CN116369197B - 一种紫纹兜兰优质种苗的繁育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种紫纹兜兰优质种苗的繁育方法。该方法以生长健壮的不同生态型的紫纹兜兰进行杂交获得合适胚龄的种子配制成悬浮液在独特的培养基上进行无菌播种，再利用独特的培养基继代培养一次培养成苗，能在短时间内生产出大量的种苗供应市场并应用于迁地保护、自然回归和市场销售，有利于紫纹兜兰的资源保护和可持续利用。
Description
技术领域
本发明属于植物栽培技术领域，具体涉及一种紫纹兜兰优质种苗的繁育方法。
背景技术
紫纹兜兰(Paphiopedilum purpuratum)，分布于我国广东、香港、广西和云南东等地，越南也有分布，观赏价值高。由于其生境的破坏和人工的过度采挖，其野生植物数量已非常稀少，被《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)列入附录I而禁止交易，也被世界自然保护联盟(IUCN)红色名录中列为极危物种(CR)亟待保护。进行紫纹兜兰的资源保护，繁殖足够多的种苗是关键。紫纹兜兰的常规繁殖可采用分株，但繁殖速度慢，繁殖率低；而在野外自然状态下，紫纹兜兰结实率低，即使结果种子无菌播种时萌发率也较低，特别是繁殖出来的种苗生长势差，移栽成活率低，后期栽培难度大，栽培过程中死亡率高。目前，世界上还没有利用不同生态型的紫纹兜兰杂交获得种子进行无菌播种后再经1次培养获得优质种苗的快速繁殖的研究论文报道和专利申请。
发明内容
本发明的目的在于提供一种紫纹兜兰优质种苗的繁育方法。本发明利用不同生态型的紫纹兜兰杂交获得种子无菌播种进行优质种苗快速繁殖，从而进行紫纹兜兰优质种苗的的规模化生产。
本发明提供的一种紫纹兜兰优质种苗的繁育方法，具体包括以下步骤：
(1)外植体选择：以不同生态型紫纹兜兰杂交获得果实作为外植体；
(2)外植体消毒和无菌播种：将外植体消毒后，取出种子，将种子制成悬浮液后播种于种子萌发培养基中，所述的种子萌发培养基为1/4MS培养基+50-100mL/L椰子汁+0.1-0.3mg/L萘乙酸+15-25g/L蔗糖+0.3-0.5g/L活性炭+5.5-6.5g/L琼脂，pH 5.8-6.0，在培养温度25-30℃，光照度800-1200lux，光照12-16小时/天的条件下培养；
(3)生根壮苗培养：将1-1.5cm高的小苗接种到生根壮苗培养基中，所述的生根壮苗培养基为：每升含花宝1号1～2g+花宝2号1～2g+B5培养基中的维生素和肌醇成分+1.0-2.0mg萘乙酸+100-200mL椰子汁+1-2g蛋白胨+50-100g香蕉匀浆+20-30g土豆匀浆+1.0-2.0g活性炭+40-60g蔗糖+5.5-6.5g/L琼脂，溶剂为水，pH 5.8-6.0，在培养温度25-30℃，光照度1500-2000lux，光照12-16小时/天的条件下培养；
(4)试管苗移栽和栽培管理：将3-5cm高的完整植株从培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗10-15天，然后取出试管苗，洗净根部的培养基，种植于栽培基质中，进行肥水管理。
优选的，所述的所述的外植体消毒，具体步骤为：将果实先用75％的酒精浸泡30-60秒，然后在质量分数0.1-0.2％的升汞溶液中消毒10-20分钟，最后用无菌水漂洗4-5次。
优选的，所述的将种子播种于种子萌发培养基中，具体步骤为：取5毫升种子悬液播种于100亳升种子萌发培养基中；所述的种子悬液每毫升中含有100-200粒种子。
优选的，所述的种植于栽培基质中，进行肥水管理，具体步骤为：将试管苗洗净根部的培养基，种植于由小号的植金石和小号松树皮按体积比2:1进行配制的栽培基质中，每周喷施水溶性平衡肥花多多1号通用肥3000-4000倍液1次并进行正常的管理；一年后种植于由中号的植金石和中号松树皮按体积比2:1进行配制的栽培基质中，每周喷施水溶性平衡肥花多多1号通用肥2000-3000倍液1次，1年后，每周喷施水溶性平衡肥花多多215号高磷肥2000-3000倍液1次，再种植半年能开花。
优选的，所述的果实为授粉后240-300天基本成熟的果实。
本发明方法以来源于广东阳春和广西不同生态型的紫纹兜兰生长健壮的开花植株进行杂交，获得合适胚龄的种子在独特的培养基上进行无菌播种，并只继代培养1次就能在短时间内即可能生产出大量的种苗供应市场并应用于迁地保护和自然回归，有利于紫纹兜兰的资源保护和可持续利用。
附图说明
图1为不同生态型紫纹兜兰杂交种子无菌播种种子萌发情况。
图2为利用独特的培养基进行不同生态型紫纹兜兰继代后一次成苗。
图3为来源于不同生态型杂交的紫纹兜兰优质种苗生长情况。
图4为来源于不同生态型杂交的紫纹兜兰优质种苗栽培后的开花群体图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
(1)利用不同生态型紫纹兜兰杂交获得果实
以华南植物园迁地保护温室中引种保育的、来源于广东阳春和广西上思十万大山的生长健壮的紫纹兜兰母株进行自花、同一生态型及不同生态型的异花授粉。授粉时间选择在花朵完成展开后的2天。授粉时去掉花朵的唇瓣便于操作，操作时采用消毒的牙签挑取花粉粒粘在另一株花的柱头上，随后挂牌记录授粉日期。同一生态型中紫纹兜兰自花或异花人工授粉成功率为70％，不同生态型的异花授粉率为85％。然后选择授粉后240天基本成熟的果实用作实验材料。
(2)外植体消毒和无菌播种
将果实先用75％的酒精浸泡30秒后，再在质量分数0.1％的升汞溶液中消毒20分钟，用无菌水漂洗4次后切开果实，将粉末状种子放入100毫升的无菌水中用玻璃棒搅匀制成悬浮液，每毫升中约有200粒种子。然后每盆用移液管取5毫升悬浮液无菌播种到装有100亳升种子萌发培养基的兰花瓶中，种子萌发培养基为：1/4MS培养基+50mL/L椰子汁+0.1mg/L萘乙酸(NAA)+15g/L蔗糖+0.3g/L活性炭(AC)+6.5g/L琼脂，pH 5.8-6.0。在培养温度25-30℃，光照度800-1200lux，光照12-16小时/天的条件下培养。40天左右种子萌发，同一生态型自交或异交种子的萌发率为60％，不同生态型杂交的种子的萌发率90％。不同生态型紫纹兜兰杂交种子无菌播种种子萌发情况见图1。
(3)生根壮苗培养
播种培养3个月后将1-1.5cm高的小苗接种到生根壮苗培养基中，生根壮苗培养基为：每升含花宝1号1g+花宝2号2g+B5培养基中的维生素和肌醇成分+1.0mg萘乙酸(NAA)+100mL椰子汁+1g蛋白胨+50g香蕉匀浆+30g土豆匀浆+1.0g活性炭(AC)+40g蔗糖+6.5g琼脂，溶剂为水，pH 5.8-6.0。在培养温度25-30℃，光照度1500-2000lux，光照12-16小时/天的条件下培养，培养6个月能形成株高4cm高的完整植株。培养时采用标准兰花培养瓶，每瓶25株。不同生态型紫纹兜兰继代后一次成苗见图2。
(4)试管苗移栽和栽培管理
将具3-5cm高完整植株从培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗10天，然后取出试管苗，洗净根部的培养基，单株种植于一个1.7寸白色塑料杯中。栽培基质为小号的植金石(日本进口)和小号松树皮按体积比2:1进行配制。保持适当通风和足够的湿度，每周喷施水溶性平衡肥花多多1号通用肥(氮、磷、钾为20-20-20)3000倍液1次并进行正常的管理，同一生态型自交或异交种子移栽一年的成活率为75％，不同生态型杂交种子移栽一年的成活率为90％。一年后换盆种植2.7寸白色塑料杯中，栽培基质为中号的植金石(日本进口)和中号松树皮按体积比2:1进行配制，每周喷施水溶性平衡肥花多多1号通用肥(氮、磷、钾为20-20-20)2000倍液1次，1年后，每周喷施水溶性平衡肥花多多215号高磷肥(氮、磷、钾为10-52-10)2000倍液1次，再种植半年能开花。此时，同一生态型自交或异交后代的开花率为83％，而不同生态型杂交的后代的开花率可达90％。不同生态型杂交的紫纹兜兰优质种苗生长情况见图不同生态型杂交的紫纹兜兰优质种苗栽培后的开花群体图见图4。
实施例2
(1)利用不同生态型紫纹兜兰杂交获得果实
以华南植物园迁地保护温室中引种保育的、来源于广东阳春和广西上思十万大山的生长健壮的紫纹兜兰母株进行自花、同一生态型及不同生态型的异花授粉。授粉时间选择在花朵完成展开后的5天。授粉时去掉花朵的唇瓣便于操作，操作时采用消毒的牙签挑取花粉粒粘在另一株花的柱头上，随后挂牌记录授粉日期。同一生态型中紫纹兜兰自花或异花人工授粉成功率为80％，不同生态型的异花授粉率为95％。然后选择授粉后260天基本成熟的果实用作实验材料。
(2)外植体消毒和无菌播种
将果实先用75％的酒精浸泡40秒后，再在质量分数0.15％的升汞溶液中消毒15分钟，用无菌水漂洗4次后切开果实，将粉末状种子放入150毫升的无菌水中用玻璃棒搅匀制成悬浮液，每毫升中约有150粒种子。然后每盆用移液管取5毫升悬浮液无菌播种到装有100亳升种子萌发培养基的兰花瓶中，种子萌发培养基为：1/4MS培养基+75mL/L椰子汁+0.2mg/L萘乙酸(NAA)+20g/L蔗糖+0.4g/L活性炭(AC)+6.5g/L琼脂，pH 5.8-6.0。在培养温度25-30℃，光照度800-1200lux，光照12-16小时/天的条件下培养。40天左右种子萌发，同一生态型自交或异交种子的萌发率为60％，不同生态型杂交的种子的萌发率90％。
(3)生根壮苗培养
播种培养3个月后将1-1.5cm高的小苗接种到生根壮苗培养基中，生根壮苗培养基为：每升含花宝1号1.5g+花宝2号1.5g+B5培养基中的维生素和肌醇成分+1.5mg萘乙酸(NAA)+150mL椰子汁+1.5g蛋白胨+75g香蕉匀浆+25g土豆匀浆+1.5g活性炭(AC)+50g蔗糖+6.5g琼脂，溶剂为水，pH 5.8-6.0。在培养温度25-30℃，光照度1500-2000lux，光照12-16小时/天的条件下培养，培养6个月能形成株高5cm高的完整植株。培养时采用标准兰花培养瓶，每瓶25株。
(4)试管苗移栽和栽培管理
将具3-5cm高完整植株从培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗12天，然后取出试管苗，洗净根部的培养基，单株种植于一个1.7寸白色塑料杯中。栽培基质为小号的植金石(日本进口)和小号松树皮按体积比2:1进行配制。保持适当通风和足够的湿度，每周喷施水溶性平衡肥花多多1号通用肥(氮、磷、钾为20-20-20)3500倍液1次并进行正常的管理，同一生态型自交或异交种子移栽一年的成活率为80％，不同生态型杂交种子移栽一年的成活率为95％。一年后换盆种植2.7寸白色塑料杯中，栽培基质为中号的植金石(日本进口)和中号松树皮按体积比2:1进行配制，每周喷施水溶性平衡肥花多多1号通用肥(氮、磷、钾为20-20-20)2500倍液1次，1年后，每周喷施水溶性平衡肥花多多215号高磷肥(氮、磷、钾为10-52-10)2500倍液1次，再种植半年能开花。此时，同一生态型自交或异交后代的开花率为85％，而不同生态型杂交的后代的移栽的开花率可达95％。
实施例3
(1)利用不同生态型紫纹兜兰杂交获得果实
以华南植物园迁地保护温室中引种保育的、来源于广东阳春和广西上思十万大山的生长健壮的紫纹兜兰母株进行自花、同一生态型及不同生态型的异花授粉。授粉时间选择在花朵完成展开后的8天。授粉时去掉花朵的唇瓣便于操作，操作时采用消毒的牙签挑取花粉粒粘在另一株花的柱头上，随后挂牌记录授粉日期。同一生态型中紫纹兜兰自花或异花人工授粉成功率为70％，不同生态型的异花授粉率为85％。然后选择授粉后300天基本成熟的果实用作实验材料。
(2)外植体消毒和无菌播种
将果实先用75％的酒精浸泡60秒后，再在质量分数0.2％的升汞溶液中消毒10分钟，用无菌水漂洗5次后切开果实，将粉末状种子放入200毫升的无菌水中用玻璃棒搅匀制成悬浮液，每毫升中约有100粒种子。然后每盆用移液管取5毫升悬浮液无菌播种到装有100亳升种子萌发培养基的兰花瓶中，种子萌发培养基为：1/4MS培养基+100mL/L椰子汁+0.3mg/L萘乙酸(NAA)+25g/L蔗糖+0.5g/L活性炭(AC)+6.5g/L琼脂，pH 5.8-6.0。在培养温度25-30℃，光照度800-1200lux，光照12-16小时/天的条件下培养。50天左右种子萌发，同一生态型自交或异交种子的萌发率为50％，不同生态型杂交的种子的萌发率80％。
(3)生根壮苗培养
播种培养3个月后将1-1.5cm高的小苗接种到生根壮苗培养基中，生根壮苗培养基为：每升含花宝1号2g+花宝2号1g+B5培养基中的维生素和肌醇成分+2mg萘乙酸(NAA)+200mL椰子汁+2g蛋白胨+100g香蕉匀浆+20g土豆匀浆+2g活性炭(AC)+60g蔗糖+6.5g琼脂，溶剂为水，pH 5.8-6.0。在培养温度25-30℃，光照度1500-2000lux，光照12-16小时/天的条件下培养，培养6个月能形成株高5cm高的完整植株。培养时采用标准兰花培养瓶，每瓶25株。
(4)试管苗移栽和栽培管理
将具3-5cm高完整植株从培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗15天，然后取出试管苗，洗净根部的培养基，单株种植于一个1.7寸白色塑料杯中。栽培基质为小号的植金石(日本进口)和小号松树皮按体积比2:1进行配制。保持适当通风和足够的湿度，每周喷施水溶性平衡肥花多多1号通用肥(氮、磷、钾为20-20-20)4000倍液1次并进行正常的管理，同一生态型自交或异交种子移栽一年的成活率为75％，不同生态型杂交种子移栽一年的成活率为90％。一年后换盆种植2.7寸白色塑料杯中，栽培基质为中号的植金石(日本进口)和中号松树皮按体积比2:1进行配制，每周喷施水溶性平衡肥花多多1号通用肥(氮、磷、钾为20-20-20)3000倍液1次，1年后，每周喷施水溶性平衡肥花多多215号高磷肥(氮、磷、钾为10-52-10)3000倍液1次，再种植半年能开花。此时，同一生态型自交或异交后代的开花率为80％，而不同生态型杂交后代开花率可达90％。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种紫纹兜兰优质种苗的繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)外植体选择：以来源于广东阳春和广西上思十万大山的生长健壮的紫纹兜兰母株进行异花授粉，选择杂交获得的果实作为外植体；
(2)外植体消毒和无菌播种：将外植体消毒后，取出种子，将种子制成悬浮液后播种于种子萌发培养基中，所述的种子萌发培养基为1/4MS培养基+50-100mL/L椰子汁+0.1-0.3mg/L萘乙酸+15-25g/L蔗糖+0.3-0.5g/L活性炭+5.5-6.5g/L琼脂，pH 5.8-6.0，在培养温度25-30℃，光照度800-1200lux，光照12-16小时/天的条件下培养；
(3)生根壮苗培养：将1-1.5cm高的小苗接种到生根壮苗培养基中，所述的生根壮苗培养基每升：含花宝1号1～2g+花宝2号1～2g+B5培养基中的维生素和肌醇成分+萘乙酸1.0-2.0mg+椰子汁100-200mL+蛋白胨1-2g+香蕉匀浆50-100g+土豆匀浆20-30g+活性炭1.0-2.0g+蔗糖40-60g+琼脂5.5-6.5g，溶剂为水，pH 5.8-6.0，在培养温度25-30℃，光照度1500-2000lux，光照12-16小时/天的条件下培养；
(4)试管苗移栽和栽培管理：将3-5cm高的完整植株从培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗10-15天，然后取出试管苗，洗净根部的培养基，种植于栽培基质中，进行肥水管理。
2.根据权利要求1所述的紫纹兜兰优质种苗的繁育方法，其特征在于，所述的外植体消毒，具体步骤为：将果实先用75％的酒精浸泡30-60秒，然后在质量分数0.1-0.2％的升汞溶液中消毒10-20分钟，最后用无菌水漂洗4-5次。
3.根据权利要求1所述的紫纹兜兰优质种苗的繁育方法，其特征在于，所述的将种子制成悬浮液后播种于种子萌发培养基中，具体步骤为：取5毫升种子悬液播种于100亳升种子萌发培养基中。
4.根据权利要求1所述的紫纹兜兰优质种苗的繁育方法，其特征在于，所述的种子悬液每毫升中含有100-200粒种子。
5.根据权利要求1所述的紫纹兜兰优质种苗的繁育方法，其特征在于，所述的种植于栽培基质中，进行肥水管理，具体步骤为：将试管苗洗净根部的培养基，种植于由小号的植金石和小号松树皮按体积比2:1进行配制的栽培基质中，每周喷施水溶性平衡肥花多多1号通用肥3000-4000倍液1次并进行正常的管理；一年后种植于由中号的植金石和中号松树皮按体积比2:1进行配制的栽培基质中，每周喷施水溶性平衡肥花多多1号通用肥2000-3000倍液1次，1年后，每周喷施水溶性平衡肥花多多215号高磷肥2000-3000倍液1次，再种植半年能开花。
6.根据权利要求1所述的紫纹兜兰优质种苗的繁育方法，其特征在于，所述的果实为授粉后240-300天基本成熟的果实。
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