CN110881478A - 蜡壳属真菌促进树兰属植物和兜兰属植物种子萌发的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蜡壳属真菌促进树兰属植物(Epidendrumsecundum)和兜兰属植物(Paphiopedilum)种子萌发的方法，采用3‑1菌株(Sebacinasp.)同时与树兰和兜兰种子建立共生关系，促进植物种子萌发，培养基为：浓度2.0g/L的OMA。树兰种子与3‑1菌株在2.0g/L的OMA中共生关系建立时间为21天，萌发率为83.35±0.88％；兜兰种子与3‑1菌株在2.0g/L的OMA中萌发时间为25天，萌发率为66.23±2.55％。筛选可高效促进不同兜兰属植物种子萌发的共生培养基及培养条件，并利用共生萌发培养技术提高树兰和兜兰属植物种子萌发率，建立树兰和兜兰属植物与蜡壳菌属真菌的共生体系，对兜兰属植物的有效保护具有重要意义。

Description

蜡壳属真菌促进树兰属植物和兜兰属植物种子萌发的方法

技术领域

本发明涉及一种促进树兰属植物(Epidendrumsecundum)和兜兰属植物(Paphiopedilum)种子萌发技术，尤其涉及一种蜡壳属真菌(Sebacinasp.)促进树兰属植物(Epidendrum)和兜兰属植物(Paphiopedilum)种子萌发的方法。

背景技术

兰科植物(Orchidaceae)属于被子植物门单子叶植物纲，全世界分布约有700属35000余种(Dressler，1993；Cribb，2003)，其种类数量仅次于菊科植物，位列第二大科(郎楷永，1994)。它外形优美，颜色鲜艳，极具观赏价值和药用价值。

兰科植物有两个显著特点:一、兰科植物种子的胚仅由几十个细胞组成，分化不完全，自然萌发困难。二、兰科植物几乎都是菌根植物，自然生长状态下，无论绿叶兰还是非绿叶兰，在其生活史中—种子萌发阶段或不能进行光合自养的时期—都必须部分或完全依赖与真菌建立共生关系才能完成正常生命活动。在没有菌根真菌共生参与的情况下，兰科植物的种子萌发和个体发育过程中营养供应都将受到影响，无法完成正常的生长发育。

树兰属(Epidendrum)植物属于兰科树兰族，是新热带区兰科植物中最大的属，约有1125多个种(Chase et al.，2003)。其中的Epidendrumsecundum树兰是该属中形态变化差异最大的种之一，广泛分布于南美洲。Epidendrumsecundum树兰(以下简称树兰)，花型小，玫红色，可全年开花，具有重要的观赏价值(许璐，2016)。

兜兰属(Paphiopedilum)是兰科(Orchidaceae)的一个濒危类群，全世界约有80余种(刘仲健等,2004)，全部产于亚洲的热带和亚热带地区，分布中心在东南亚、南洋群岛以及太平洋西南的大洋洲岛屿国家巴布亚新几内亚等国(王贞,2006)。兜兰属植物花奇色美，具有非常高的观赏价值。由于采集过度、走私出境猖獗以及生境破坏等原因，近十几年来野生硬叶兜兰的数量急剧减少，分布区逐渐萎缩，已经到了灭绝的边缘(田凡,2019)。兜兰属植物野生资源的保护和人工繁育问题亟待引起社会各界的重视。

研究结果表明，兰科菌根对于兰科植物具有重要意义：1、促进种子萌发并为其提供必要的养分；2、为成年兰科植物生长发育提供所需营养物质；3、促进兰科植物对P等无机离子的吸收；4、提高寄主植物的抗病和抗逆能力；5、具有生态学意义。鉴于前期研究结果所显现的菌根真菌对兰科植物的重要意义，开展二者之间互作机制的研究迫在眉睫。

近年来，由于自然灾害和人为的破坏导致野生兰花骤减，为保护兰科植物资源，人们采取了多种措施来防止兰科植物物种灭绝。而菌根真菌对兰科植物的种子萌发、原球茎发育以及成苗后的生长发育都至关重要。

为了解兰科植物与真菌共生关系的发生机制，研究人员尝试在离体条件下将兰科植物与分离获得的菌根真菌人为的构建共生。在过去的共生研究中，多采用两种类型的培养基质构建：一类是利用壳斗科树皮或树叶制成的培养基质；另一类是利用燕麦琼脂培养基(Oatmeal agar medium，OMA)。

目前，现有技术中未见有蜡壳属真菌(Sebacinasp.)与树兰(Epidendrumsecundum)以及肉饼兜兰(PaphiopedilumPacific Shamrock)共生体系建立方法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种蜡壳属真菌促进树兰属植物和兜兰属植物种子萌发的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的蜡壳属真菌促进树兰属植物和兜兰属植物种子萌发的方法，包括：

采用3-1菌株同时与树兰和兜兰种子建立共生关系，促进植物种子萌发；

所述树兰属植物的拉丁文名称：Epidendrumsecundum，所述兜兰属植物的拉丁文名称：

PaphiopedilumPacific Shamrock；

所述3-1菌株为蜡壳菌属真菌，其拉丁文名称：Sebacinasp.，菌株编号：3-1，ITS基因NCBI注册号：MN644843，CGMCC保藏编号：CGMCC No.18583。

由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供的蜡壳属真菌促进树兰属植物(Epidendrumsecundum)和肉饼兜兰(PaphiopedilumPacific Shamrock)种子萌发的方法，在人工培养基上采用蜡壳菌属真菌和树兰以及肉饼兜兰植物种子进行共生萌发试验，并与不接菌的树兰和肉饼兜兰种子对照组进行对比，筛选可高效促进树兰和肉饼兜兰种子萌发的共生培养基及培养条件。获得树兰和兜兰属植物种子萌发阶段的有效共生真菌，并利用共生萌发培养技术提高树兰和兜兰属植物种子萌发率，建立树兰和兜兰属植物与蜡壳菌属真菌的共生体系是开展珍稀濒危兰科植物回归的关键环节，对兜兰属植物的有效保护具有重要意义。

具体实施方式

下面将对本发明实施例作进一步地详细描述。本发明实施例中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

本发明的蜡壳属真菌促进树兰属植物和兜兰属植物种子萌发的方法，其较佳的具体实施方式是：

包括：

采用3-1菌株同时与树兰和兜兰种子建立共生关系，促进植物种子萌发；

所述树兰属植物的拉丁文名称：Epidendrumsecundum，所述兜兰属植物的拉丁文名称：PaphiopedilumPacific Shamrock；

所述3-1菌株为蜡壳菌属真菌，其拉丁文名称：Sebacinasp.，菌株编号：3-1，ITS基因NCBI注册号：MN644843，CGMCC保藏编号：CGMCC No.18583。

所述3-1菌株促进树兰和肉饼兜兰种子萌发的培养基为：浓度2.0g/L的OMA。

所述树兰种子与3-1菌株在2.0g/L的OMA中共生关系建立时间为21天，萌发率为83.35±0.88％；

所述肉饼兜兰种子与3-1菌株在2.0g/L的OMA中萌发时间为25天，萌发率为66.23±2.55％。

兰科植物种子在自然条件下萌发率极低，需要菌根真菌参与其整个生长发育过程。本发明的蜡壳属真菌促进树兰属植物(Epidendrumsecundum)和兜兰属植物(PaphiopedilumPacific Shamrock)种子萌发的方法，在人工培养基上采用蜡壳菌属真菌和兜兰属植物种子进行共生萌发试验，并与不接菌的兜兰属植物种子对照组进行对比，筛选可高效促进不同兜兰属植物种子萌发的共生培养基及培养条件。获得兜兰属植物种子萌发阶段的有效共生真菌，并利用共生萌发培养技术提高树兰和肉饼兜兰种子萌发率，建立树兰和兜兰与蜡壳菌属真菌的共生体系是开展珍稀濒危兰科植物回归的关键环节，对兜兰属植物的有效保护具有重要意义。

具体实施例：

1、试验材料

(1)植物材料：树兰(Epidendrumsecundum)和肉饼兜兰(PaphiopedilumPacificShamrock)种子。

(2)真菌材料：本实验室分离获得的1株蜡壳菌属真菌(Sebacinasp.)，菌株编号：3-1。ITS基因NCBI注册号：MN644843。CGMCC保藏编号：CGMCC No.18583。

2、试验方法(兰科植物种子与胶膜菌属真菌共生萌发试验)

(1)培养基的配置

共生培养基(燕麦培养基OMA)的配置：取燕麦片磨成粉状，分别取三个梯度的燕麦粉，配成0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L OMA的溶液。去离子水煮沸1h，过滤，琼脂8.0g，滤液加去离子水定容至1000mL，高温灭菌。

真菌培养基的配置：200g去皮马铃薯，切成0.5～1cm见方的小块，加去离子水800mL煮30min后，用4～5层纱布过滤得到滤液，并在滤液中加入20g葡萄糖和8g琼脂后，再用去离子水定容至1000mL，高温灭菌后，待温度降至50摄氏度时加入硫酸链霉素至终浓度50mg/L。

(2)胶膜菌属真菌的活化与鉴定

本实验室分离获得的1株蜡壳菌属真菌(Sebacinasp.)。挑取真菌菌丝于PDA培养基中，28℃恒温暗培养7～10d。对活化后的真菌进行形态特征观察；挑取菌株边缘的菌丝接种于铺有醋酸纤维素膜的PDA培养基上，28℃恒温暗培养7～10d，液氮速冻后充分研磨，利用OMEGA试剂盒提取DNA，PCR特异扩增ITS区，PCR扩增引物为ITS1F：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；PCR产物送至公司进行测序，将序列文件用软件DNAMAN进行校对后，通过在线BLAST(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在GenBank中进行序列比对。

(3)蒴果的灭菌

取同一植株上花期一致、授粉时间一致、长势一致的树兰和肉饼兜兰蒴果为试验材料，先用沾有75％酒精的棉球轻轻擦拭外果皮3遍，移入超净工作台后，再用同样的方法擦3遍。

(4)种子共生萌发

真菌活化后，打孔器取边缘菌丝制成直径为0.8cm、高约0.5cm的圆柱状真菌琼脂块，接种于处理组；无菌的PDA培养基打取同样大小琼脂块，接种于对照组。

种子共生萌发：OMA上铺有中间空洞的3.5×3.5cm滤纸片，将兰花蒴果表面灭菌后取出种子均匀铺于滤纸片上。处理组中央接种真菌琼脂块，对照组接种无菌琼脂块，每浓度培养基设置15个皿重复，于23±2℃下黑暗培养。

(5)检测

根据Zettler et al.种子萌发阶段标准，详见表1。定期观察种子萌发情况，记录种子萌发的时间及萌发率。待处理组兰花种子生长发育至第3阶段，每2天随机选取植物样品用台盼蓝(0.05％Trypan Blue-water solution)染色方法，制作临时压片于光学显微镜下观察真菌定殖情况。对比筛选能显著促进种子萌发的有效菌株。标准生长指数(Standardized Growth Index，GI)计算方法如下：(N1+N2×2+N3×3+N4×4+N5×5+N6×6)/(N0+N1+N2+N3+N4+N5+N6)；种子萌发率计算方法如下：(N3+N4+N5+N6)/(N0+N1+N2+N3+N4+N5+N6)×100％，其中，N0为第0阶段种子的的数量，N1～N6依次为第1～6阶段种子的数量。

表1种子萌发阶段

3、试验结果

(1)蜡壳菌属真菌的鉴定

试验所使用的蜡壳菌属真菌3-1(Sebacinasp.)在PDA培养基上均表现出以下共同的培养特征：菌落淡黄色，质体胶质，环纹同心圆明显，菌落较薄，菌落边缘不整齐且菌丝下沉生长；无气生菌丝。光学显微镜下均观察到以下共同特征：未见孢子；菌丝相对柔软弯曲、不透明，直径为2.07±0.06μm，隔膜不明显，锐角或直角分枝；菌丝基部念珠状变形明显。

ITS序列PCR结果经测序后于NCBI进行比对，并将序列于NCBI上进行注册，注册号为：MN644843。交由中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)进行保藏，保藏编号为：CGMCC No.18583。

(2)树兰和肉饼兜兰种子与蜡壳菌属真菌共生体形成检验

将树兰(Epidendrumsecundum)和肉饼兜兰(PaphiopedilumPacific Shamrock)的种子在不同的OMA浓度下与蜡壳菌属菌根真菌3-1共培养，观察并记录种子的萌发情况，待处理组兰花种子萌发成原球茎后，每2天选取植物样品，通过组织切片和番红染色方法，于光学显微镜下观察真菌定殖情况并记录真菌定殖时间(表2)

结果表明，3-1菌株在不同浓度培养基条件下在兰科植物中定殖的时间不同。在树兰中最早定殖时间为21天(2.0g/L OMA)，最晚定殖时间为35天(0.5g/L OMA)；3-1菌株在兜兰中最早定殖时间为25天(2.0g/L OMA)，最晚定殖时间为45天(4.0g/L OMA)，另外，3-1菌株在0.5g/L OMA和1.0g/L OMA中未发现在肉饼兜兰原球茎中定殖。

表2菌根真菌在兰科植物中的定殖时间

注：数字，共生时间(天)；－，未检测到定殖。

(3)真菌促进树兰和兜兰种子萌发的有效性检测

组织切片和番红染色方法结果发现，在树兰中最晚检测到真菌的时间为35天，为保证GI值和萌发率计算的准确性，因此，本发明选择40天后计算GI值和萌发率。

标准生长指数(Standardized Growth Index，GI)计算结果表明(表3)，树兰种子标准生长指数GI最大值为4.27±0.59(2.0g/L OMA)；肉饼兜兰种子最大值分别为3.65±0.45(2.0g/L OMA)。不同浓度燕麦培养基对同一兰科标准生长指数GI值影响显著性不同，存在极显著性差异(P<0.001)。

表3不同处理培养40天后种子标准生长指数值GI(平均值±标准方差)

(4)树兰和肉饼兜兰种子的萌发率统计结果

菌根真菌3-1菌株在不同的OMA浓度下分别促进2种兰科物种子萌发率显著性差异分析，结果发现(表4)：在不同浓度的OMA培养基中促进树兰种子萌发率存在极显著差异性(P<0.001)，树兰种子在2.0g/L的OMA中萌发率最高，为83.35±0.88％；在不同浓度的OMA培养基中促进肉饼兜兰种子萌发率存在极显著差异性(P<0.001)，在浓度为2.0g/L的OMA中，肉饼兜兰种子萌发率最高，别为66.23±2.55％。

表4不同处理培养40天后种子萌发率(平均值±标准方差％)

兰科植物种子在自然条件下萌发率极低，需要菌根真菌参与其整个生长发育过程。获得兰科植物种子萌发阶段的有效共生真菌,是开展珍稀濒危兰科植物回归的关键环节,对兰科植物的有效保护具有重要意义。为建立兰科植物与菌根真菌的共生体系，筛选出适宜的共生培养基，本发明采用蜡壳菌属真菌与树兰和兜兰属植物种子建立共生关系，并与不接菌的对照组进行对比。

本发明通过统计兰科植物种子的萌发率，发现3-1菌株可以在全部OMA试验浓度下促进树兰植物种子萌发；通过观察真菌和兰科植物的生长情况，筛选出维持植物和微生物两者生长势平衡的培养基为2.0g/L，在该浓度培养基条件下，肉饼兜兰种子与3-1菌株共生关系建立时间最短为21天，且萌发率最高，为83.35±0.88％；肉饼兜兰与3-1菌株在浓度为2.0g/L的OMA中萌发时间最短，为25天，萌发率最高，为66.23±2.55％。

本发明在野生兰科植物正面临濒危的情况下，筛选出了促进树兰和兜兰种子高效萌发成苗的共生真菌菌株和适宜的培养基浓度，可为树兰和兜兰的生产繁殖提供指导，对树兰和兜兰种质资源的保护具有重要意义。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (3)

1.一种蜡壳属真菌促进树兰属植物和兜兰属植物种子萌发的方法，其特征在于，包括：

采用3-1菌株同时与树兰和肉饼兜兰种子建立共生关系，促进植物种子萌发；

所述树兰属植物的拉丁文名称：Epidendrumsecundum，所述兜兰属植物的拉丁文名称：PaphiopedilumPacific Shamrock；

所述3-1菌株为蜡壳菌属真菌，其拉丁文名称：Sebacinasp.，菌株编号：3-1，ITS基因NCBI注册号：MN644843，CGMCC保藏编号：CGMCC No.18583。

2.根据权利要求1所述的蜡壳属真菌促进树兰属植物和兜兰属植物种子萌发的方法，其特征在于，所述3-1菌株促进树兰和兜兰种子萌发的培养基为：浓度2.0g/L的OMA。

3.根据权利要求2所述的蜡壳属真菌促进树兰属植物和兜兰属植物种子萌发的方法，其特征在于：

所述树兰种子与3-1菌株在2.0g/L的OMA中共生关系建立时间为21天，萌发率为83.35±0.88％；

所述肉饼兜兰种子与3-1菌株在2.0g/L的OMA中萌发时间为25天，萌发率为66.23±2.55％。