CN108391591B - 一种黄花风铃木组织培养快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种黄花风铃木组织培养快繁方法，具体包括：(1)外植体的选择与消毒；(2)外植体萌发获得无菌试管苗；(3)试管苗快速繁殖培养获得丛生芽；(4)丛生芽壮苗培养获得健壮植株；(5)健壮植株生根培养获得完整带根苗；(6)炼苗与移栽；本发明的繁殖方法和培养基配方进行黄花风铃木组织培养，得到的单芽增殖系数达到5‑10倍，获得的组培苗生根率在95％以上，每株平均带3‑4个根，根长为3‑5厘米，移栽沙床成活率在98％以上；快速、便捷、高效地进行黄花风铃木组织培养，实现木黄花风铃木组培种苗的规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及苗木无性繁殖技术领域，特别涉及一种黄花风铃木组织培养快繁方法。
背景技术
黄花风铃木(Tabebuia chrysantha)为紫葳科风铃木属落叶乔木，原产于墨西哥、中美洲、南美洲。又名毛风铃、毛黄钟花，紫葳科落叶小乔木。风铃木属落叶乔木原产墨西哥、中美洲、南美洲，1997年前中国自南美巴拉圭引进栽种。黄花风铃木四季变化明显，春华、夏实、秋绿、冬枯，赋予季节以色彩。春天风铃状黄花花团锦簇，是春天来临时的指标花卉；夏天萌生的嫩芽满枝桠，接着是翅果纷飞；秋天枝叶繁茂，葱葱郁郁的绿色；冬天枝枯叶落，满是沧桑。该种会随着四季变化而更换风貌的树。黄花风铃木花经3年培育，出圃应用于园林、庭院等绿化。黄花风铃木花色和树形优美，是花卉苗木观赏树种中的上品。可在园林、庭院、公路、风景区的草坪、水塘边作庇荫树或行道树，木树形美观、花色艳丽，生长快，适应性强，是优秀的园林绿化树种，市场供不应求。
黄花风铃木的常规繁殖方式为播种育苗，但其种子寿命极短，很容易丧失活力，需要即采即播，其种子成熟期在4-5月，因此，繁殖受季节性限制，难以满足市场的需求。而通过组织培养的方式进行繁殖，其繁殖速度快，苗木质量好，可达到规模化生产的目的。目前利用组织培养技术繁殖黄花风铃木的研究只有一篇对比文件，即专利申请号为“CN201710170198.1”，专利名称为“一种黄花风铃木组织培养快速繁殖方法”，虽提高了苗木繁殖速度，缩短了繁殖周期，并解决了苗木繁殖受季节性限制问题，但其无菌芽年繁殖系数仅为3.012，尚不够理想，仍有需要改进的空间。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种黄花风铃木组织培养快繁方法，得到的单芽增殖系数达到5-11倍，获得的组培苗生根率在95％以上，每株平均带4-6个根，根长为3-5厘米，移栽沙床成活率在98％以上，能够在短时间内提供健壮的黄花风铃木优质种苗，有效解决黄花风铃木的规模化育苗问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供一种黄花风铃木组织培养快繁方法，具体包括如下步骤：
步骤1、外植体的选择与消毒：取黄花风铃木的种子作为外植体进行消毒；
步骤2、外植体萌发获得无菌试管苗：将消毒后的外植体置于基本培养基中诱导得到无菌试管苗；
步骤3、试管苗快速繁殖培养获得丛生芽：将得到的无菌试管苗置于繁殖培养基中进行试管苗快速繁殖培养获得丛生芽；
步骤4、丛生芽壮苗培养获得健壮植株：将得到的丛生芽置于壮苗培养基中培养得到健壮植株；
步骤5、健壮植株生根培养获得完整带根苗：将得到的健壮植株置于生根培养基中进行生根培养获得完整带根苗；
步骤6、炼苗与移栽：取得到的完整带根苗进行炼苗移植于沙床生长一个月，再移栽到大田；
所述步骤所使用的培养基配方如下：
基本培养基：MS培养基中添加了0.5mg/L的赤霉素GA3、2.0g/L活性炭AC、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
繁殖培养基：WPM培养基中添加了0.5-2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1-0.5mg/L的激动素KT、0.1-0.5mg/L的吲哚丁酸IBA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
壮苗培养基：WPM培养基中添加了0.5-2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1-0.5mg/L的萘乙酸NAA、25-30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
生根培养基：1/2WPM培养基中添加了0.5-1.0mg/L的吲哚丁酸IBA、1.0-2.0mg/L的萘乙酸NAA、25-30g/L蔗糖和3.8-4.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的一种黄花风铃木组织培养快繁方法，得到的单芽增殖系数达到5-10倍，获得的组培苗生根率在95％以上，每株平均带4-6个根，根长为3-5厘米，移栽沙床成活率在98％以上；快速、便捷、高效地进行黄花风铃木组织培养，短时间内培育出大量可供大田栽培的黄花风铃木幼苗，提高了黄花风铃木种苗的繁殖系数和种苗质量，实现木黄花风铃木组培种苗的规模化生产，满足生产上的需要。
2、本发明使用的繁殖培养基为在WPM培养基中添加了0.5-2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA和0.1-0.5mg/L的激动素KT可促进丛生芽的分化；同时添加浓度为0.1-0.5mg/L的生长激素萘乙酸IBA可促进丛生芽的生长；
3、本发明使用的壮苗培养基为在WPM培养基中添加了浓度为0.5-2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA和0.1-0.5mg/L的萘乙酸NAA可促进丛生芽叶片的展开；
4、本发明使用的生根培养基为在1/2WPM培养基中添加了组合使用的浓度为0.5-1.0mg/L的吲哚丁酸IBA和0.5-2.0mg/L的生长素NAA，可获得带根的完整植株，这些植株经炼苗后可直接移栽沙床。
具体实施方式
(一)黄花风铃牙增值培养的繁殖培养基中生长素配比的探索
实施例1
(1)外植体的选择与消毒：取黄花风铃木种子作为外植体，在添加了2-3滴吐温Tween20的100毫升30％84消毒液里灭菌5-8min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；
(2)外植体萌发获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体接种到基本培养基，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10h/d的条件下培养30d得到无菌试管苗，其中基本培养基为在MS培养基中添加了0.5mg/L的赤霉素GA3、2.0g/L活性炭AC、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于繁殖培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10h/d的条件下培养40天得到试管苗丛生芽，其中繁殖培养基为在WPM培养基中添加了1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.4mg/L的激动素KT、0.5mg/L的吲哚丁酸IBA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。其中，1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA的意思为在1L的WPM培养基中添加1.0mg的6-苄基腺嘌呤6-BA，其他物质的添加同理。
(4)丛生芽壮苗培养：将步骤(3)中得到的试管苗丛生芽置于壮苗培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10h/d的条件下培养30d得到健壮植株，其中壮苗培养基为在WPM培养基中添加了2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的NAA、25-30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
(5)健壮植株生根培养：将步骤(3)中得到的健壮植株置于WPM生根培养基中，在培养温度23-26℃，光照强度1400-2000lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养40天得到带根的完整植株，其中1/2WPM生根培养基中添加了1.0mg/L的IBA、2.0mg/L的NAA、25-30g/L蔗糖和3.8-4.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
(6)炼苗与移栽：步骤(5)获得带根的完整植株后，在室温为25°的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到通风良好且弱光的沙土壤中，在沙土壤中生长一个月后移栽大田。移栽后一个星期内，每天早8点到晚6点喷雾3-5次，每次10min，此后每天早8点、晚6点各喷雾1次，每次10min；移栽时的温度条件为20-28℃，相对湿度75-80％，遮阳率为70％。
实施例2
与实施例1不同的是，步骤(3)中试管苗丛生芽快速繁殖培养时，所用的繁殖培养基为在WPM培养基中添加了0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的激动素KT、0.5mg/L的吲哚丁酸IBA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。其他步骤与实施例1中相同。
实施例3
与实施例1不同的是，步骤(3)中试管苗丛生芽快速繁殖培养时，所用的繁殖培养基为在WPM培养基中添加了2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的激动素KT、0.2mg/L的吲哚丁酸IBA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。其他步骤与实施例1中相同。
实施例4
与实施例1不同的是，步骤(3)中试管苗丛生芽快速繁殖培养时，所用的繁殖培养基为在WPM培养基中添加了0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的激动素KT、0.1mg/L的吲哚丁酸IBA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。其他步骤与实施例1中相同。
实施例5
与实施例1不同的是，步骤(3)中试管苗丛生芽快速繁殖培养时，所用的繁殖培养基为在WPM培养基中添加了2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的激动素KT、0.5mg/L的吲哚丁酸IBA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。其他步骤与实施例1中相同。
对比实施例1
与实施例1不同的是，步骤(3)中试管苗丛生芽快速繁殖培养时，所用的繁殖培养基为在WPM培养基，不添加别的成分。其他步骤与实施例1中相同。
以上实施例1-实施例5中均同时至少重复3次，分别观察并计算以上实施例1-实施例5中剑叶龙血树的出芽繁殖倍数(即一个芽接进培养基里它能长出多少个芽来)并统计如下:
表1
由上表1可知，实施例1为最佳实施例，WPM培养基中添加了1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.4mg/L的激动素KT、0.5mg/L的吲哚丁酸IBA，出牙倍数达到了11倍，即一个芽接进培养基里它能长出11个芽来。
(二)壮苗培养基中生长素配比探索
由上可知实施例1出芽率最高，因此分化培养基采用实施例1的配比，现在探索壮苗培养基中生长素配比，设置实施例6-实施例8，其中MS分化培养基均与实施例1相同，不同的是步骤4中所用的壮苗培养基，分为实施例6-实施例8以及对比实施例2，观察不同实施例丛生芽叶片展开情况。
实施例1:壮苗培养基为在WPM培养基中添加了2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的NAA；
实施例6:壮苗培养基为在WPM培养基中添加了2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.3mg/L的NAA；
实施例7:壮苗培养基为在WPM培养基中添加了1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.3mg/L的NAA；
实施例8:壮苗培养基为在WPM培养基中添加了0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的NAA；
对比实施例2：壮苗培养基为WPM培养基。
表2
由上表2可知，壮苗培养基为在培养基中添加了2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的NAA；丛生芽叶片展开情况最好。
(三)生根培养基中生长素配比探索
由上可知实施例1丛生芽叶片展开情况最好，因此生根培养基采用实施例1的配比，现在探索生根培养基中生长素配比，设置实施例9-实施例11，其中MS分化培养基以及壮苗培养基均与实施例1相同，不同的是步骤5中所用的生根培养基，分为实施例1、实施例9、实施例10、实施例11以及对比实施例3，观察并统计不同实施例生根率。
实施例1:1/2WPM生根培养基中添加了1.0mg/L的IBA、2.0mg/L的NAA；
实施例9:1/2WPM生根培养基中添加了1.0mg/L的IBA、1.5mg/L的NAA；
实施例10:1/2WPM生根培养基中添加了0.5mg/L的IBA、0.5mg/L的NAA；
实施例11:1/2WPM生根培养基中添加了0.8mg/L的IBA、1.2mg/L的NAA；
对比实施例3：1/2WPM生根培养基。
表3
由上表2可知，健壮植株生根培养时1/2WPM生根培养基中添加了1.0mg/L的IBA、2.0mg/L的NAA时生根率最高，获得的组培苗生根率在95％以上，在1/2WPM生根培养基上组合使用浓度为0.5-1.0mg/L的吲哚丁酸IBA和0.5-2.0mg/L的生长素NAA，可获得带根的完整植株，这些植株经炼苗后可直接移栽沙床。
(四)移栽情况的比对
下面对实施例1和对比实施例1得到的组培苗进行移栽情况对比。
将两种生根培养基的苗，培养20天后，同时将两种组培苗进行炼苗，获得带根的完整植株后，在室温为25°的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到通风良好且弱光的沙土壤中，在沙土壤中生长一个月后移栽大田。移栽后一个星期内，每天早8点到晚6点喷雾3-5次，每次10min，此后每天早8点、晚6点各喷雾1次，每次10min；移栽时的温度条件为20-28℃，相对湿度75-80％，遮阳率为70％。移栽后，浇透定根水，而后每天早晚各淋水一次，移栽黄花风铃木苗20天后，每隔七天喷施0.1％一0.3％磷酸二氢钾叶面肥，并且定时浇营养液。
每天观察记录，在移栽12天后，采用以下公式调查统计两种组培苗移栽成活率。移栽成活率(％)＝(每处理移栽黄花风铃木组培苗成活株(丛)数/每处理移栽黄花风铃木组培苗总株(丛)数)x100％。
移栽成活率按照黄花风铃木组培苗株高分为两种统计方法进行比较，即移栽前总苗成活率和5cm以上黄花风铃木苗成活率，具体数据详见表4实施例1和对比实施例1的组培苗移栽情况。
表4
通过表4中的数据对比表明，结果表明：实施例1的黄花风铃木组培苗移栽总成活率为98.0％，远远高于传统MS培养移栽成活率26.0％；另外，移栽后返青需要的天数，实施例1的早于对比实施例1的，这充分说明采用本发明的技术方案进行黄花风铃木组织培养，黄花风铃木苗的质量好，根吸收能力较强，移栽后适应环境能力强于传统MS培养，移栽后返青期早，易于成活。
综上所述，采用本发明所述的快速繁殖方法，得到的单芽增殖系数达到5-11倍，获得的组培苗生根率在95％以上，每株平均带3-4个根，根长为3-5厘米，移栽沙床成活率在98％以上；快速、便捷、高效地进行黄花风铃木组织培养，实现木黄花风铃木组培种苗的规模化生产。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种黄花风铃木组织培养快繁方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤1、外植体的选择与消毒：取黄花风铃木的种子作为外植体进行消毒；
步骤2、外植体萌发获得无菌试管苗：将消毒后的外植体置于基本培养基中诱导得到无菌试管苗；
步骤3、试管苗快速繁殖培养获得丛生芽：将得到的无菌试管苗置于繁殖培养基中进行试管苗快速繁殖培养获得丛生芽；
步骤4、丛生芽壮苗培养获得健壮植株：将得到的丛生芽置于壮苗培养基中培养得到健壮植株；
步骤5、健壮植株生根培养获得完整带根苗：将得到的健壮植株置于生根培养基中进行生根培养获得完整带根苗；
步骤6、炼苗与移栽：取得到的完整带根苗进行炼苗移植于沙床生长一个月，再移栽到大田；
所述步骤所使用的培养基配方如下：
基本培养基：MS培养基中添加了0.5mg/L的赤霉素GA3、2.0g/L活性炭AC、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
繁殖培养基：WPM培养基中添加了1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.4mg/L的激动素KT、0.5mg/L的吲哚丁酸IBA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
壮苗培养基：WPM培养基中添加了2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、25-30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
生根培养基：1/2WPM培养基中添加了1.0mg/L的吲哚丁酸IBA、2.0mg/L的萘乙酸NAA、25-30g/L蔗糖和3.8-4.8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
2.如权利要求1所述的黄花风铃木组织培养快繁方法，其特征在于，所述步骤1中，取黄花风铃木种子作为外植体，在添加了2-3滴吐温-20的100毫升30％84消毒液里灭菌5-8min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水。
3.如权利要求1所述的黄花风铃木组织培养快繁方法，其特征在于，所述步骤2中，培养条件为：培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10h/d的条件下培养30天。
4.如权利要求1所述的黄花风铃木组织培养快繁方法，其特征在于，所述步骤3中，培养条件为：培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10h/d的条件下培养40天。
5.如权利要求1所述的黄花风铃木组织培养快繁方法，其特征在于，所述步骤4中，培养条件为：培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10h/d的条件下培养30天。
6.如权利要求1所述的黄花风铃木组织培养快繁方法，其特征在于，所述步骤5中，培养条件为：培养温度23-26℃，光照强度1400-2000lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养8-40天。
7.如权利要求1所述的黄花风铃木组织培养快繁方法，其特征在于，所述步骤6中，将步骤5获得带根的完整植株后，在室温为25℃的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到通风良好且弱光的沙土壤中，在沙土壤中生长一个月后移栽大田。
8.如权利要求7所述的黄花风铃木组织培养快繁方法，其特征在于，移栽时的温度条件为20-28℃，相对湿度75-80％，遮阳率为70％。
9.如权利要求7所述的黄花风铃木组织培养快繁方法，其特征在于，移栽后一个星期内，每天早8点到晚6点喷雾3-5次，每次10min，此后每天早8点、晚6点各喷雾1次，每次10min。
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