CN110651713B

CN110651713B - 一种铁线莲‘富士蓝’的组织培养的方法

Info

Publication number: CN110651713B
Application number: CN201911035023.5A
Authority: CN
Inventors: 高燕; 奉树成; 莫健彬
Original assignee: SHANGHAI BOTANICAL GARDEN
Current assignee: SHANGHAI BOTANICAL GARDEN
Priority date: 2019-10-29
Filing date: 2019-10-29
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2039-10-29
Also published as: CN110651713A

Abstract

本发明提供了一种铁线莲‘富士蓝’的组织培养的方法，包括一个选择材料的步骤；一个对选取的材料进行消毒的步骤；一个对愈伤组织进行诱导的步骤；一个对愈伤组织进行增殖培养的步骤；一个对愈伤组织进行分化培养的步骤；一个芽增殖和壮苗的步骤；一个生根的步骤；一个驯化炼苗的步骤；一个移栽的步骤。本发明通过对愈伤组织诱导、愈伤增殖、愈伤分化、芽增殖、壮苗、生根、炼苗和移栽的过程，达到快速无性繁殖的目的。本发明的方法不受季节限制，可在短时间内生产大量“富士蓝”优质种苗，满足市场需求，为产业化生产带来极大效益。

Description

一种铁线莲‘富士蓝’的组织培养的方法

技术领域

本发明属于植物学领域，涉及一种铁线莲，具体来说是一种铁线莲‘富士蓝’的组织培养的方法。

背景技术

铁线莲属(Clematis)是毛茛科(Ranunculaceae)多年生落叶或常绿木质藤本，少数为宿根直立草本，素有“藤本皇后”之称，花色丰富、花型多变、花期长，可以从早春开到晚秋，极个别品种可冬季开花。铁线莲通过叶柄缠绕和依附攀爬的方式向上生长，在期望拓展城市绿化空间、增加绿量、关注立体绿化的城市，特别大中型城市精致园艺中受到广泛关注，具有很大的观赏价值。

铁线莲属(Clematis)于世界范围分布，有300余种原生种。虽然其中有近一半的原种都出自中国，但国内铁线莲育种工作起步较晚，国内现有的大部分铁线莲品种均来自欧洲。而且由于价格昂贵、品种数量少，极大影响了铁线莲在园林中的应用。

铁线莲‘富士蓝’(附图1)属于早花大花型品种，6～8片的蓝色萼片呈花瓣状，花径10～12cm,单瓣，花丝白色，花药黄色，4～6月首次开花，7～9月可二次开花。铁线莲‘富士蓝’应用形式多样，可做成篱笆，花架，花亭，与针叶树、落叶树以及低矮灌木混植。

目前公开的铁线莲相关专利和文章所述方法在铁线莲‘富士蓝’的组培过程中无法诱导出完整植株，由此，迫切需要开发‘富士蓝’不定芽间接发生技术的方法以扩大其数量，以利于其应用推广。另外，也可作为转基因受体系统用于转基因植株的研究。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种铁线莲‘富士蓝’的组织培养的方法，所述的这种铁线莲‘富士蓝’的组织培养的方法要解决现有技术中铁线莲‘富士蓝’的组培过程中无法诱导出完整植株的技术问题。

本发明提供了一种铁线莲‘富士蓝’的组织培养的方法，包括如下步骤：

1)一个选择材料的步骤，每年的3月下旬到5月，选择健康、无病虫害的茎段的幼嫩部分，截取节间的部位，长度在0.5-1.2cm之间，备用；

2)一个对步骤1)选取的材料进行消毒的步骤，将步骤1)截取的茎段用洗洁精浸泡20～40分钟，然后采用流水冲洗0.5～2小时，再转移到超净工作台中，采用体积百分比浓度为60～80％的酒精浸泡30～60秒，无菌水冲洗1～2次后，再用体积百分比浓度为0.05～0.2％的升汞震荡5～10分钟清洗，随后无菌水冲洗5次以上；

3)一个对愈伤组织进行诱导的步骤，将步骤2)消毒后的材料转移至愈伤组织诱导培养基中，所述的诱导培养基为：1/2改良MS+TDZ 0.1～1mg/L+NAA 0.2～2mg/L，在密闭容器中光培养10～30天，直至材料两侧切口部分产生白色至浅黄色愈伤；

4)一个对步骤3)的愈伤组织进行增殖培养的步骤，取出步骤3)中的愈伤组织，切成长度为0.2～0.6cm的小块，接种于愈伤增殖培养基中，愈伤增殖培养基为：1/2改良MS+6-BA 0.5～2mg/L+NAA 0.2～1mg/L，在密闭容器中暗培养14-20天；

5)一个对步骤4)的愈伤组织进行分化培养的步骤，将步骤4)中的愈伤组织取出，将愈伤组织切成长度为0.5～1.5cm的小块，接种于愈伤分化培养基中，愈伤分化培养基为：1/2改良MS+6-BA 1～3mg/L+NAA 0.01～0.05mg/L，在密闭容器中光培养20～30天；

6)一个芽增殖和壮苗的步骤，将步骤5)培养后的幼苗取出，转至芽增殖和壮苗培养基中，所述的芽增殖和壮苗培养基为：1/2改良MS+6-BA 1～3mg/L+IBA 0.01～0.05mg/L+GA₃ 0.1～0.5mg/L，在密闭容器中光培养20～30天；

7)一个生根的步骤，取出步骤6)壮苗后的幼苗，转移至生根培养基中，所述的生根培养基为1/2MS+IBA 0.1～1mg/L+TDZ0.001～0.005mg/L，在密闭容器中光培养20～40天；

8)一个驯化炼苗的步骤，将步骤7)生根后幼苗的密闭容器的瓶盖打开后放置2～4天后，取出生根苗，清水洗净基部附着培养基，移栽至基质中，所述的基质为珍珠岩；

9)一个移栽的步骤，将步骤8)中的幼苗培育1个月后移栽至含土基质中。

进一步的，所述的含土基质由珍珠岩、草炭和园土组成，所述的珍珠岩、草炭和园土的质量比为2：3：1。

具体的，步骤7)中，MS培养基为市售产品，在此不再赘述。

进一步的，步骤2～5中改良MS的成分如下所述：

改良MS培养基组成成分一览表

进一步的，步骤3～6)中1/2改良MS中，NH₄NO₃、KNO₃、Ca(NO₃)₂·4H₂O、MgSO₄·7H₂0、KH₂PO₄、KCl减半使用，其它用量维持不变；步骤7)中1/2MS，NH₄NO₃、KNO₃、CaCl₂·2H₂O、MgSO₄·7H₂0、KH₂PO₄减半使用，其它用量维持不变。

进一步的，步骤3～6)的培养基中，还添加蔗糖30g/L,琼脂6.9g/L，培养基pH调至5.6～5.9之间。

进一步的，步骤7)的培养基中，还添加蔗糖20g/L,琼脂6.9g/L，培养基pH调至5.6～5.9之间。

进一步的，步骤3、5、6、7的光培养中，温度21～25℃，光照强度为1500～3000Lx，相对湿度为60％～80％。

本发明提供了一种铁线莲‘富士蓝’的组织快繁方法，通过愈伤组织诱导、愈伤增殖、愈伤分化、芽增殖和壮苗、生根、炼苗和移栽过程，达到快速无性繁殖的目的。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的铁线莲‘富士蓝’的组织培养方法不受季节限制，可在短时间内生产大量“富士蓝”优质种苗，满足市场需求，为产业化生产带来极大效益。

附图说明

图1为采用本发明的开花的铁线莲‘富士蓝’。

图2为采用本发明组织培养方法培养的铁线莲初始诱导愈伤组织；

图3为采用本发明组织培养方法培养的愈伤组织分化实物图；

图4为采用本发明组织培养方法培养的芽增殖和壮苗实物图；

图5为采用本发明组织培养方法培养的铁线莲‘富士蓝’的生根实物图；

图6为采用本发明组织培养方法培养的铁线莲‘富士蓝’整株；

图7为采用本发明组织培养方法培养的铁线莲‘富士蓝’的炼苗入珍珠岩后实物图；

图8为采用本发明组织培养方法培养的铁线莲‘富士蓝’的移栽后实物图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。但本发明绝非仅限于此例。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用以解释本发明，并不能因此而解释为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则范围内的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

实施例1

如图1-图8所示，本发明提供一种铁线莲‘富士蓝’的组织培养的方法，利用‘富士蓝’当年生枝条幼嫩顶端作为外植体，依次进行以下步骤：

步骤1：材料选择

3月下旬到5月，选择健康、无病虫害的茎段幼嫩部分，截取节间的部位，0.5-1.2cm长度。

步骤2：材料消毒

采用玻璃瓶装截取的茎段，用洗洁精浸泡30分钟，瓶口蒙纱布后，流水冲洗1小时。转移到超净工作台中，用体积百分比浓度为75％酒精浸泡30秒，用无菌水冲洗1次后，再用体积百分比浓度为0.1％升汞震荡5分钟、8分钟、11分钟清洗，随后无菌水冲洗5次以上，每次2～4分钟，每次接种18个，统计污染率和发芽率。灭菌5分钟，污染率为77.78％，发芽率为5.56％；灭菌8分钟，污染率为5.56％，发芽率为44.44％；灭菌11分钟，污染率为0％，发芽率为11.11％。

步骤3：愈伤诱导

将步骤2的材料转移横放置于愈伤组织诱导培养基。以MS、1/2MS、改良MS、1/2改良MS为基本培养基，添加TDZ 0.5mg/L、NAA 1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.9g/L，调整pH值为5.8。将灭菌后的‘富士蓝’铁线莲接种到上述培养基上，每瓶接种2个茎段，每种培养基8瓶，重复3次，在密闭容器中放置于23℃的2500Lux光照下培养，并于第25天统计诱导率。最早愈伤在第7天长出，材料两侧切口部分开始明显产生淡白色至浅黄色愈伤。到第25天诱导率可达77.08％，如图2所示。

诱导培养基为：1/2改良MS+TDZ 0.5mg/L+NAA 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.9g/L。

步骤4：愈伤增殖培养

取出步骤3中的愈伤组织，切成0.2～0.6cm的小块，接种于愈伤增殖培养基中，在密闭容器中暗培养20天。以1/2改良MS为基本培养基，添加6-BA、NAA的量如表1所示，另外，添加蔗糖30g/L、琼脂6.9g/L，pH调整至5.8。试验重复3次。

表1激素对愈伤增殖的影响

6-BA和NAA组合可以促进‘富士蓝’愈伤增殖。当浓度较低时，愈伤组织增殖速度很慢。当6-BA达到1mg/L，NAA 0.5mg/L时，愈伤增殖达到最大系数3.86倍。当6-BA 1mg/L，NAA为1mg/L时，愈伤增殖系数下降。随着6-BA浓度的增加，达到2mg/L时，愈伤的增殖系数略下降，质地密实，愈伤小突起减少，个别有褐化现象，影响后续增殖和分化。因此，愈伤增殖培养基为：1/2改良MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.9g/L。

步骤5：愈伤分化

取出步骤4中的愈伤组织，切成至长度为0.5～1.5cm的小块，接种于愈伤分化培养基中，在密闭容器中光培养25天。愈伤分化培养基以1/2改良MS为基本培养基，添加6-BA2mg/L、NAA 0.05mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6.9g/L，pH值调整至5.8。愈伤组织经过12天左右开始分化形成芽，叶片数量少且小，颜色嫩绿。

步骤6：芽增殖和壮苗

切取步骤5中幼苗，转至新的培养基，以1/2改良MS为基本培养基，添加6-BA 2mg/L、IBA 0.02mg/L、GA₃ 0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6.9g/L，在密闭容器中光培养25天。一方面用于芽增殖，在此培养基上，经过25天的生长，芽数量可以增长4.176倍，另一方面，可用于壮苗，一个生长周期后，叶片增多变大且转为浓绿色，茎段增粗，如图4所示。

步骤7：生根

取出步骤6中的芽，分成单株，转入生根培养基中，在密闭容器中光培养40天。生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加IBA0.2mg/L，TDZ 0.002mg/L。经过一段时间基部形成少量愈伤，约15天左右开始生根，每株生长1～4条根，如图5。根平均2cm以上可用于后续驯化炼苗。

步骤8：驯化炼苗

在培养间揭开步骤7)中密闭容器的瓶盖，放置3天后，取出生根苗，清水洗净基部附着培养基，移栽至基质中。基质为珍珠岩。如图7所示为生长40天的苗。

步骤9：移栽

步骤8中幼苗经过1个月，移栽至含土基质中。基质质量比为珍珠岩：草炭：园土＝2：3：1。所述基质添加800倍的多菌灵喷洒拌匀。经过2个月生长，可形成如图8所示状态。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

(1)本发明以3-5月‘富士蓝’茎尖带茎节的部分为起始材料，经过愈伤组织分化形成大量‘富士蓝’再生植株。此方法可作为转基因受体系统，为进一步制备转基因植株提供可能。

(2)本发明可以在较短时间内获得大量优质‘富士蓝’种苗，种苗不受季节、时间、地点的限制，可实现常年常态化生产。‘富士蓝’结实率较低，通过种子繁殖的方法获得的植株无法满足现今园林应用对该品种的需求。本发明可迅速形成大规模植株，打破有性繁殖量少的限制。

(3)本发明用间接发生的方式获得愈伤，遇上分化形成芽，后用芽增殖的方式扩繁并壮苗。直接发生和间接发生相结合的方法进一步加快无性繁殖速度。

(4)利用间接培养的方式获得铁线莲完整植株的案例较少。目前仅在个别品种上有实现。由于基因型的差异，不同铁线莲品种间组织培养的差异较大，目前无法获得一种成熟的通用方法。‘富士蓝’组织培养方法可以为更多铁线莲品种的无性繁殖提供指导意义。

Claims

1.一种铁线莲‘富士蓝’的组织培养的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)一个选择材料的步骤，每年的3月下旬到5月，选择健康、无病虫害的茎段的幼嫩部分，截取节间的部位，长度在0.5～1.2cm之间，备用；

2)一个对步骤1)选取的材料进行消毒的步骤，将步骤1)截取的茎段用洗洁精浸泡20～40分钟，然后采用流水冲洗0.5～2小时，再转移到超净工作台中，采用体积百分比浓度为60～80％的酒精浸泡30～60秒，无菌水冲洗1～2次后，再用体积百分比浓度为0.05～0.2％的升汞震荡8分钟清洗，随后无菌水冲洗5次以上；

3)一个对愈伤组织进行诱导的步骤，将步骤2)消毒后的材料转移至愈伤组织诱导培养基中，所述的诱导培养基为：1/2改良MS+TDZ 0.5mg/L+NAA 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.9g/L，pH值调整至5.8，在密闭容器中光培养10～30天，直至材料两侧切口部分产生白色至浅黄色愈伤；

4)一个对步骤3)的愈伤组织进行增殖培养的步骤，取出步骤3)中的愈伤组织，切成长度为0.2～0.6cm的小块，接种于愈伤增殖培养基中，愈伤增殖培养基为：1/2改良MS+6-BA1mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.9g/L，pH值调整至5.8，在密闭容器中暗培养14～20天；

5)一个对步骤4)的愈伤组织进行分化培养的步骤，将步骤4)中的愈伤组织取出，将愈伤组织切成长度为0.5～1.5cm的小块，接种于愈伤分化培养基中，愈伤分化培养基以1/2改良MS为基本培养基，添加6-BA 2mg/L、NAA 0.05mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6.9g/L，pH值调整至5.8，在密闭容器中光培养20～30天；

6)一个芽增殖和壮苗的步骤，将步骤5)培养后的幼苗取出，转至芽增殖和壮苗培养基中，所述的芽增殖和壮苗培养基以1/2改良MS为基本培养基，添加6-BA 2mg/L、IBA 0.02mg/L、GA₃ 0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6.9g/L，pH值调整至5.6～5.9，在密闭容器中光培养20～30天；

7)一个生根的步骤，取出步骤6)壮苗后的幼苗，转移至生根培养基中，所述的生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加IBA0.2 mg/L、TDZ 0.002mg/L、蔗糖20g/L和琼脂6.9g/L，pH值调整至5.6～5.9，在密闭容器中光培养20～40天；

9)一个移栽的步骤，将步骤8)中的幼苗培育1个月后移栽至含土基质中；所述的含土基质由珍珠岩、草炭和园土组成，所述的珍珠岩、草炭和园土的质量比为2：3：1；

步骤3)、5)、6)、7)的光培养中，温度21～25℃，光照强度为1500～3000Lx，相对湿度为60％～80％；

在步骤3～6)中的1/2改良MS培养基中，NH₄NO₃、KNO₃、Ca(NO₃)₂·4H₂O、MgSO₄·7H₂0、KH₂PO₄、KCl是在改良MS培养基的基础上减半使用，其它用量维持不变；在步骤7)的1/2MS培养基中，NH₄NO₃、KNO₃、CaCl₂·2H₂O、MgSO₄·7H₂0、KH₂PO₄是在MS培养基的基础上减半使用，其它用量维持不变；

改良MS培养基由如下浓度的成分组成：