CN110089428A - 一种兜兰杂交种子无菌播种育苗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种兜兰杂交种子无菌播种育苗方法，是以兜兰成熟杂交种子为外植体，通过种子‑原球茎‑芽达到快速育苗的目的，包括以下步骤：种子的选择和消毒、种子萌发与分化同步培养、生根培养及试管苗移栽。采用本发明方法仅需8至9个月就能获得兜兰杂交种苗；本发明种子萌发与芽分化同步进行，无需分步进行原球茎分化及壮苗培养，即可进行后续的生根培养，简化了培养环节、极大地缩短了育苗时间、降低了育苗成本，进而提高了育苗效率；另外，本发明培养的试管苗健壮、根系发达，且通过驯化炼苗，其环境适应能力较强，从而提高了种苗移栽成活率，进一步为兜兰新品种选育提供了物质保障。

Description

一种兜兰杂交种子无菌播种育苗方法
【技术领域】
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种兜兰杂交种子无菌播种育苗方法。
【背景技术】
兜兰(Paphiopedilum Pfitzer)为兰科兜兰属植物的统称，属于兰科杓兰亚科(Cypripedioideae)中最为原始，最具特色的类群，全属约有76种，主要分布于亚洲热带地区至太平洋岛屿，生长在热带雨林下，地生或附生。全属均列入《野生动植物濒危物种国际贸易公约(CITES)》I级保护的珍稀濒危物种，同时也是我国一级保护珍稀植物。因其唇瓣呈高度特化的兜状故名兜兰，又因形似拖鞋，故俗称拖鞋兰、仙履兰。因其花型奇特、花色丰富、花期长，观赏价值高，已成为我国重要的盆花种类。随着国内兰花消费水平的不断提高，对兜兰新品种的需求不断增加。
目前我国大陆的兜兰栽培品种主要依靠引进，自育品种极少，滞后的品种和技术创新严重影响了国内兜兰产业的持续发展。杂交育种是兜兰最主要的育种手段，但兜兰杂交种子细小如尘，无胚乳，和大多数兰科植物一样，无法提供种子萌发所必需的养分，这是兜兰属植株难以成苗，面临濒危的一个重要原因。通过无菌播种育苗技术，能够在短期内获得大量幼小植株。然而不同杂种胚的萌发差异较大，萌发培养基对种子的萌发率影响较大，当前技术仍存在萌发率极低，成苗率低等问题，直接影响了兜兰杂交育种效率，导致兜兰杂交育种进程缓慢。因此急需建立成熟稳定的兜兰杂交种子无菌播种育苗技术，实现优质、高效地获得兜兰杂交后代种苗，将为进一步开展兜兰新品种培育奠定基础，成为从业人员的迫切需要。
为了解决兜兰种子无菌播种育苗中存在的问题，申请号为201510732333.8、名称为“一种兜兰种子萌发培养基及培养方法与应用”的中国专利中，提出了红魔帝兜兰自交种子在萌发培养基(组份以1/4MS培养基为基础培养基，并添加纯椰汁100ml/L、活性炭1g/L、蛋白胨0.5g/L；胺鲜酯1～16mg/L)中的萌发率在27.2～90.1％之间；其虽然进行了兜兰种子无菌播种萌发，但后续成苗率、生根培养与移栽成活率未见提及；另外，申请号为201610945605.7、名称为“一种小叶兜兰花与紫毛兜兰杂交种子的组培育苗方法”的中国专利中，提出了小叶兜兰与紫毛兜兰杂交种子萌发培养基、原球茎培养的培养基、生根培养基，未提及种子萌发率、生长周期及移栽成活率等技术指标；申请号为201810067432.2、名称为“一种兜兰新品种培育及组培快繁方法”的中国专利中，提及两种兜兰亲本互杂获得的杂交种子进行无菌播种育苗，其种子萌发率在56～57％之间，移栽成活率在92～93％之间，显而易见，其种子萌发效果还不大理想，且移栽成活率也有待提高。
以上文献仅提供了兜兰自交种子、及杂种胚培养组织培养育苗技术，但均为个例，且操作过程相对繁琐，种子萌发率、原球茎分化率等不理想，兜兰杂交种子无菌播种育苗技术需进一步建立完善。
由鉴于此，研究或优化，以期得到一种操作过程相对便捷、种子萌发率、原球茎分化率、生根率、移栽成活率均较为理想的兜兰杂交种子无菌播种快速育苗方法，是从业人员所迫切希望地。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题，在于提供一种兜兰杂交种子无菌播种育苗方法，不仅培养环节简化即操作过程相对便捷，而且种子萌发率高，成苗时间短，且培养效率与移栽成活率均较为理想。
本发明是这样实现的：
一种兜兰杂交种子无菌播种育苗方法，该方法包括如下具体操作步骤：
(1)种子的选择与消毒：采收成熟、未开裂的兜兰杂交蒴果，蒴果先置于自来水水龙头流水下冲洗1～2min，后用洗洁精溶液浸泡3～5min，再用自来水冲洗干净；然后在超净工作台上，将蒴果放入无菌容器中，先用75％的酒精浸泡30～60s，随后转入0.1％HgCl2溶液浸泡消毒10～12min，再用无菌水冲洗3～4次，取出备用；
(2)种子萌发与分化同步培养：取步骤(1)消毒过的蒴果，用无菌纸巾擦干表面水分，在无菌接种盘上，将果荚平切打开果皮，露出种子，用镊子直接夹取种子均匀撒播于种子萌发与分化同步培养基表面，接种后放回培养室层架上先进行弱光培养；杂交种子播种14～21d开始膨大，播种42～49d形成白色原球茎，萌发率达92.5～95.8％，随后转入光培养，原球茎由白色逐渐转为绿色，并且原球茎逐渐分化出芽，直到播种135～150d，分化芽大小可达1.5～2.0m，且具两片真叶，成苗率达96.3～97.5％；此培养过程均在同一培养基中进行，无需更换培养基，即种子萌发与芽分化同步进行；
(3)生根培养：将步骤(2)获得的健壮小苗接种于生根培养基中，培养周期105～120d即获得株高4.5～5.5cm、叶片数4～5片、根数3～4条、根长3.0～4.0cm的完整植株，获得的种苗健壮，且生根率达100.0％。
(4)试管苗移栽：移栽前，将步骤(3)获得的生根苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于1.0～1.5g/L多菌灵或百菌清杀菌剂水溶液中浸泡消毒5～6min，取出晾干，然后用水苔包住根部植入1.5寸育苗杯中，之后置于温室层架上进行常规栽培管理即可；
其中，种子萌发与分化培养基的组分为：花宝1号1.0～1.5g/L、花宝2号0.3～0.5g/L、(NH4)2SO40.3～0.8g/L、Ca(NO3)20.5～0.8g/L、KH2PO4 0.15～0.25g/L、MgSO4·7H2O0.2～0.5g/L、H3BO310.0mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 3.0mg/L、CuSO4·5H2O0.05mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB15.0～8.0mg/L、肌醇100～150mg/L、噻苯隆0.3～0.5mg/L、6-苄氨基嘌呤1.0～2.0mg/L、激动素0.5～0.8mg/L、萘乙酸0.1～0.2mg/L、活性炭0.2～0.3g/L、水解酪蛋白0.5～1.0g/L、香蕉粉3.5～4.0g/L、白糖35～40g/L、凝固剂6.0～6.5g/L；
生根培养基的组分为：花宝1号1.3～1.8g/L、(NH4)2SO40.5～0.8g/L、KNO30.8～1.0g/L、KH2PO40.2～0.3g/L、MgSO4·7H2O 0.25～0.45g/L、CaCl2·2H2O 0.2～0.3g/L、H3BO310.0mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB65.0～8.0mg/L、肌醇100～120mg/L、白糖20～25g/L、凝固剂6.0～6.5g/L、萘乙酸0.2～0.4mg/L、吲哚丁酸0.3～0.6mg/L、活性炭0.5～1.0g/L、马铃薯粉2.5～3.0g/L、香蕉粉3.5～4.5g/L。
进一步地，所述步骤(1)中，杂交蒴果为杂交授粉后300～330d的蒴果。
进一步地，所述种子萌发与分化培养基、生根培养基中的凝固剂均为琼脂粉与卡拉胶的混合物，且琼脂粉与卡拉胶质量比3：2。
进一步地，所述种子萌发与分化培养基、生根培养基的pH值均为5.6～5.8；且种子萌发与分化培养、生根培养的培养温度均为(25±1)℃，种子萌发与分化培养，接种后弱光培养，即为培养室自然散射光培养，之后转入光培养，光强为1500～1800lx，光照10h/d，生根培养的光强为1800～2000lx，光照12h/d。
进一步地，所述步骤(3)中，健壮小苗株高为1.5～2.0cm。
进一步地，所述步骤(4)中，炼苗是在遮光率为70～80％的温室中进行，且闭口14～21d、半敞口2～3d、全敞口3～4d。
进一步地，所述步骤(4)中，所述试管苗移栽的时间为3～4月份，所述水苔为智利进口水苔，且水苔在使用前需进行自来水浸泡8h以上，取出后再用自来水冲洗2～3次，之后挤干水分即可。
本发明具有如下优点：
采用本发明方法，仅需8至9个月就能获得兜兰杂交种苗；本发明种子萌发与芽分化同步进行，无需分步进行原球茎分化及壮苗培养，即可进行后续的生根培养，简化了培养环节、极大地缩短了育苗时间、降低了育苗成本，且萌发率达92.5～95.8％、成苗率达96.3～97.5％，进而提高了育苗效率；另外，本发明培养的试管苗健壮、根系发达，且通过驯化炼苗，其环境适应能力较强，从而提高了种苗移栽成活率，2个月移栽成活率达95％以上；换而言之，本发明方法克服了现有技术中兜兰杂交种苗培养操作过程相对较为繁复、种子萌发率低、成苗率低、组培苗抗性差，移栽成活率低的缺陷。
【具体实施方式】
本发明涉及一种兜兰杂交种子无菌播种育苗方法，该方法包括如下具体操作步骤：
(1)种子的选择与消毒：采收成熟、未开裂的兜兰杂交蒴果，蒴果先置于自来水水龙头流水下冲洗1～2min，后用洗洁精溶液浸泡3～5min，再用自来水冲洗干净；然后在超净工作台上，将蒴果放入无菌容器中，先用75％的酒精浸泡30～60s，随后转入0.1％HgCl2溶液浸泡消毒10～12min，再用无菌水冲洗3～4次，取出备用；
(2)种子萌发与分化同步培养：取步骤(1)消毒过的蒴果，用无菌纸巾擦干表面水分，在无菌接种盘上，将果荚平切打开果皮，露出种子，用镊子直接夹取种子均匀撒播于种子萌发与分化同步培养基表面，接种后放回培养室层架上先进行弱光培养；杂交种子播种14～21d开始膨大，播种42～49d形成白色原球茎，萌发率达92.5～95.8％，随后转入光培养，原球茎由白色逐渐转为绿色，并且原球茎逐渐分化出芽，直到播种135～150d，分化芽大小可达1.5～2.0m，且具两片真叶，成苗率达96.3～97.5％；此培养过程均在同一培养基中进行，无需更换培养基，即种子萌发与芽分化同步进行；
(3)生根培养：将步骤(2)获得的健壮小苗接种于生根培养基中，培养周期105～120d即获得株高4.5～5.5cm、叶片数4～5片、根数3～4条、根长3.0～4.0cm的完整植株，获得的种苗健壮，且生根率达100.0％。
(4)试管苗移栽：移栽前，将步骤(3)获得的生根苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于1.0～1.5g/L多菌灵或百菌清杀菌剂水溶液中浸泡消毒5～6min，取出晾干，然后用水苔包住根部植入1.5寸育苗杯中，之后置于温室层架上进行常规栽培管理即可；
其中，种子萌发与分化培养基的组分为：花宝1号1.0～1.5g/L、花宝2号0.3～0.5g/L、(NH4)2SO40.3～0.8g/L、Ca(NO3)20.5～0.8g/L、KH2PO4 0.15～0.25g/L、MgSO4·7H2O0.2～0.5g/L、H3BO310.0mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 3.0mg/L、CuSO4·5H2O0.05mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB15.0～8.0mg/L、肌醇100～150mg/L、噻苯隆0.3～0.5mg/L、6-苄氨基嘌呤1.0～2.0mg/L、激动素0.5～0.8mg/L、萘乙酸0.1～0.2mg/L、活性炭0.2～0.3g/L、水解酪蛋白0.5～1.0g/L、香蕉粉3.5～4.0g/L、白糖35～40g/L、凝固剂6.0～6.5g/L；
生根培养基的组分为：花宝1号1.3～1.8g/L、(NH4)2SO40.5～0.8g/L、KNO30.8～1.0g/L、KH2PO40.2～0.3g/L、MgSO4·7H2O 0.25～0.45g/L、CaCl2·2H2O 0.2～0.3g/L、H3BO310.0mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、VB65.0～8.0mg/L、肌醇100～120mg/L、白糖20～25g/L、凝固剂6.0～6.5g/L、萘乙酸0.2～0.4mg/L、吲哚丁酸0.3～0.6mg/L、活性炭0.5～1.0g/L、马铃薯粉2.5～3.0g/L、香蕉粉3.5～4.5g/L。
所述步骤(1)中，杂交蒴果为杂交授粉后300～330d的蒴果。
所述种子萌发与分化培养基、生根培养基中的凝固剂均为琼脂粉与卡拉胶的混合物，且琼脂粉与卡拉胶质量比3：2，可降低成本。
所述种子萌发与分化培养基、生根培养基的pH值均为5.6～5.8；且种子萌发与分化培养、生根培养的培养温度均为(25±1)℃，种子萌发与分化培养，接种后弱光培养，即为培养室自然散射光培养，之后转入光培养，光强为1500～1800lx，光照10h/d，生根培养的光强为1800～2000lx，光照12h/d。
所述步骤(4)中，炼苗是在遮光率为70～80％的温室中进行，且闭口14～21d、半敞口2～3d、全敞口3～4d。
所述步骤(4)中，所述试管苗移栽的时间为3～4月份，能够更有利于移栽种苗的成活。所述水苔为智利进口水苔，且水苔在使用前需进行自来水浸泡8h以上，取出后再用自来水冲洗2～3次，之后挤干水分即可。
另外，需要说明的是，本发明中，花宝1号、花宝2号产地美国，其N、P、K质量分别比为7:6:19、20:20:20；化学试剂为分析纯试剂；琼脂粉、卡拉胶产地日本，强度分别为1400g/cm2、1500g/cm2；白糖为市售质量等级一级的袋装白砂糖。
为了对本发明方法进行进一步的阐述说明，申请人给出了如下几个实施例，且这些实施例仅是示例性的，并不用于限制本发明的保护范围。
实施例一
(1)种子的选择与消毒：选择红魔帝兜兰×条纹帝兜兰杂交授粉后300d的未开裂蒴果，蒴果先置于自来水水龙头流水下冲洗1min，后用洗洁精溶液浸泡3min，再用自来水冲洗干净；然后在超净工作台上，将蒴果放入无菌容器中，先用75％的酒精浸泡30s，随后转入0.1％HgCl2溶液浸泡消毒12min，再用无菌水冲洗3次，取出备用；
(2)种子萌发与分化同步培养：取上述消毒过的蒴果，用无菌纸巾擦干表面水分，在无菌接种盘上，将果荚平切打开果皮，露出种子，用镊子直接夹取种子均匀撒播于种子萌发与分化同步培养基表面，接种后放回培养室层架上先进行弱光培养；播种14d开始膨大，42d形成白色原球茎，萌发率达92.5％，随后转入光培养，原球茎由白色逐渐转为绿色，播种135d，芽大小可达1.5～1.8m，且具两片真叶，成苗率达96.3％；培养基组分为：花宝1号1.0g/L、花宝2号0.3g/L、(NH4)2SO40.3g/L、Ca(NO3)20.5g/L、KH2PO4 0.15g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L、H3BO3 10.0mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 3.0mg/L、CuSO4·5H2O 0.05mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB15.0mg/L、肌醇100mg/L、噻苯隆0.3mg/L、6-苄氨基嘌呤1.0mg/L、激动素0.5mg/L、萘乙酸0.1mg/L、活性炭0.2g/L、水解酪蛋白0.5g/L、香蕉粉3.5g/L、白糖35g/L、凝固剂6.0g/L；培养条件为培养温度(25±1)℃，暗培养为培养室自然散射光，之后转入光培养，光强为1500～1800lx，光照10h/d。生根培养的光强为1800～2000lx，光照12h/d。
(3)生根培养：将获得的健壮小苗接种于生根培养基中，培养周期105d即获得株高4.5～5.5cm、叶片数4～5片、根数3～4条、根长3.0～3.5cm的完整植株，获得的种苗健壮，且生根率达100.0％；生根培养基的组分为：花宝1号1.3g/L、(NH4)2SO40.5g/L、KNO30.8g/L、KH2PO40.2g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2·2H2O 0.2g/L、H3BO310.0mg/L、MnSO4·H2O8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB65.0mg/L、肌醇100mg/L、白糖20g/L、凝固剂6.0g/L、萘乙酸0.2mg/L、吲哚丁酸0.3mg/L、活性炭0.5g/L、马铃薯粉2.5g/L、香蕉粉3.5g/L。
(4)试管苗移栽：移栽前，将获得的生根苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗是在遮光率为70～80％的温室中进行，且闭口14～21d、半敞口2～3d、全敞口3～4d；炼苗完成后用自来水洗苗，洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于1.0g/L多菌灵水溶液中浸泡消毒5min，取出晾干，然后用水苔包住根部植入1.5寸育苗杯中，之后置于温室层架上进行常规栽培管理，2个月移栽成活率达95.8％。
实施例二
(1)种子的选择与消毒：选择绿魔帝兜兰×红魔帝兜兰杂交授粉后310d的未开裂蒴果，蒴果先置于自来水水龙头流水下冲洗2min，后用洗洁精溶液浸泡5min，再用自来水冲洗干净；然后在超净工作台上，将蒴果放入无菌容器中，先用75％的酒精浸泡50s，随后转入0.1％HgCl2溶液浸泡消毒10min，再用无菌水冲洗4次，取出备用；
(2)种子萌发与分化同步培养：取上述消毒过的蒴果，用无菌纸巾擦干表面水分，在无菌接种盘上，将果荚平切打开果皮，露出种子，用镊子直接夹取种子均匀撒播于种子萌发与分化同步培养基表面，接种后放回培养室层架上先进行弱光培养；播种18d开始膨大，45d形成白色原球茎，萌发率达93.6％，随后转入光培养，原球茎由白色逐渐转为绿色，播种140d，芽大小可达1.6～1.9m，且具两片真叶，成苗率达97.0％；培养基组分为：花宝1号1.3g/L、花宝2号0.4g/L、(NH4)2SO40.6g/L、Ca(NO3)20.7g/L、KH2PO4 0.21g/L、MgSO4·7H2O0.3g/L、H3BO310.0mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 3.0mg/L、CuSO4·5H2O 0.05mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB17.5mg/L、肌醇130mg/L、噻苯隆0.4mg/L、6-苄氨基嘌呤1.5mg/L、激动素0.6mg/L、萘乙酸0.1mg/L、活性炭0.2g/L、水解酪蛋白0.8g/L、香蕉粉3.8g/L、白糖38g/L、凝固剂6.3g/L；培养条件为培养温度(25±1)℃，暗培养为培养室自然散射光培养，之后转入光培养，光强为1500～1800lx，光照10h/d。生根培养的光强为1800～2000lx，光照12h/d。
(3)生根培养：将获得的健壮小苗接种于生根培养基中，培养周期110d即获得株高4.5～5.0cm、叶片数4～5片、根数3～4条、根长3.0～4.0cm的完整植株，获得的种苗健壮，且生根率达100.0％；生根培养基的组分为：花宝1号1.5g/L、(NH4)2SO40.7g/L、KNO30.9g/L、KH2PO40.2g/L、MgSO4·7H2O 0.35g/L、CaCl2·2H2O 0.2g/L、H3BO310.0mg/L、MnSO4·H2O8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB67.0mg/L、肌醇110mg/L、白糖23g/L、凝固剂6.3g/L、萘乙酸0.3mg/L、吲哚丁酸0.5mg/L、活性炭0.8g/L、马铃薯粉2.8g/L、香蕉粉4.0g/L。
试管苗移栽：移栽前，将获得的生根苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗是在遮光率为70～80％的温室中进行，且闭口14～21d、半敞口2～3d、全敞口3～4d，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于1.5g/L多菌灵水溶液中浸泡消毒5min，取出晾干，然后用水苔包住根部植入1.5寸育苗杯中，之后置于温室层架上进行常规栽培管理，2个月移栽成活率达96.5％。
实施例三
(1)种子的选择与消毒：选择绿魔帝兜兰×条纹帝兜兰杂交授粉后330d的未开裂蒴果，蒴果先置于自来水水龙头流水下冲洗2min，后用洗洁精溶液浸泡5min，再用自来水冲洗干净；然后在超净工作台上，将蒴果放入无菌容器中，先用75％的酒精浸泡60s，随后转入0.1％HgCl2溶液浸泡消毒11min，再用无菌水冲洗4次，取出备用；
(2)种子萌发与分化同步培养：取上述消毒过的蒴果，用无菌纸巾擦干表面水分，在无菌接种盘上，将果荚平切打开果皮，露出种子，用镊子直接夹取种子均匀撒播于种子萌发与分化同步培养基表面，接种后放回培养室层架上先进行弱光培养；播种21d开始膨大，49d形成白色原球茎，萌发率达95.8％，随后转入光培养，原球茎由白色逐渐转为绿色，播种150d，芽大小可达1.5～2.0m，且具两片真叶，成苗率达97.5％；培养基组分为：花宝1号11.5g/L、花宝2号0.5g/L、(NH4)2SO40.8g/L、Ca(NO3)20.8g/L、KH2PO40.25g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、H3BO310.0mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 3.0mg/L、CuSO4·5H2O 0.05mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB18.0mg/L、肌醇150mg/L、噻苯隆0.5mg/L、6-苄氨基嘌呤2.0mg/L、激动素0.8mg/L、萘乙酸0.2mg/L、活性炭0.3g/L、水解酪蛋白1.0g/L、香蕉粉4.0g/L、白糖40g/L、凝固剂6.5g/L；培养条件为培养温度(25±1)℃，暗培养为培养室自然散射光，之后转入光培养，光强为1500～1800lx，光照10h/d。生根培养的光强为1800～2000lx，光照12h/d。
(3)生根培养：将获得的健壮小苗接种于生根培养基中，培养周期120d即获得株高5.0～6.0cm、叶片数4～5片、根数3～4条、根长3.5～4.0cm的完整植株，获得的种苗健壮，且生根率达100.0％；生根培养基的组分为：花宝1号1.8g/L、(NH4)2SO40.8g/L、KNO31.0g/L、KH2PO40.3g/L、MgSO4·7H2O 0.45g/L、CaCl2·2H2O 0.3g/L、H3BO310.0mg/L、MnSO4·H2O8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、VB68.0mg/L、肌醇120mg/L、白糖25g/L、凝固剂6.5g/L、萘乙酸0.4mg/L、吲哚丁酸0.6mg/L、活性炭1.0g/L、马铃薯粉3.0g/L、香蕉粉4.5g/L。
(4)试管苗移栽：移栽前，将获得的生根苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗是在遮光率为70～80％的温室中进行，且闭口14～21d、半敞口2～3d、全敞口3～4d，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于1.3g/L百菌清水溶液中浸泡消毒5min，取出晾干，然后用水苔包住根部植入1.5寸育苗杯中，之后置于温室层架上进行常规栽培管理，2个月移栽成活率达97.5％。
采用本发明方法，仅需8至9个月就能获得兜兰杂交种苗；本发明种子萌发与芽分化同步进行，无需分步进行原球茎分化及壮苗培养，即可进行后续的生根培养，简化了培养环节、极大地缩短了育苗时间、降低了育苗成本，且萌发率达92.5～95.8％、成苗率达96.3～97.5％，进而提高了育苗效率；另外，本发明培养的试管苗健壮、根系发达，且通过驯化炼苗，其环境适应能力较强，从而提高了种苗移栽成活率，2个月移栽成活率达95％以上；换而言之，本发明方法克服了现有技术中兜兰杂交种苗培养操作过程相对较为繁复、种子萌发率低、成苗率低、组培苗抗性差，移栽成活率低的缺陷。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (7)

1.一种兜兰杂交种子无菌播种育苗方法，其特征在于：该方法包括如下操作步骤：
(1)种子的选择与消毒：采收成熟、未开裂的兜兰杂交蒴果，蒴果先置于流动自来水下冲洗1～2min，后用洗洁精溶液浸泡3～5min，再用自来水冲洗干净；然后在超净工作台上，将蒴果放入无菌容器中，先用75％的酒精浸泡30～60s，随后转入0.1％HgCl2溶液浸泡消毒10～12min，再用无菌水冲洗3～4次，取出备用；
(2)种子萌发与分化同步培养：取步骤(1)消毒过的蒴果，用无菌纸巾擦干表面水分，在无菌接种盘上，将果荚平切打开果皮，露出种子，用镊子直接夹取种子均匀撒播于种子萌发与分化同步培养基表面，接种后放回培养室层架上先进行弱光培养；杂交种子播种14～21d开始膨大，播种42～49d形成白色原球茎，随后转入光培养，原球茎由白色逐渐转为绿色，并且原球茎逐渐分化出芽，直到播种135～150d，即得小苗；此培养过程均在同一培养基中进行，无需更换培养基，即种子萌发与芽分化同步进行；
(3)生根培养：将步骤(2)获得的健壮小苗接种于生根培养基中，培养周期105～120d即获得完整植株；
(4)试管苗移栽：移栽前，将步骤(3)获得的生根苗进行炼苗至适应栽培环境，炼苗完成后用自来水洗苗，洗净根部粘连的培养基，之后将苗置于1.0～1.5g/L多菌灵或百菌清杀菌剂水溶液中浸泡消毒5～6min，取出晾干，然后用水苔包住根部植入育苗杯中，之后置于温室层架上进行常规栽培管理即可；
其中，种子萌发与分化培养基的组分为：花宝1号1.0～1.5g/L、花宝2号0.3～0.5g/L、(NH4)2SO4 0.3～0.8g/L、Ca(NO3)2 0.5～0.8g/L、KH2PO40.15～0.25g/L、MgSO4·7H2O 0.2～0.5g/L、H3BO3 10.0mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 3.0mg/L、CuSO4·5H2O 0.05mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、VB1 5.0～8.0mg/L、肌醇100～150mg/L、噻苯隆0.3～0.5mg/L、6-苄氨基嘌呤1.0～2.0mg/L、激动素0.5～0.8mg/L、萘乙酸0.1～0.2mg/L、活性炭0.2～0.3g/L、水解酪蛋白0.5～1.0g/L、香蕉粉3.5～4.0g/L、白糖35～40g/L、凝固剂6.0～6.5g/L；
生根培养基的组分为：花宝1号1.3～1.8g/L、(NH4)2SO4 0.5～0.8g/L、KNO3 0.8～1.0g/L、KH2PO4 0.2～0.3g/L、MgSO4·7H2O 0.25～0.45g/L、CaCl2·2H2O 0.2～0.3g/L、H3BO310.0mg/L、MnSO4·H2O 8.5mg/L、ZnSO4·7H2O 2.88mg/L、CuSO4·5H2O 0.005mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、VB6 5.0～8.0mg/L、肌醇100～120mg/L、白糖20～25g/L、凝固剂6.0～6.5g/L、萘乙酸0.2～0.4mg/L、吲哚丁酸0.3～0.6mg/L、活性炭0.5～1.0g/L、马铃薯粉2.5～3.0g/L、香蕉粉3.5～4.5g/L。
2.根据权利要求1所述一种兜兰杂交种子无菌播种育苗方法，其特征在于：所述步骤(1)中，杂交蒴果为杂交授粉后300～330d的蒴果。
3.根据权利要求1所述一种兜兰杂交种子无菌播种育苗方法，其特征在于：所述种子萌发与分化培养基、生根培养基中的凝固剂均为琼脂粉与卡拉胶的混合物，且琼脂粉与卡拉胶质量比为3：2。
4.根据权利要求1所述一种兜兰杂交种子无菌播种育苗方法，其特征在于：所述种子萌发与分化培养基、生根培养基的pH值均为5.6～5.8；且种子萌发与分化培养、生根培养的培养温度均为(25±1)℃，种子萌发与分化培养，接种后弱光培养，即为培养室自然散射光培养，之后转入光培养，光强为1500～1800lx，光照10h/d，生根培养的光强为1800～2000lx，光照12h/d。
5.根据权利要求1所述一种兜兰杂交种子无菌播种育苗方法，其特征在于：所述步骤(3)中，健壮小苗株高为1.5～2.0cm。
6.根据权利要求1所述一种兜兰杂交种子无菌播种育苗方法，其特征在于：所述步骤(4)中，炼苗是在遮光率为70～80％的温室中进行，且闭口14～21d、半敞口2～3d、全敞口3～4d。
7.根据权利要求1所述一种兜兰杂交种子无菌播种育苗方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述试管苗移栽的时间为3～4月份，所述水苔为智利进口水苔，且水苔在使用前需进行自来水浸泡8h以上，取出后再用自来水冲洗2～3次，之后挤干水分即可。
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