果。石斛兰各个阶段的培养基配方浓度的适当增加或减少，以及相同作用效果的激素成分和种类的改变也可达到胚培养目的。

本方法采用人工培养基对石斛兰的胚无菌播种，胚萌发形成茎和芽，再进行继代、生根培养形成完整植株，通过炼苗获得大量的试管苗。本发明提供石斛兰无菌播种的方法和需要的培养基，可操作性强，简单实用。

本发明把石斛兰种子播种于无菌的培养基上，利用培养基中的养分来促进种子的萌发，解脱了对共生菌的依赖。同时由于石斛兰每个果荚中种子量非常大，单个果荚可培养大批量的播种苗，出苗整齐一致，有利于优良品种和杂种苗的培育和生产。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1、一种石斛兰原生种胚培养方法，其特征在于，包括步骤：

然后，切开果皮取出种胚；

之后，将所述种胚植入已灭菌培养基中培养。

2、根据权利要求1所述的石斛兰原生种胚培养方法，其特征在于，所述的表面消毒处理包括，先将所述石斛兰蒴果用70％的乙醇擦洗1～2min，再用10％的次氯酸钙上清液浸泡20min，之后用无菌水冲洗2～4次。

3、根据权利要求1所述的石斛兰原生种胚培养方法，其特征在于，将所述种胚植入已灭菌培养基中的步骤包括，将所述种胚浸入无菌水中摇匀，用无菌吸管将所述种胚带水吸出，以微滴形式均匀滴入所述培养基中。

4、根据权利要求1所述的石斛兰原生种胚培养方法，其特征在于，将所述种胚植入已灭菌培养基中的步骤包括，将所述种胚以粉末状均匀撒在所述培养基表面。

5、根据权利要求1、3或4所述的石斛兰原生种胚培养方法，其特征在于，所述种胚植入的培养基为N₆培养基。

6、根据权利要求1所述的石斛兰原生种胚培养方法，其特征在于，将所述种胚植入已灭菌培养基中培养3个月后生成种胚苗，然后将所述种胚苗移入继代培养基中培养8～10周。

7、根据权利要求6所述的石斛兰原生种胚培养方法，其特征在于，所述的继代培养基为N₆培养基，所述继代培养基中附加0.2～0.3％的活性炭、1.5～2.5％的蔗糖、0.6～1.0％的琼脂。

8、根据权利要求6所述的石斛兰原生种胚培养方法，其特征在于，所述种胚苗移入继代培养基中培养之后，移入生根壮苗的培养基中培养6～8周。

9、根据权利要求7所述的石斛兰原生种胚培养方法，其特征在于，所述生根壮苗的培养基为MS+萘乙酸1mg/L+6-苄基嘌呤0.5mg/L。

10、根据权利要求1、6或8所述的石斛兰原生种胚培养方法，其特征在于，所述培养包括以下条件：

培养温度25℃～28℃，每日光照10～12小时，光照强度1600～2000勒克斯。