CN105340538B - 棉花生长点染色体加倍的方法 - Google Patents

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张西岭
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殷晓敏
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Abstract

本发明涉及农业种植技术领域，具体公开了一种植株生长点染色体加倍的方法，其包括(1)植株无性繁殖、(2)待加倍生长点预备、(3)待加倍生长点干旱处理、(4)生长点修剪处理、(5)生长点倒立处理、(6)生长点染色体加倍处理、(7)后处理等步骤。本发明通过对远缘杂交F1代植株进行生长点嫁接、壮苗、干旱、修剪、倒立、套管浸泡加倍等整套加倍技术处理，使处理后的生长点更容易接受秋水仙碱的渗透，不仅省时省力，而且植株生长点染色体加倍的效率高，有效节约药物资源，克服了棉花远缘杂交F1代的不育性及因种子稀少珍贵而不能浸种加倍处理的风险问题，染色体加倍后实现了可育性，为棉花等稀有植株的种植提供了依据。

Description

棉花生长点染色体加倍的方法
技术领域
本发明涉及农业种植技术领域，特别涉及一种植株生长点染色体加倍的方法。
背景技术
利用野生棉进行远缘杂交种质创新是棉花遗传育种解决当前遗传资源狭隘的重要途径。而野生棉中绝大多数为二倍体棉种(2n＝2X＝26)，起源于世界的不同区域，互相间存在生物学遗传隔离，一方面远缘杂交不易产生后代，另一方面产生的F1代高度不育。
特别是对一些难得的远缘杂交F1代，因获得种子数量极少，只能通过人工播种并通过无性繁殖的嫁接方式增加植株数量，其不育性往往通过人工对植株生长点染色体加倍后获得可育性。
虽然有报道将秋水仙碱放进试管内，在培养杂种胚的同时进行加倍处理，然而，通过培养基培养各种各样的远缘杂种后代十分困难，而且培养基配方不存在广普性，需要进行耗时耗力耗药的漫长摸索工作，无法适应远缘杂种加倍的大规模推广应用。
另外有报道使用棉球蘸药包裹生长点进行加倍处理，然而，棉球包裹处理法存在不彻底，不够全面，且试剂容易蒸发导致浓度不均等问题而直接影响染色体加倍的效果，尤其是存在大量试剂的浪费，因此，棉球包裹法进行生长点染色体加倍亦存在不足，不适合大量应用。
为此，迫切需要研究棉花生长点染色体加倍技术，以解决了上述问题及因种子稀少珍贵而不能浸种加倍处理的风险问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于，提供一种棉花生长点染色体加倍的方法，解决远缘杂交F1代棉花的不育性及药物浸泡染色体加倍耗时耗力耗药等问题，经过对生长点干旱修剪倒立及套管浸泡等处理使植株的生长点更容易接受秋水仙碱的渗透，染色体加倍更彻底，处理时间短，节省试剂，操作简单，效果显著，打破了远缘杂交F1代棉花的不育性。
本发明为达到上述目的所采用的技术方案是：
一种棉花生长点染色体加倍的方法，其包括将远缘杂交F1代棉花植株经嫁接进行无性繁殖，对所得植株的接穗采用劈接法进行嫁接以获得足量待加倍生长点，对待加倍生长点依次进行干旱、修剪及倒立处理，之后将待加倍生长点置于加倍装置中采用加倍试剂全浸泡进行生长点染色体加倍处理后，用清水喷洗生长点同时对植株浇水，最后进行加倍鉴定。
前述棉花生长点染色体加倍的方法，具体包括如下步骤：
(1)植株无性繁殖：
对准备进行生长点染色体加倍的棉花植株通过嫁接的方式进行无性繁殖，得到植株嫁接苗；
(2)待加倍生长点预备：
对所得植株嫁接苗进行培养管理，选取所得粗壮嫁接活苗的接穗采用劈接法进行嫁接；
(3)待加倍生长点干旱处理：
将茎高大于10cm的粗壮嫁接成活苗进行断水处理，直至粗壮嫁接苗的接穗初现萎蔫时为止；
(4)修剪处理：
对经干旱处理过的全部萎蔫嫁接苗接穗进行顶端生长点修剪，在保留生长点的同时用小剪刀从生长点开始往下部剪除平展叶及叶柄，修剪至有大于30mm光杆为止；
(6)倒立处理：
将用纸箱制成的圆形挡土板剪出一个直径20mm的同心圆后，将修剪处理后的嫁接苗茎杆穿套于所述同心圆内，同时，所述圆形挡土板遮挡住营养土袋口，将营养土袋和嫁接苗一并倒立于四方体框架内，并用方木两侧夹托住所述四方体框架，使嫁接苗生长点倒立；
(6)生长点染色体加倍处理：
将经过干旱、修剪及倒立处理后的嫁接苗生长点用加倍装置套住，该加倍装置内注有0.5wt％秋水仙碱溶液，所述的加倍装置包括圆底离心管及一端绑紧所述离心管盖颈另一端用于缠在其嫁接苗生长点套设入该离心管内的植株茎杆上的毛线，所述的秋水仙碱溶液对所述的嫁接苗生长点完全浸泡6-8小时；
(7)后处理：
卸下所述的加倍装置，并将经过生长点染色体加倍处理后的嫁接苗从所述的四方体框架上卸下，之后将嫁接苗继续置于所述的营养土袋内培养，同时用清水喷洗其生长点，并对嫁接苗浇水打破干旱使其正常生长，生长7天后，喷洒营养液促进新芽长出，之后对长出新芽的嫁接苗植株进行隔离管理，并将非加倍生长点处长出的侧芽摘除，对加倍生长点进行加倍鉴定。
所述的步骤(2)中嫁接苗进行培养管理：将嫁接苗在愈合期置于密闭的农膜遮阳的低矮小拱棚中，间隔通风，并提前对小拱棚喷药除菌除虫，待愈合成活后，移栽到规格为宽14cm、高21cm的大营养袋定植，移栽时砧木全部埋在土中，只留嫁接口及上部接穗部分在土面上，移栽后置遮阳网下生长，加强水肥管理，获得粗壮苗。
所述的步骤(2)中接穗进行嫁接的方法：选第一片真叶平展的粗壮苗为砧木，切取长度为30mm的粗壮顶芽或侧芽生长点为接穗，采用劈接法进行嫁接，其中砧木与接穗嫁接时彼此接触长度为10-15mm，并加强水肥和防病虫害管理，保证生长点粗壮生长。
所述的步骤(5)中倒立处理的具体步骤：用规格为3层的纸箱纸制成直径比营养土袋袋口直径稍大的圆形挡土板，用剪刀沿着半径剪至中心并剪出直径为20mm同心圆，该同心圆用于穿套所述嫁接苗茎杆；之后沿着被剪开的半径掰开所述圆形挡土板轻轻套在嫁接苗上并遮挡住所述营养土袋袋口；之后将嫁接苗与营养土袋一并倒立在1000mm柱高的四方体框架上，并由两根方木夹托，使嫁接苗的生长点朝下倒立。
所述的步骤(6)中秋水仙碱溶液的配制：称取秋水仙碱粉末溶于灭菌的弱碱性水中，得到0.5wt％秋水仙碱溶液，保存在4℃冰箱中备用。
所述的步骤(6)中生长点染色体加倍处理的具体步骤为：用已绑线已注有1.5-1.8ml 0.5％秋水仙碱溶液的2ml圆底离心管套住经过干旱、修剪、倒立处理后的嫁接苗生长点，使秋水仙碱溶液完全浸泡嫁接苗生长点，进行完全浸泡加倍，其中离心管套住生长点时生长点与离心管底部保持10mm，且保持一个管套一个生长点，所述离心管上的绑线一端与离心管固定另一端缠绕在嫁接苗植株茎杆上；该浸泡加倍选在大树底下遮阳的自然环境进行，加倍时间约6-8小时。
所述的步骤(7)后处理中喷洒的营养液为0.4g/L尿素水溶液、0.03g/L磷酸二氢钾水溶液、0.05g/L硫酸镁、0.08g/L淘米水和0.1g/L玉米粉的混合液。
所述的步骤(7)中加倍鉴定包括：对加倍后的生长点处新长出来的枝条、叶片、花朵、果实进行初步形态特异鉴定；并通过对新收获的种子进行根尖制片或新植株花蕾胚珠制片进行镜检，分析染色体加倍情况。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
本发明通过对远缘杂交F1代植株进行生长点嫁接、壮苗、干旱、修剪、倒立、套管浸泡加倍等整套加倍技术处理，使处理后的生长点更容易接受秋水仙碱的渗透，不仅省时省力，而且植株生长点染色体加倍的效率高，有效节约药物资源，克服了棉花远缘杂交F1代的不育性及因种子稀少珍贵而不能浸种加倍处理的风险问题，染色体加倍后实现了可育性，为棉花等稀有植株的种植提供了依据。
上述是发明技术方案的概述，以下结合具体实施方式，对本发明做进一步说明。
具体实施方式：
本实施例提供的棉花生长点染色体加倍的方法，其包括将远缘杂交F1代棉花植株经嫁接进行无性繁殖，对所得植株的接穗采用劈接法进行嫁接以获得足量待加倍生长点，对待加倍生长点依次进行干旱、修剪及倒立处理，之后将待加倍生长点置于加倍装置中采用加倍试剂全浸泡进行生长点染色体加倍处理后，用清水喷洗生长点同时对植株浇水，最后进行加倍鉴定。
前述棉花生长点染色体加倍的方法，具体包括如下步骤：
(1)植株无性繁殖：
对准备进行生长点染色体加倍的棉花植株通过嫁接的方式进行无性繁殖，得到植株嫁接苗。本实施例选取远缘杂交F1代棉花植株这类稀有材料进行无性繁殖，由于可获得的种子数量极少，只能通过人工播种并通过无性繁殖的嫁接方式来增加植株数量，以满足每次嫁接时接穗取材的需要；本实施例选抗病性好的海岛棉7124号饱满大粒种子，在规格为口径80mm、高80mm的装有育苗基质的营养钵中大批量播种以当砧木，营养钵摆在防雨避光的农膜小拱棚中，待出苗10mm高时选下午17点钟揭开农膜炼苗，农膜的使用讲究雨天盖晴天揭，必要时喷施矮壮素如缩节氨，确保砧木矮壮生长，忌讳高细的砧木苗，当砧木苗的第一片真叶平展时则开始嫁接；
(2)待加倍生长点预备：
对所得植株嫁接苗进行培养管理，选取所得粗壮嫁接活苗的接穗采用劈接法进行嫁接；
(3)待加倍生长点干旱处理：
将茎高大于10cm的粗壮嫁接成活苗进行断水处理，直至粗壮嫁接苗的接穗初现萎蔫时为止，目的是为下一步进行生长点药剂侵泡加倍时，提高生长点吸收药剂或药剂渗透生长点的效果进而提高加倍效果；
(4)修剪处理：
对经干旱处理过的全部萎蔫嫁接苗接穗进行顶端生长点修剪，在保留生长点的同时用小剪刀从生长点开始往下部剪除平展叶及叶柄，修剪至有大于30mm光杆为止；
(5)倒立处理：
将用纸箱制成的圆形挡土板剪出一个直径20mm的同心圆后，将修剪处理后的嫁接苗茎杆穿套于所述同心圆内，同时，所述圆形挡土板遮挡住营养土袋口，将营养土袋和嫁接苗一并倒立于四方体框架内，并用方木两侧夹托住所述四方体框架，使嫁接苗生长点倒立；
(6)生长点染色体加倍处理：
将经过干旱、修剪及倒立处理后的嫁接苗生长点用加倍装置套住，该加倍装置内注有0.5wt％秋水仙碱溶液，所述的加倍装置包括圆底离心管及一端绑紧所述离心管盖颈另一端用于缠在其嫁接苗生长点套设入该离心管内的植株茎杆上的毛线，所述的秋水仙碱溶液对所述的嫁接苗生长点完全浸泡6-8小时；
(7)后处理：
加倍完成后，卸下所述的加倍装置中的离心管，扣紧管盖并置冰箱4℃保存以备下次重复使用，并将经过生长点染色体加倍处理后的嫁接苗从所述的四方体框架上卸下，之后将嫁接苗继续置于所述的营养土袋内培养，同时用清水喷洗其生长点，并对嫁接苗浇水打破干旱使其正常生长，生长7天后，喷洒营养液促进新芽长出，之后对长出新芽的嫁接苗植株进行隔离管理，并将非加倍生长点处长出的侧芽摘除，对加倍生长点进行加倍鉴定。
所述的步骤(2)中嫁接苗进行培养管理：将嫁接苗在愈合期置于密闭的农膜遮阳的低矮小拱棚中，间隔通风，并提前对小拱棚喷药除菌除虫，待愈合成活后，移栽到规格为宽14cm、高21cm的大营养袋定植，移栽时砧木全部埋在土中，只留嫁接口及上部接穗部分在土面上，移栽后置遮阳网下生长，加强水肥管理，获得粗壮苗，加强水肥管理促进顶芽茁壮成长，促进侧芽分化增加侧芽数量，同时防病虫害。
所述的步骤(2)中接穗进行嫁接的方法：选第一片真叶平展的粗壮苗为砧木，选砧木时不宜太嫩，嫩了撑不起接穗导致死苗，也不能太老，老了愈合成活存在困难，选粗壮苗当砧木的目的是与粗壮的接穗对称，嫁接后容易愈合成活，并进一步培养粗壮的植株。切取长度为30mm的粗壮顶芽或侧芽生长点为接穗，并加强水肥管理，保证生长点粗壮生长，粗壮的生长点好处在于在进行侵泡加倍过程不易被泡死；采用劈接法进行嫁接，其中砧木与接穗嫁接时彼此接触长度为10-15mm，如过长或过短均会影响愈合成活，并加强水肥和防病虫害管理，保证生长点粗壮生长。
所述的步骤(5)中倒立处理的具体步骤：用规格为3层的纸箱纸制成直径比营养土袋袋口直径稍大的圆形挡土板，用剪刀沿着半径剪至中心并剪出直径为20mm同心圆，该同心圆用于穿套所述嫁接苗茎杆；之后沿着被剪开的半径掰开所述圆形挡土板轻轻套在嫁接苗上并遮挡住所述营养土袋袋口，以防倒立时袋中营养土掉下；之后将嫁接苗与营养土袋一并倒立在1000mm柱高的四方体框架上，并由两根方木夹托，使嫁接苗的生长点朝下倒立，一个所述的四方体框架可摆11根方木，可夹托倒立的至少100株苗同时并进行套管浸泡染色体加倍处理。
所述的步骤(6)中秋水仙碱溶液的配制：称取秋水仙碱粉末溶于灭菌的弱碱性水中，得到0.5wt％秋水仙碱溶液，得到加倍试剂，保存在4℃冰箱中备用。
所述的步骤(6)中生长点染色体加倍处理的具体步骤为：用已绑线已注有1.5-1.8ml 0.5％秋水仙碱溶液的2ml圆底离心管套住经过干旱、修剪、倒立处理后的嫁接苗生长点，使秋水仙碱溶液完全浸泡嫁接苗生长点，进行完全浸泡加倍，其中离心管套住生长点时生长点与离心管底部保持10mm，且保持一个管套一个生长点，所述离心管上的绑线一端与离心管固定另一端缠绕在嫁接苗植株茎杆上，该绑线起到固定离心管位置的作用，以确保离心管不落地，同时确保植株生长点与离心管底部保持10mm距离；该浸泡加倍选在大树底下遮阳的自然环境进行，如遇雨天，则用防雨的塑料布盖住整个加倍架子，天晴后揭开塑料布；加倍时间6-8个小时，因加倍试剂浓度大，且采取完全侵泡处理，因此如果加倍时间过长，生长点将会被泡死或很难长出新芽最终死亡，而如果加倍时间过短，加倍成功的几率极低。
所述的步骤(7)后处理中喷洒的营养液为0.4g/L尿素水溶液、0.03g/L磷酸二氢钾水溶液、0.05g/L硫酸镁、0.08g/L淘米水和0.1g/L玉米粉的混合液。
所述的步骤(7)中加倍鉴定包括：对加倍后的生长点处新长出来的枝条、叶片、花朵、果实进行初步形态特异鉴定；并通过对新收获的种子进行根尖制片或新植株花蕾胚珠制片进行镜检，分析染色体加倍情况。
采用上述方法先后对4个不可育的异源二倍体加倍成为可育的异源四倍体，对3个不可育的异源三倍体加倍成为可育的异源六倍体，具体见表1。以上可育的种质资源对于探索自然界中现有的异源四倍体棉种尤其是陆地棉种的起源问题，并进一步用于育种生产，培育丰产、优质、多抗的优良品种，丰富棉花种质遗传资源提供了具有重要的资源基础。
表1：利用本发明的加倍方法获得的野生棉杂种后代
本发明并不限于上述实施方式，采用与本发明上述实施例相同或近似的结构、材料、方法，而得到的棉花生长点染色体加倍的方法，均在本发明保护范围之内。

Claims (8)

1.一种棉花生长点染色体加倍的方法，其特征在于，包括将远缘杂交F1代棉花植株经嫁接进行无性繁殖，对所得植株的接穗采用劈接法进行嫁接以获得足量待加倍生长点，对待加倍生长点依次进行干旱、修剪及倒立处理，之后将待加倍生长点置于加倍装置中采用加倍试剂全浸泡进行生长点染色体加倍处理后，用清水喷洗生长点同时对植株浇水，最后进行加倍鉴定；
其中，具体包括如下步骤：
(1)植株无性繁殖：
对准备进行生长点染色体加倍的棉花植株通过嫁接的方式进行无性繁殖，得到植株嫁接苗；
(2)待加倍生长点预备：
对所得植株嫁接苗进行培养管理，选取所得粗壮嫁接活苗的接穗采用劈接法进行嫁接；
(3)待加倍生长点干旱处理：
将茎高大于10cm的粗壮嫁接成活苗进行断水处理，直至粗壮嫁接苗的接穗初现萎蔫时为止；
(4)修剪处理：
对经干旱处理过的全部萎蔫嫁接苗接穗进行顶端生长点修剪，在保留生长点的同时用小剪刀从生长点开始往下部剪除平展叶及叶柄，修剪至有大于30mm光杆为止；
(5)倒立处理：
将用纸箱制成的圆形挡土板剪出一个直径20mm的同心圆后，将修剪处理后的嫁接苗茎杆穿套于所述同心圆内，同时，所述圆形挡土板遮挡住营养土袋口，将营养土袋和嫁接苗一并倒立于四方体框架内，并用方木两侧夹托住所述四方体框架，使嫁接苗生长点倒立；
(6)生长点染色体加倍处理：
将经过干旱、修剪及倒立处理后的嫁接苗生长点用加倍装置套住，该加倍装置内注有0.5wt％秋水仙碱溶液，所述的加倍装置包括圆底离心管及一端绑紧所述离心管盖颈另一端用于缠在其嫁接苗生长点套设入该离心管内的植株茎杆上的毛线，所述的秋水仙碱溶液对所述的嫁接苗生长点完全浸泡6-8小时；
(7)后处理：
卸下所述的加倍装置，并将经过生长点染色体加倍处理后的嫁接苗从所述的四方体框架上卸下，之后将嫁接苗继续置于所述的营养土袋内培养，同时用清水喷洗其生长点，并对嫁接苗浇水打破干旱使其正常生长，生长7天后，喷洒营养液促进新芽长出，之后对长出新芽的嫁接苗植株进行隔离管理，并将非加倍生长点处长出的侧芽摘除，对加倍生长点进行加倍鉴定。
2.如权利要求1所述的棉花生长点染色体加倍的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中嫁接苗进行培养管理：将嫁接苗在愈合期置于密闭的农膜遮阳的低矮小拱棚中，间隔通风，并提前对小拱棚喷药除菌除虫，待愈合成活后，移栽到规格为宽14cm、高21cm的大营养袋定植，移栽时砧木全部埋在土中，只留嫁接口及上部接穗部分在土面上，移栽后置遮阳网下生长，加强水肥管理，获得粗壮苗。
3.如权利要求1所述的棉花生长点染色体加倍的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中接穗进行嫁接的方法：选第一片真叶平展的粗壮苗为砧木，切取长度为30mm的粗壮顶芽或侧芽生长点为接穗，采用劈接法进行嫁接，其中砧木与接穗嫁接时彼此接触长度为10-15mm，并加强水肥和防病虫害管理，保证生长点粗壮生长。
4.如权利要求1所述的棉花生长点染色体加倍的方法，其特征在于，所述的步骤(5)中倒立处理的具体步骤：用规格为3层的纸箱纸制成直径比营养土袋袋口直径稍大的圆形挡土板，用剪刀沿着半径剪至中心并剪出直径为20mm同心圆，该同心圆用于穿套所述嫁接苗茎杆；之后沿着被剪开的半径掰开所述圆形挡土板轻轻套在嫁接苗上并遮挡住所述营养土袋袋口；之后将嫁接苗与营养土袋一并倒立在1000mm柱高的四方体框架上，并由两根方木夹托，使嫁接苗的生长点朝下倒立。
5.如权利要求1所述的棉花生长点染色体加倍的方法，其特征在于，所述的步骤(6)中秋水仙碱溶液的配制：称取秋水仙碱粉末溶于灭菌的弱碱性水中，得到0.5wt％秋水仙碱溶液，保存在4℃冰箱中备用。
6.如权利要求1所述的棉花生长点染色体加倍的方法，其特征在于，所述的步骤(6)中生长点染色体加倍处理的具体步骤为：用已绑线已注有1.5-1.8ml0.5％秋水仙碱溶液的2ml圆底离心管套住经过干旱、修剪、倒立处理后的嫁接苗生长点，使秋水仙碱溶液完全浸泡嫁接苗生长点，进行完全浸泡加倍，其中离心管套住生长点时生长点与离心管底部保持10mm，且保持一个管套一个生长点，所述离心管上的绑线一端与离心管固定另一端缠绕在嫁接苗植株茎杆上；该浸泡加倍选在大树底下遮阳的自然环境进行，加倍时间6-8小时。
7.如权利要求1所述的棉花生长点染色体加倍的方法，其特征在于，所述的步骤(7)后处理中喷洒的营养液为0.4g/L尿素水溶液、
0.03g/L磷酸二氢钾水溶液、0.05g/L硫酸镁、0.08g/L淘米水和0.1g/L玉米粉的混合液。
8.如权利要求1所述的棉花生长点染色体加倍的方法，其特征在于，所述的步骤(7)中加倍鉴定包括：对加倍后的生长点处新长出来的枝条、叶片、花朵、果实进行初步形态特异鉴定；并通过对新收获的种子进行根尖制片或新植株花蕾胚珠制片进行镜检，分析染色体加倍情况。
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