CN111100797B

CN111100797B - 一种促进白及种子萌发形成幼苗的菌株及其应用

Info

Publication number: CN111100797B
Application number: CN201811254921.5A
Authority: CN
Inventors: 徐玲玲; 赵明阳; 张焱; 阮绍阳
Original assignee: Xian Unversity of Arts and Science
Current assignee: Xian Unversity of Arts and Science
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2038-10-26
Also published as: CN111100797A

Abstract

本发明所涉及生物技术领域的一种促进白及种子萌发形成幼苗的菌株及其应用；所述菌株为一种腊壳菌属真菌菌株，为Sebacina sp.SL15‑7，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15690；所述腊壳菌菌株CGMCC NO.15690在促进白及种子共生萌发形成幼苗中有明显作用，值得推广应用。

Description

一种促进白及种子萌发形成幼苗的菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种促进白及种子萌发形成幼苗的菌株及其应用。

背景技术

白及(Bletilla striata)作为传统中药材，有着极高的药用价值。但作为兰科植物家族的一员，其种子非常细小没有胚乳或子叶，仅有发育不完全的胚，在自然条件下种子萌发需要依靠特定的共生真菌来获取营养物质才能萌发形成幼苗。目前，兰科植物种子的萌发可以通过非共生萌发培养和共生萌发培养两种方式。虽然大多数兰科植物可通过非共生萌发，但是此方法获得的幼苗在向大田移植过程中，不易与菌根真菌建立共生关系，容易出现生长慢，抗病能力差，死亡率高等问题。兰科植物共生萌发培养技术是指在特定的基质(培养基)中同时播种兰科植物种子和共生真菌，该方法可以提高种子的萌发率、幼苗的生长速度以及移植到自然环境后的幼苗存活率。因此，能否分离到能够有效促进白及种子萌发的菌根真菌一直是限制白及产业发展的一个难点，通过共生菌根真菌与兰科植物共生萌发以提高其萌发效率也是兰科植物技术应用的一个热点。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提出一种促进白及种子萌发形成幼苗的菌株，具体地说涉及一种腊壳菌属真菌菌株及其在促进白及种子萌发中的应用。该菌株能与白及种子形成共生关系，促使白及种子萌发形成幼苗，具体来说涉及一种能与白及种子形成共生关系并促进其种子萌发形成幼苗的有效菌根真菌及其应用。

本发明目的之一是提供一种促进白及种子萌发形成幼苗的菌株，所述菌株为一种腊壳菌属真菌菌株，所述腊壳菌属真菌菌株命名为Sebacina sp.SL15-7，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏日期为2018年6月15日，保藏编号为CGMCC NO.15690。所述的腊壳菌Sebacina sp. SL15-7菌株(CGMCCNO.15690)的nrDNA ITS序列提交美国国立生物技术信息中心数据库(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，序列号为MG992005。

所述的腊壳菌属真菌菌株(CGMCC NO.15690)的ITS序列为：

CGTCGACACGCTGTGCTGGTGGAAACACATGTGCACGTGTGTCGCAA ACATCCACACACCTGTGAACCTTAGACTCTGTGGTTGATGAGCGCCGGAC TTTTTGTCCACGTGCGTGGGGGCCATCGTGCCCTCCTTCTCCCAGGGTACT TTTTTACATACTCCGAATGTAATGGAATGTCTCTGTGCATAACGCGCAACT ATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGC AGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGA ATCCTCGAACGCACCTTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCACGCCCGTTT GAGTGTCATTGTAATCTCACCTCTACGGTTTCTCACCGTGGACGTGGATCT GGACGTCGTCGGCCTCGTTCGACCCGTCTGAAATGCGTGAGTGTATCCTG CCGTGCAGTATATCTGGTGTGATAAGCATCTTCATCGGATTGTCGGTGGG CTCTGTGCTTCCGAACCGTCCCCCAGTGGACAATACTTGACGATTTGACCT CAGATCGGGTGGGACTACCCGCTGAACTTAA

所述的腊壳菌属真菌菌株(CGMCC NO.15690)的nrDNA ITS序列也可见序列表中的序列1。

所述腊壳菌属真菌菌株(CGMCC NO.15690)的生物学形态特征如下：

在PDA平板上培养10天后，其菌落呈浅黄色，略显放射状(图1)，不规则圆形发散生长，气生菌丝不发达，中等稀疏，光学显微镜下观察，菌丝具隔膜，粗3.5～5.0μm，多数4.0μm，分枝近直角，分枝处缢缩，距分枝不远处形成隔膜，老菌丝细胞壁有加厚现象，培养2周以上开始形成串珠状的厚垣孢子，厚垣孢子数量不等，直径11.4～16.6μm，多数在12.0μm。

所述菌株(CGMCC NO.15690)的分离纯化方法为：

发明人于2015年6月在中国四川省西北部松潘县自然保护区采集西藏杓兰根。将采集的根在超净工作台中进行表面灭菌，在培养皿中加入少量无菌水，根放入无菌水后用解剖刀刮碎后，根中的菌根真菌菌丝团会释放到无菌水中。在解剖镜下，用移液枪吸取单个菌丝团，置于PDA培养基上培养，待长出菌丝时，进行转接将真菌纯化，获得纯培养菌落。

所述菌株的鉴定方法为：

形态观察：

所述菌株观察显微形态特征使用临时装片法。菌株置于培养箱在25±2℃条件下培养7～10天后，用细接种针挑取菌丝制作临时装片在显微镜下进行观察测量，形态特征如下：本发明编号为CGMCC NO.15690的腊壳菌Sebacina sp. SL15-7菌株在PDA平板上培养10天其菌落呈浅黄色，略显放射状，不规则圆形发散生长，气生菌丝不发达，中等稀疏，光学显微镜下观察，菌丝具隔膜，粗3.5～5.0μm，多数4.0μm，分枝近直角，分枝处缢缩，距分枝不远处形成隔膜，老菌丝细胞壁有加厚现象，培养2周以上开始形成串珠状的厚垣孢子，厚垣孢子数量不等，直径11.4～16.6μm，多数在12.0μm。

分子鉴定：

提取总DNA

采用试剂盒法提取总DNA(TIANGEN牌基因组DNA提取试剂盒)

1)取真菌菌落约100mg，转入2mL离心管中，用组织破碎仪(TissueLyser II) 充分研磨。

2)将研磨好的混合物迅速转移到预先装有700μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终体积浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管已混合样品数次。

3)加入700μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min。

4)小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。

5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30sec，弃掉废液。(吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。)

6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前先加入无水乙醇)， 12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前加入无水乙醇)，12000rpm 离心30sec，置于室温放置数分钟倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8)重复操作步骤7。

9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 30μL洗脫缓冲液TE，室温放置2～5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，保存在-20℃冰柜中待用。

PCR扩增

用2xTaq MasterMix产品，以基因组DNA为模板扩增，反应体系为25μl。

1)PCR反应体系(25μl体系)

模板 <1μg(1μl)

引物1(10μM)(ITS4) 1μl

引物2(10μM)(ITS5) 1μl

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl

ddH2O补至25μ

2)在PCR扩增程序：

①预变性 94℃ 4min

②循环条件(35次)

测序比对

将PCR产物送交生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。所获得的对白及种子萌发有效共生真菌ITS片段序列在美国国立生物技术信息中心数据库 (NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行BLAST比对分析，其与KF574236.1U UnculturedSebacinaceae clone YN5-18相似性为83％。根据菌落、显微形态特征及分子生物学手段将本发明所涉及真菌鉴定为腊壳菌属真菌。

本发明目的之二是提供所述的腊壳菌属真菌菌株在促进白及种子萌发中的应用，尤其是在促进白及种子萌发形成幼苗中的应用。其中，所述的形成幼苗是指白及种子萌发形成至少一个叶片。

所述应用包括将白及种子接入共生萌发培养基的方法，具体可包括以下步骤：将消毒灭菌后的白及种子放入浓度为0.8～1g·L^-1的无菌琼脂悬浮液制成种子悬浮液，使每毫升悬浮液中约800～1000粒种子，无菌状态下取150微升种子悬浮液播种在培养10～15天后长满所述腊壳菌属真菌菌株(CGMCC NO.15690) 菌丝体的培养基上，进行培养。

其中，所述腊壳菌与白及种子共生萌发的培养基为本领域常用的燕麦琼脂培养基(OMA，4g·L^-1燕麦粉+8g·L^-1琼脂，并调节pH＝5.6～5.8)。

所述的进行培养的条件为：将所述培养基置于人工培养箱内25±2℃，湿度 40％～60％，前8～12天在黑暗条件下培养，待大部分种子萌发形成原球茎之后光照(12/12L/D)培养，光照培养可为10～20天。本申请在菌株和白及种子共生萌发过程的一些条件进行了探索，发现前10天左右(原球茎形成期)进行黑暗培养，更利于白及种子和蜡壳菌共生萌发。自然条件下，种子多在土壤中的黑暗条件下萌发形成原球茎，不需要光照。因此，有些兰科植物在原球茎萌发阶段进行黑暗培养往往萌发率更高。但形成原球茎后，因为需要进一步形成叶子，所以需要光照进行幼苗的形态建成。

利用种子与真菌在培养基内的共生萌发实验来检测分离到的真菌是否对种子萌发形成幼苗有促进效果，以及对比不同真菌对种子萌发形成幼苗促进效果的差异。具体地，本发明利用种子与真菌进行在培养基内的共生萌发实验，可包括以下步骤：

1)将保存于4℃试管斜面内的供试菌株取出，重新接种在PDA平板培养基上，置于人工气候箱内25±2℃培养，进行活化。待真菌菌丝快长满培养皿时(约 10天)取出作为共生萌发材料。

2)配制共生萌发培养基及接种：所用培养基为燕麦琼脂培养基(OMA，4g·L^-1燕麦粉+8g·L-¹琼脂，pH＝5.6～5.8)。将4g燕麦粉开水煮20分钟后，用8层纱布过滤，将滤液定容至1L。将8g琼脂粉和1L滤液平均分装至三个500mL三角瓶中，封紧瓶口，灭菌(121℃，20min)后倒平板备用。在9cm培养皿OMA培养基表面放置的直径为6cm的200目无菌尼龙网布，再将活化的菌株接种到无菌尼龙网布上，培养7-15d至菌丝长满整个尼龙网布。

3)种子灭菌及共生培养：将放在冰箱中的白及种荚取出，恢复到室温后，在超净工作台中，先将白及种荚进行表面灭菌，即用浓度为0.1g/mL的氯化汞溶液灭菌15min并不断摇晃，使溶液与白及种荚充分接触，然后无菌水冲洗3～4 次，取出用无菌滤纸吸干表面水分。将表面灭菌好的种荚放在无菌培养皿中，用无菌手术刀切开种荚，取出种子，放入0.8～1g·L-¹琼脂溶液中制成种子悬浮液，然后用移液枪吸取150微升种子悬浮液(约150粒种子)均匀播种在长满真菌的尼龙网布上。用封口膜将培养皿封好，置于人工气候箱内温度25℃，湿度50％，前8～12d暗培养，之后光照12/12h L/D条件下培养10～20d。

4)检测：播种后每天观察种子萌发情况，记录种子萌发及形成幼苗的时间。当培养皿中60％种子形成幼苗时将全部培养皿取出，在体式显微镜下观察记录种子萌发及幼苗发育情况。

所述腊壳菌属真菌菌株为Sebacina sp.SL15-7，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2018年6月15日，保藏编号为CGMCCNO.15690。

附图说明

图1为Sebacina sp.SL15-7(CGMCC NO.15690)在PDA平板上培养形成的菌落照片；其中，图1-A为菌落正面；图1-B为菌落反面。

图2为实施例1中白及种子与不同真菌菌株共生萌发形成幼苗情况；其中，图2-A为白及种子与Tulasnella sp.HL15-8a-22(CGMCC15365)菌株共生萌发形成幼苗情况，图2-B为白及种子与Sebacina sp.SL15-7(CGMCC NO.15690) 菌株共生萌发形成幼苗情况。

图3为实施例1中不同菌株与白及种子萌发后共生情况(标尺表示500μm)。其中图3-A为Tulasnella sp.HL15-8a-22(CGMCC15365)菌株与白及种子萌发后共生情况，可见萌发形成的幼苗中没有菌根真菌定殖；图3-B为Sebacina sp. SL15-7(CGMCC NO.15690)菌株与白及种子萌发后共生情况，可见原球茎中形成大量深色菌丝团。相同培养时间，与Sebacina sp.SL15-7(CGMCC NO.15690) 共生培养的白及发育较快。可见，相同培养时间菌株Sebacina sp.SL15-7 (CGMCC NO.15690)较Tulasnella sp.HL15-8a-22(CGMCC15365)对幼苗的促进效果更加明显，且幼苗中有大量菌株定殖形成的菌丝团。

图4为实施例1中不同菌株与白及种子共生萌发形成幼苗的情况；不同字母表示差异显著(p<0.05)。

图5为实施例2中前10d光照和黑暗培养条件下Sebacina sp.SL15-7 (CGMCCNO.15690)菌株与白及种子共生萌发形成幼苗的情况；不同字母表示差异显著(p<0.05)。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步说明本发明。但本发明不受这些实施例的限制。

实施例1腊壳菌Sebacina sp.SL15-7(CGMCC NO.15690)菌株对白及种子萌发形成幼苗的促进效果

1)将保存于4℃试管斜面内的供试菌株Tulasnella sp.HL15-8a-22(CGMCC15365)(该菌株是从西藏杓兰根中分离得到的菌根真菌，其NCBI 序列号为MF071203)和腊壳菌Sebacina sp.SL15-7(CGMCC15690)取出，分别重新接种在PDA平板培养基上，置于人工气候箱内25±2℃培养，进行活化。待真菌菌丝快长满培养皿时(约10d)取出作为共生萌发材料。

2)配制共生萌发培养基及接种：所用培养基为燕麦琼脂培养基(OMA，4g·L^-1燕麦粉+8g·L^-1琼脂，pH＝5.6～5.8)。将配好的培养基分装到三角瓶中，旋紧瓶盖，灭菌(121℃，20min)后倒9cm培养皿平板备用。在9cm培养皿OMA培养基表面放置直径为6cm的200目无菌尼龙网布。将准备好的培养基分三个组进行处理，分别为不接种的空白对照组，接种HL15-8a-22和SL15-7的菌株组，每个组10个平板，然后置于人工气候箱内25±2℃培养(约10天)待用。

3)种子灭菌及共生培养：将放在冰箱中的白及种荚取出，恢复到室温后，在超净工作台中，先将白及种荚进行表面灭菌，用浓度为0.1g/mL的氯化汞溶液灭菌15min并不断摇晃，使溶液与白及种荚充分接触，然后用无菌水冲洗3～4 次，取出种荚并用无菌滤纸吸干表面水分。将表面灭菌好的种荚放在无菌培养皿中，用无菌手术刀切开种荚，取出种子，放入1g/L琼脂溶液中制成种子悬浮液，然后用移液枪吸取150微升种子悬浮液(约150粒种子)均匀播种在长满真菌的尼龙网布上。用封口膜将培养皿封好，置于人工培养箱内25±2℃，湿度 50％，黑暗条件下培养10d后，再光照培养10～20天(光周期为12/12h L/D，每天12小时黑暗，12小时光照培养)。

4)检测：播种后每天观察种子萌发情况，记录种子萌发及形成幼苗的时间。待对照组种子约60％形成幼苗时将全部培养皿取出，在体式显微镜(重庆重光， ZSA0745)下观察和记录白及种子总数和萌发形成幼苗的数量。

最终三个处理组的幼苗形成情况见图2～图4(幼苗形成率＝形成幼苗的种子数/全部的种子数×100％)。结果表明：相同培养时间菌株SL15-7较HL15-8a-22 对幼苗的促进效果更加明显(图2)且幼苗中有大量菌株定殖形成的菌丝团(图 3)。空白对照组(CK)，菌株HL15-8a-22和SL15-7(CGMCC15690)处理组形成幼苗的效率分别为63.3％、71.4％和91.2％(图4)。可见菌株SL15-7 (CGMCC15690)对白及种子萌发形成幼苗有明显的促进效果，而菌株 HL15-8a-22对对白及种子萌发形成幼苗效果不显著(图4)。

实施例2前期黑暗培养对腊壳菌Sebacina sp.SL15-7(CGMCC15690)与白及种子共生萌发形成幼苗的促进效果

1)将保存于4℃试管斜面内的供试菌株腊壳菌Sebacina sp.SL15-7(CGMCC15690)取出，重新接种在PDA平板培养基上，置于人工气候箱内25±2℃培养，进行活化。待真菌菌丝快长满培养皿时(约10d)取出作为共生萌发材料。

2)配制共生萌发培养基及接种：所用培养基为燕麦琼脂培养基(OMA，4g·L^-1燕麦粉+8g·L^-1琼脂，pH＝5.6～5.8)。将配好的培养基分装到三角瓶中，旋紧瓶盖，灭菌(121℃，20min)后倒平板备用。在9cm培养皿OMA培养基表面放置直径为 6cm的200目无菌尼龙网布，再将活化的腊壳菌Sebacina sp.SL15-7 (CGMCC15690)菌株接种到无菌尼龙网布上，置于人工气候箱内25±2℃培养 (约10d)待用。

3)种子灭菌及共生培养：将放在4℃冰箱中的白及种荚取出，恢复到室温后，在超净工作台中，先将白及种荚进行表面灭菌，用浓度为0.1g/mL的氯化汞溶液灭菌15min并不断摇晃，使溶液与白及种荚充分接触，然后无菌水冲洗3～4次，取出用无菌滤纸吸干表面水分。将表面灭菌好的种荚放在无菌培养皿中，用无菌手术刀切开种荚，取出种子，放入1g/L琼脂溶液中制成种子悬浮液，然后用移液枪吸取150微升种子悬浮液(约140粒种子)均匀播种在每张尼龙网布上。用封口膜将培养皿封好，分为4组，分别为不接种菌株的光照对照、黑暗对照组和接种腊壳菌Sebacina sp.SL15-7(CGMCC15690)的光照和黑暗组。每组10 个重复。将光照对照和接种真菌光照组置于人工培养箱内25±2℃，湿度50％，有光条件12/12hL/D下培养；将黑暗对照和真菌接种黑暗组置于人工培养箱内 25±2℃，湿度50％，黑暗条件(光周期为0/24hL/D)下培养10天后，4组处理全部在25±2℃，湿度50％，有光条件12/12hL/D下再培养10～20天。

4)检测：待光照对照组约60％的种子形成幼苗时将全部培养皿取出，在体式显微镜(重庆重光，ZSA0745)下观察和记录白及种子总数和萌发形成幼苗的种子数(其中，幼苗形成率＝形成幼苗的种子数/全部的种子数×100％)。结果表明：光照对照、黑暗对照和接种腊壳菌Sebacina sp.SL15-7的光照和黑暗组种子萌发形成幼苗的百分比分别为：74.3％、63.3％、65.4％和91.2％(图5)。

前期黑暗培养对不接种菌根真菌的白及种子没有显著的促萌发形成幼苗的作用，相反还有明显的抑制作用；但对接种腊壳菌Sebacina sp.SL15-7 (CGMCC15690)的白及种子前期的暗培养有明显的促进萌发形成幼苗的作用 (图5)。

上述实验证实前10天黑暗培养，腊壳菌株Sebacina sp.SL15-7(CGMCC NO.15690)与白及种子共生萌发，能显著提高白及种子形成幼苗，而且方法简单易行。可以利用该菌株和白及种子共生萌发生产白及种苗。

Claims

1.一种促进白及种子萌发形成幼苗的菌株，其特征在于，所述菌株为一种腊壳菌属真菌菌株，该腊壳菌属真菌菌株为Sebacina sp.SL15-7，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15690。

2.根据权利要求1所述的促进白及种子萌发形成幼苗的菌株，其特征在于所述的腊壳菌属真菌菌株(CGMCC NO.15690)的生物学特征为：在PDA平板上培养10天后，其菌落呈浅黄色，略显放射状，不规则圆形发散生长，气生菌丝不发达，中等稀疏，光学显微镜下观察，菌丝具隔膜，粗3.5～5.0μm，分枝近直角，分枝处缢缩，距分枝不远处形成隔膜，老菌丝细胞壁有加厚现象，培养2周后开始形成串珠状的厚垣孢子，厚垣孢子数量不等，直径11.4～16.6μm。

3.根据权利要求1或2所述的腊壳菌属真菌菌株在促进白及种子萌发中的应用。

4.根据权利要求1或2所述的腊壳菌属真菌菌株在促进白及种子萌发形成幼苗中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的形成幼苗是指白及种子萌发形成至少一个叶片。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用包括以下步骤：

将消毒灭菌后的白及种子放入无菌琼脂悬浮液制成种子悬浮液，无菌状态下取种子悬浮液播种在培养后长满所述的腊壳菌属真菌菌株(CGMCC NO.15690)菌丝体的培养基上，进行培养。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述培养基为燕麦琼脂培养基。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的进行培养的条件为：将所述培养基置于人工培养箱内25±2℃，湿度40％～60％，在黑暗条件下培养，再在光照条件下培养。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

所述在黑暗条件下培养的时间为8～12天。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

所述在光照条件下培养的时间为10～20天；其中，光周期为12/12h L/D。