CN110872564A

CN110872564A - 一种野生木耳组织分离方法

Info

Publication number: CN110872564A
Application number: CN201911286779.7A
Authority: CN
Inventors: 宋冰; 陈艳琦; 李玉; 吕志文; 吕艳聪; 刘柱衫; 付永平
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2019-12-14
Filing date: 2019-12-14
Publication date: 2020-03-10

Abstract

本发明公开了一种野生木耳组织分离方法，它包括：1）收集木耳，除杂，在55~65℃下干燥，得到干耳；2）取干耳上0.3‑0.6cm²的组织，用头孢曲松钠酒精溶液浸泡3~5min，3）在22~28℃下避光培养3~4天，挑取菌丝尖端接种于PDA培养基；本发明有益效果：1）相较低温烘干（30℃及以下）及自然晒干节约了时间，并降低了由于非实验室环境而引起的污染率，提高了收集的野生木耳资源的成活率；2）操作过程仅以单一抗生素酒精溶液浸泡处理，且没有使用升汞等药品，操作无害且高效；3）本组织分离方法，接种第3天即可观察到菌丝萌发现象，再次纯化即可获得纯菌种；4）适用于目前广泛栽培的黑木耳、毛木耳，以及其他具有食药用价值的木耳类大型真菌。

Description

一种野生木耳组织分离方法

技术领域

本发明属于菌种分离技术领域，具体涉及一种野生木耳组织分离方法。

背景技术

野生种质资源可以作为优良的育种材料，筛选高抗性菌株；解决主栽品种退化的问题；丰富种质资源库、保护种质资源多样性；丰富基因资源、遗传多样性研究。木耳类野生种质资源的挖掘对木耳类食用菌产业发展的具有重要的意义。

木耳类食用菌食药用历史已久，于《神农本草经》、《名医别录》、《齐民要术》、《菌谱》等古籍均有记载。目前我国黑木耳、毛木耳产量位居第二，仅次于香菇，栽培面积广，在我国大部分地区均有栽培，也是出口量较高的特色蔬菜。

目前，木耳类食用菌栽培种品种繁多，但存在种质资源单一、同物异名等问题，此外，部分新的木耳种植区大多直接引种东北地区的菌种，缺乏适宜当地栽培的自有品种，这都限制了木耳产业的健康发展。通过采集和驯化不同地域的野生木耳种质资源，对选育宜栽的木耳新品种具有重要的作用和意义。

随着食用菌分离技术的发展，传统的木耳类组织分离方法有：菇木分离法、孢子分离法、鲜耳分离法、火焰分离法、干耳升汞分离法、干耳青霉素分离法，但这些方法操作过程复杂且会使用生汞、高锰酸钾等有害药剂，不仅增加了操作环节还会影响人体健康。近年来虽有添加抗生素对栽培黑木耳进行分离的报道，但缺少对野外采集新鲜的木耳种质资源获得方法的研究。因此一种能够高效获得野生种质资源的分离方法对丰富栽培木耳（遗传）种质库、驯化栽培新的种质资源、解决栽培品种退化问题、选育适合不同地区栽培的特有品种具有重要意义。

发明内容

本发明目的是为解决现有野生木耳组织分离方法污染率高、缺少木耳从采集到组织分离过程的规范操作和高效干制方法的问题，而提供一种野生木耳组织分离方法。

一种野生木耳组织分离方法，它包括：

1）收集木耳，除杂，在55~65℃下干燥，得到干耳；

2）取干耳上0.3-0.6cm²的组织，用头孢曲松钠酒精溶液浸泡3~5min，取出，迅速通过火焰2次，转入装有PDA培养基的平板培养皿中；

3）在22~28℃下避光培养3~4天，挑取菌丝尖端接种于PDA培养基；

步骤2）所述的头孢曲松钠酒精溶液，是头孢曲松钠在75%酒精中的浓度为13~18mg/ml；

步骤2）所述的PDA培养基，它的成分包括：土豆150~200g、葡萄糖15~25g、琼脂粉15g~20g、1L水；所述的土豆为无芽、去皮、切成1cm³的土豆；

所述的步骤3）在22~28℃下避光培养3天。

本发明提供了一种野生木耳组织分离方法，它包括：1）收集木耳，除杂，在55~65℃下干燥，得到干耳；2）取干耳上0.3-0.6cm²的组织，用头孢曲松钠酒精溶液浸泡3~5min，取出，迅速通过火焰2次，转入装有PDA培养基的平板培养皿中；3）在22~28℃下避光培养3~4天，挑取菌丝尖端接种于PDA培养基；本发明有益效果：1）相较低温烘干（30℃及以下）及自然晒干节约了时间，并降低了由于非实验室环境而引起的污染率，提高了收集的野生木耳资源的成活率；2）操作过程仅以单一抗生素酒精溶液浸泡处理，且没有使用升汞等药品，操作无害且高效；3）本组织分离方法，接种第3天即可观察到菌丝萌发现象，再次纯化即可获得纯菌种；4）适用于目前广泛栽培的黑木耳、毛木耳，以及其他具有食药用价值的木耳类大型真菌。

附图说明

图1 木耳组织块被PDA培养基淹没无法萌发；

图2 三份样品鲜耳、干耳及不同处理组织分离情况。

具体实施方式

实施例1 一种野生木耳组织分离方法

1）收集干耳：收集完整、无霉变、无虫害的木耳轻轻擦去表面杂物，放入热风烘干箱内烘干，设置烘干温度65℃，烘干4~8h后收集干耳；

2）组织分离：用无菌镊子去掉干耳耳片边缘较薄的组织，然后取0.3-0.6cm²大小组织，置于配好的头孢曲松钠酒精溶液中，浸泡3-5min，用镊子取出并迅速通过火焰两次，转入装有PDA培养基的平板培养皿中；

3）分离培养：将培养皿置于25℃恒温培养箱中避光培养，直到看到菌丝生长至培养基，挑取菌丝尖端接种于PDA培养基，长满后即可保存菌种；

所述的头孢曲松钠酒精溶液，是头孢曲松钠在75%酒精中的浓度为15mg/ml（每毫升75%酒精溶液中含有15mg头孢曲松钠）；

所述的PDA培养基，是将新鲜去皮土豆200g切成1cm³，使用1L RO水煮沸后过滤，称取葡萄糖20g、琼脂粉18g~20g，加入滤液煮沸后定容至1L，使用高压灭菌锅121℃灭菌30min，同时灭无菌水0.1ml；待灭菌完成后，取出培养基，放入超净工作台内，倒平板培养皿备用，12h后使用。

实施例2 毛木耳新鲜子实体的组织分离实例

1、木耳的收集和干燥

对采集于吉林农业大学的3份新鲜毛木耳的生境、着生树种等信息进行记录，选取完整、无霉变、无虫害的木耳轻轻擦去表面杂物，分别编号为JNYS1、JNYS2、JNYS3记录后放入自封袋内；将收集的标本放入热风烘干箱内烘干，设置烘干温度60℃，烘干5h后收集；

2、配制消毒剂

抽取5ml无菌水，注入头孢曲松钠药瓶，反复抽打至完全溶解，抽取3ml药液注入装有75%酒精的无菌玻璃平板中定容至40ml，配制成头孢曲松钠酒精溶液，反复抽打混匀，使头孢曲松钠在75%酒精中的浓度为15mg/ml；

3、制作PDA培养基

具体方法为：将新鲜去皮土豆200g切成1cm³，使用1L RO水煮沸后过滤，弃滤渣保留滤液，称取葡萄糖20g、琼脂粉18g-20g，加入滤液煮沸后定容至1L，使用高压灭菌锅121℃灭菌30min，同时灭无菌水0.1ml；待灭菌完成后，取出培养基，放入超净工作台内，倒平板培养皿，12h后使用；静置一段时间的原因是：组织分离应在培养基倒入平板后8~24h内使用，既可以防止因培养基表面湿度大使组织块被淹而无法萌发（图1），也可以为组织块泡发提供一定的湿度；

4、组织分离方法

1）使用无菌镊子去掉耳片边缘较薄的组织，然后取0.3-0.6cm²大小组织，置于配好的头孢曲松钠酒精溶液（消毒剂）中，浸泡3-5min，使用镊子取出并迅速通过火焰两次，转入装有PDA培养基的平板培养皿中，每个平板培养皿放置2-6个组织块，标记编号日期并封口，每编号接种至少5个平板；以75%酒精和无菌水浸泡作为头孢曲松钠酒精溶液的对照；

2）将接有组织块的平板置于25℃恒温培养箱避光培养，记录萌发率和污染率；接种3d后即可看到菌丝生长至培养基，并将有污染平板挑出；接种5d-7d，挑选菌丝浓密整齐的平板，挑取菌丝尖端接种于PDA培养皿或试管中标记编号日期并封口，长满后即可保存菌种；

步骤1）中限制组织大小，既可以防止组织块过小而增加夹取难度，也限制了组织块过大增加药液吸收量在通过酒精灯时易燃烧；

5、结果

结果如表1所示；由表可知，使用头孢曲松钠均能显著的抑制细菌污染率、提高野生木耳组织分离萌发率，虽然也会出现霉菌污染，但污染率低仍可获得分离样品纯菌丝，菌丝萌发情况见附图2；挑取萌发菌丝尖端接种于PDA培养皿中培养，提取DNA，以ITS通用引物ITS1/ITS4进行PCR验证，经过NCBI比对均为目标菌株。

。

Claims

1.一种野生木耳组织分离方法，它包括：

1）收集木耳，除杂，在60~65℃下干燥，得到干耳；

3）在22~28℃下避光培养3~4天，挑取菌丝尖端接种于PDA培养基。

2.根据权利要求1所述的一种野生木耳组织分离方法，其特征在于：步骤2）所述的头孢曲松钠酒精溶液，是头孢曲松钠在75%酒精中的浓度为13~18mg/ml。

3.根据权利要求2所述的一种野生木耳组织分离方法，其特征在于：步骤2）所述的PDA培养基，它的成分包括：土豆150~200g、葡萄糖15~25g、琼脂粉15g~20g、1L水；所述的土豆为无芽、去皮、切成1cm³的土豆。

4.根据权利要求3所述的一种野生木耳组织分离方法，其特征在于：所述的步骤3）在22~28℃下避光培养3天。