CN115975817A - 一种亮盖灵芝菌株l5478及其人工栽培方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种亮盖灵芝菌株L5478及其人工栽培方法，属于微生物技术领域。所述的亮盖灵芝新菌株L5478，已于2021年12月27日保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No：62107。本发明运用形态学和多基因联合分析，鉴定菌株L5478为亮盖灵芝，明确ITS、nrLSU、tef1‑α和rpb2基因序列作为识别该菌株的分子标记。本发明亮盖灵芝L5478菌株可在云南亚热带至温带区域正常出菇，分子标记可以准确的识别该菌株，为特色种质资源的保护和合理开发利用提供了可靠的数据支持和品种资源，且易于推广应用。

Description

一种亮盖灵芝菌株L5478及其人工栽培方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种亮盖灵芝菌株L5478及其人工栽培方法。

背景技术

灵芝(Ganoderma spp.)隶属于真菌界(Fungi)，担子菌门(Basidiomycota)，伞菌纲(Agaricomycetes)，多孔菌目(Polyporale)，灵芝菌科(Ganodermataceae)，灵芝属(Ganoderma)。广义的灵芝包括灵芝属的很多种类，例如：赤芝(Ganoderma lingzhi)、紫芝(Ganoderma sinense)、松杉灵芝(Ganoderma tsugae)、亮盖灵芝(Ganoderma lucidum)等，而狭义的灵芝特指具有药用价值且广泛栽培的种类。

自Donk1948年建立灵芝科以来，全世界已报道了该科的有效种类280余种。世界上灵芝科的种类主要分布在亚洲、澳洲、非洲及美洲的热带及亚热带，少数分布于温带。我国主要在跨热带至寒温带范围，灵芝科种类分布广且多，树舌(Ganoderma applanatum)和赤芝(Ganoderma lingzhi)是分布最广、数量最多的灵芝品种，在中国，树舌分布云南、贵州、海南、福建等27个省区、赤芝分布于云南、西藏、四川、广西等19个省区，但亮盖灵芝生长区域相对较狭窄，且野生资源较少，品种选育应用报道也较少。

我国灵芝的药用已经有2000多年的记载和应用历史，千百年来被国人视为能治百病的灵丹妙药，列入了中华九大仙草之一。20世纪50年代，从青岛采集的一号灵芝标本，经中国科学院微生物研究所研究人员驯化栽培，首次成功栽培灵芝。此后，灵芝在我国的栽培规模不断扩大，并迅速发展成为世界市场上灵芝的主要生产和出口国。至今，中国灵芝人工栽培已有60多年的历史，栽培技术也得到了进一步发展，规模越来越大，随之也出现了栽培品种、技术、模式和原料的多样化。目前进行人工栽培的品种主要有赤芝、紫芝和树舌等。亮盖灵芝最初在欧洲被描述，作为灵芝属的模式种，一直被认为是中国广泛栽培的赤芝品种，直到2012年我国科学研究工作者才发现，它与我国广泛栽培的赤芝并不是同一物种。亮盖灵芝在中国多个省区均有分布的报道，但品种选育和推广应用技术缺乏，种质资源保护工作滞后，开展相关研究非常必要。

本发明的亮盖灵芝菌株是在云南省楚雄州南华县采集并分离的新菌株，经研究，未见该菌种的研究报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有种质资源保护和栽培技术的不足，提供一种亮盖灵芝菌株L5478及其人工栽培方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种亮盖灵芝菌株L5478，已于2021年12月27日保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No：62107。本发明同时提供上述亮盖灵芝菌株L5478的人工栽培方法，包括如下步骤：

步骤(1)，菌种制作：取野生灵芝组织分离获得的母种采用母种培养基复壮后接种于原种培养瓶中扩大培养，待菌丝体长满培养瓶后，将原种续转接于栽培种容器中培养，菌丝体长满栽培种容器后，最后将栽培种转接入栽培料袋中，培养至菌丝体长满料袋；

步骤(2)，栽培管理：将步骤(1)获得的栽培袋搬运至栽培地，进行小孔开袋覆土栽培；

步骤(3)，子实体采收：待子实体长至成熟期，菌盖不再增大，菌盖的颜色从红棕色转为红褐色，漆样光泽明显，且菌盖仅有1-2mm淡黄色边缘时采收；

所述的母种培养基，包括按重量份数计如下组分：马铃薯198-202份、葡萄糖18-20份、蛋白胨2-3份、磷酸二氢钾0.19-0.21份、硫酸镁0.19-0.21份、琼脂16-17份，水998-1002份；

原种培养瓶中的原种料，包括按重量份数计如下组分：荞子59-61份、木屑19-21份、麦麸16-18份、糖1-2份、石膏1-2份、石灰1-2份；

栽培种容器中的栽培种料，包括按重量份数计如下组分：荞子10-15份、木屑70-75份、麦麸10-15份、糖1-2份、石膏1-2份、石灰1-2份；

栽培袋中的栽培料，包括按重量份数计如下组分：木屑76-78份、麦麸19-21份、石灰0.98-1.02份、石膏0.98-1.02份、白糖0.98-1.02份。

进一步，优选的是，步骤(1)的具体方法为：采用组织分离法获得亮盖灵芝L5478纯菌种，4℃低温冰箱保存；使用前4-6h将母种试管取出，放置20-25℃恒温暗培养箱活化，采用母种培养基复壮及扩繁，培养10-15天，制得平板母种，按1：10比例转接至原种培养瓶中扩大培养，22-25℃恒温暗培养25-30天，待菌丝体长满培养瓶后，将原种按1：20比例转接至栽培种培养容器中扩大培养，22-25℃恒温暗培养25-30天，待菌丝体长满培养容器后，将栽培种按1：40比例接入栽培袋中，20-25℃暗光培养40-50天、保持空气相对湿度50％-70％。

进一步，优选的是，步骤(2)的具体方法为：将长满菌丝的栽培菌袋搬运至栽培地，放置于阴凉的地方恢复养菌和后熟7-10天后，用开口工具在灵芝菌棒的上端棒肩处剪去上端菌袋塑料，开出2-5厘米小孔进行小孔开袋覆土栽培；

用机械或人工开0.80-1.20米宽，深0.10-0.20米，将栽培袋立袋放置，袋间距10-15cm进行摆袋，然后进行覆土，厚度3-5cm，覆土后进行亮盖灵芝出菇管理。

进一步，优选的是，亮盖灵芝出菇管理时，保持温度20-26℃，空气相对湿度80％-90％，菌袋覆土后6-8天开始喷水，从上午9:30-10:00气温升高开始喷，每次5分钟，1m²喷水量为0.3-0.4L，每天喷水5-6次。子实体完全开片后，每天空气对流通风3-5h，光照强度1000-4500Lx。

进一步，优选的是，在栽培袋埋袋前一个月，将准备种植灵芝大棚中的杂草清除，撒上一层石灰进行翻耕，暴晒，浇透水，在埋袋前5天再翻耕一次。

本发明以云南省楚雄州南华县为收集地，收集时间为2018年8月26日。项目组对采集样品开展形态学和多基因联合分析研究，确定了该菌株的分类学地位。并开展选择育种和分子标记研究，为特色种质资源保护和利用提供了可靠的依据。

本发明亮盖灵芝菌种L5478含有较高含量的灵芝多糖和灵芝三萜类化合物。采用《中华人民共和国药典》药用灵芝多糖、三萜含量检测方法进行检测，多糖含量在1.47％，三萜含量在3.12％。灵芝多糖具有广泛的药理活性，能降血糖，降血脂，抗血栓，抗氧化，清除自由基，抗衰老，抗辐射，抗肿瘤，促进血流循环，调节免疫，调节核酸、蛋白质代谢，促进DNA合成，促进人体脐血LAK细胞增殖。灵芝三萜类化合物具有抗炎、镇痛、镇静、抗衰老、毒杀肿瘤细胞、抗缺氧等作用。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明通过对云南省楚雄州南华县采集的灵芝样品进行形态学鉴定及分子生物学的研究。本发明结合ITS+LSU+TEF1-α+RPB2四个基因序列进行系统发育分析，拓扑结构最大似然法计算，得出分支节点支持率0.90，鉴定该菌株为亮盖灵芝(Ganoderma lucidum)，确定了该灵芝样品的分类学地位。同时，通过基因比对分析，确定了识别该菌株的分子标记，为菌株的知识产权保护提供了分子数据。

另外，本发明子实体组织分离培养获得纯菌株并进行选择育种研究，为西南地区灵芝种质资源鉴定评价与开发利用提供理论依据和技术支撑。

本发明丰富了云南亮盖灵芝种质资源，亮盖灵芝菌株L5478经选择育种，商品性状优异，通过小孔开袋法进行袋料覆土栽培，L5478整芝干重为48.1g，菌盖直径为16.8cm，菌盖厚度为2.0cm，平均多糖含量为1.47％，三萜含量在3.12％，经选择育种后的亮盖灵芝L5478功能成分多糖、三萜含量均略高于野生菌株，野生菌株多糖含量为1.46％，三萜含量为3.06％。本发明为种质资源保护和开发利用提供了可靠的依据，易于推广应用。

附图说明

图1为亮盖灵芝菌株L5478形态学鉴定结果图；a，b：上表面；c：下表面；d：下表面的菌孔；e：切割面；f，i：皮层细胞；g，j：骨架菌丝；h：联络菌丝；k-n：担孢子；

图2为基于ITS+LSU+TEF1-α+RPB2序列分析构建的灵芝系统发育树；

图3为亮盖灵芝L5478菌株栽培结果图；其中，a.栽培菌袋；b.菌丝扭结原基萌发；c.原基形成；d.原基开始分化子实体菌盖；e.成形及半成熟子实体；f.成熟子实体。

本发明亮盖灵芝菌株L5478(Ganoderma luicdum)，已于2021年12月27日保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No：62107，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1

亮盖灵芝菌株L5478的人工栽培方法，包括如下步骤：

步骤(1)，菌种制作：取野生灵芝组织分离获得的母种采用母种培养基复壮后接种于原种培养瓶中扩大培养，待菌丝体长满培养瓶后，将原种续转接于栽培种容器中培养，菌丝体长满栽培种容器后，最后将栽培种转接入栽培料袋中，培养至菌丝体长满料袋；

步骤(2)，栽培管理：将步骤(1)获得的栽培袋搬运至栽培地，进行小孔开袋覆土栽培；

步骤(3)，子实体采收：待子实体长至成熟期，菌盖不再增大，菌盖的颜色从红棕色转为红褐色，漆样光泽明显，且菌盖仅有1-2mm淡黄色边缘时采收；

所述的母种培养基，包括按重量份数计如下组分：马铃薯200份、葡萄糖19份、蛋白胨2.3份、磷酸二氢钾0.2份、硫酸镁0.2份、琼脂16.7份，水999份；

原种培养瓶中的原种料，包括按重量份数计如下组分：荞子60份、木屑20份、麦麸17份、糖1.5份、石膏1.2份、石灰1.3份；

栽培种容器中的栽培种料，包括按重量份数计如下组分：荞子14份、木屑75份、麦麸12份、糖1.5份、石膏1.4份、石灰1.8份；

栽培袋中的栽培料，包括按重量份数计如下组分：木屑77份、麦麸20份、石灰1份、石膏1份、白糖1份。

实施例2

亮盖灵芝菌株L5478的人工栽培方法，包括如下步骤：

步骤(1)，菌种制作：取野生灵芝组织分离获得的母种采用母种培养基复壮后接种于原种培养瓶中扩大培养，待菌丝体长满培养瓶后，将原种续转接于栽培种容器中培养，菌丝体长满栽培种容器后，最后将栽培种转接入栽培料袋中，培养至菌丝体长满料袋；

步骤(2)，栽培管理：将步骤(1)获得的栽培袋搬运至栽培地，进行小孔开袋覆土栽培；

步骤(3)，子实体采收：待子实体长至成熟期，菌盖不再增大，菌盖的颜色从红棕色转为红褐色，漆样光泽明显，且菌盖仅有1-2mm淡黄色边缘时采收；

所述的母种培养基，包括按重量份数计如下组分：马铃薯198份、葡萄糖18份、蛋白胨2份、磷酸二氢钾0.19份、硫酸镁0.19份、琼脂16份，水998份；

原种培养瓶中的原种料，包括按重量份数计如下组分：荞子59份、木屑19份、麦麸16份、糖1份、石膏1份、石灰1份；

栽培种容器中的栽培种料，包括按重量份数计如下组分：荞子10份、木屑70份、麦麸10份、糖1份、石膏1份、石灰1份；

栽培袋中的栽培料，包括按重量份数计如下组分：木屑76份、麦麸19份、石灰0.98份、石膏0.98份、白糖0.98份。

步骤(1)的具体方法为：采用组织分离法获得亮盖灵芝L5478纯菌种，4℃低温冰箱保存；使用前4h将母种试管取出，放置20℃恒温暗培养箱活化，采用母种培养基复壮及扩繁，培养10天，制得平板母种，按1：10比例转接至原种培养瓶中扩大培养，22℃恒温暗培养25天，待菌丝体长满培养瓶后，将原种按1：20比例转接至栽培种培养容器中扩大培养，22℃恒温暗培养25天，待菌丝体长满培养容器后，将栽培种按1：40比例接入栽培袋中，20℃暗光培养40天、保持空气相对湿度50％-70％。

步骤(2)的具体方法为：将长满菌丝的栽培菌袋搬运至栽培地，放置于阴凉的地方恢复养菌和后熟7天后，用开口工具在灵芝菌棒的上端棒肩处剪去上端菌袋塑料，开出2-5厘米小孔进行小孔开袋覆土栽培；

用机械或人工开0.80米宽，深0.10米，将栽培袋立袋放置，袋间距10cm进行摆袋，然后进行覆土，厚度3cm，覆土后进行亮盖灵芝出菇管理。

亮盖灵芝出菇管理时，保持温度20-26℃，空气相对湿度80％-90％，菌袋覆土后6天开始喷水，从上午9:30-10:00气温升高开始喷，每次5分钟，1m²喷水量为0.3L，每天喷水5次。子实体完全开片后，每天空气对流通风3h，光照强度1000-4500Lx。

在栽培袋埋袋前一个月，将准备种植灵芝大棚中的杂草清除，撒上一层石灰进行翻耕，暴晒，浇透水，在埋袋前5天再翻耕一次。

实施例3

亮盖灵芝菌株L5478的人工栽培方法，包括如下步骤：

步骤(1)，菌种制作：取野生灵芝组织分离获得的母种采用母种培养基复壮后接种于原种培养瓶中扩大培养，待菌丝体长满培养瓶后，将原种续转接于栽培种容器中培养，菌丝体长满栽培种容器后，最后将栽培种转接入栽培料袋中，培养至菌丝体长满料袋；

步骤(2)，栽培管理：将步骤(1)获得的栽培袋搬运至栽培地，进行小孔开袋覆土栽培；

步骤(3)，子实体采收：待子实体长至成熟期，菌盖不再增大，菌盖的颜色从红棕色转为红褐色，漆样光泽明显，且菌盖仅有1-2mm淡黄色边缘时采收；

所述的母种培养基，包括按重量份数计如下组分：马铃薯202份、葡萄糖20份、蛋白胨3份、磷酸二氢钾0.21份、硫酸镁0.21份、琼脂17份，水1002份；

原种培养瓶中的原种料，包括按重量份数计如下组分：荞子61份、木屑21份、麦麸18份、糖2份、石膏2份、石灰2份；

栽培种容器中的栽培种料，包括按重量份数计如下组分：荞子15份、木屑75份、麦麸15份、糖2份、石膏2份、石灰2份；

栽培袋中的栽培料，包括按重量份数计如下组分：木屑78份、麦麸21份、石灰1.02份、石膏1.02份、白糖1.02份。

步骤(1)的具体方法为：采用组织分离法获得亮盖灵芝L5478纯菌种，4℃低温冰箱保存；使用前6h将母种试管取出，放置25℃恒温暗培养箱活化，采用母种培养基复壮及扩繁，培养15天，制得平板母种，按1：10比例转接至原种培养瓶中扩大培养，25℃恒温暗培养30天，待菌丝体长满培养瓶后，将原种按1：20比例转接至栽培种培养容器中扩大培养，225℃恒温暗培养30天，待菌丝体长满培养容器后，将栽培种按1：40比例接入栽培袋中，25℃暗光培养50天、保持空气相对湿度50％-70％。

步骤(2)的具体方法为：将长满菌丝的栽培菌袋搬运至栽培地，放置于阴凉的地方恢复养菌和后熟10天后，用开口工具在灵芝菌棒的上端棒肩处剪去上端菌袋塑料，开出2-5厘米小孔进行小孔开袋覆土栽培；

用机械或人工开1.20米宽，深0.20米，将栽培袋立袋放置，袋间距15cm进行摆袋，然后进行覆土，厚度5cm，覆土后进行亮盖灵芝出菇管理。

亮盖灵芝出菇管理时，保持温度20-26℃，空气相对湿度80％-90％，菌袋覆土后8天开始喷水，从上午9:30-10:00气温升高开始喷，每次5分钟，1m²喷水量为0.4L，每天喷水6次。子实体完全开片后，每天空气对流通风5h，光照强度1000-4500Lx。

在栽培袋埋袋前一个月，将准备种植灵芝大棚中的杂草清除，撒上一层石灰进行翻耕，暴晒，浇透水，在埋袋前5天再翻耕一次。

实施例4

亮盖灵芝菌株L5478的人工栽培方法，包括如下步骤：

步骤(1)，菌种制作：取野生灵芝组织分离获得的母种采用母种培养基复壮后接种于原种培养瓶中扩大培养，待菌丝体长满培养瓶后，将原种续转接于栽培种容器中培养，菌丝体长满栽培种容器后，最后将栽培种转接入栽培料袋中，培养至菌丝体长满料袋；

步骤(2)，栽培管理：将步骤(1)获得的栽培袋搬运至栽培地，进行小孔开袋覆土栽培；

步骤(3)，子实体采收：待子实体长至成熟期，菌盖不再增大，菌盖的颜色从红棕色转为红褐色，漆样光泽明显，且菌盖仅有1-2mm淡黄色边缘时采收；

所述的母种培养基，包括按重量份数计如下组分：马铃薯200份、葡萄糖19份、蛋白胨2.5份、磷酸二氢钾0.2份、硫酸镁0.2份、琼脂16.5份，水1000份；

原种培养瓶中的原种料，包括按重量份数计如下组分：荞子60份、木屑20份、麦麸17份、糖1.5份、石膏1.5份、石灰1.5份；

栽培种容器中的栽培种料，包括按重量份数计如下组分：荞子12份、木屑72份、麦麸12份、糖1.5份、石膏1.5份、石灰1.5份；

栽培袋中的栽培料，包括按重量份数计如下组分：木屑77份、麦麸20份、石灰1份、石膏1份、白糖1份。

步骤(1)的具体方法为：采用组织分离法获得亮盖灵芝L5478纯菌种，4℃低温冰箱保存；使用前5h将母种试管取出，放置22℃恒温暗培养箱活化，采用母种培养基复壮及扩繁，培养12天，制得平板母种，按1：10比例转接至原种培养瓶中扩大培养，23℃恒温暗培养28天，待菌丝体长满培养瓶后，将原种按1：20比例转接至栽培种培养容器中扩大培养，24℃恒温暗培养26天，待菌丝体长满培养容器后，将栽培种按1：40比例接入栽培袋中，23℃暗光培养45天、保持空气相对湿度50％-70％。

步骤(2)的具体方法为：将长满菌丝的栽培菌袋搬运至栽培地，放置于阴凉的地方恢复养菌和后熟8天后，用开口工具在灵芝菌棒的上端棒肩处剪去上端菌袋塑料，开出2-5厘米小孔进行小孔开袋覆土栽培；

用机械或人工开1米宽，深0.15米，将栽培袋立袋放置，袋间距12cm进行摆袋，然后进行覆土，厚度4cm，覆土后进行亮盖灵芝出菇管理。

亮盖灵芝出菇管理时，保持温度20-26℃，空气相对湿度80％-90％，菌袋覆土后7天开始喷水，从上午9:30-10:00气温升高开始喷，每次5分钟，1m²喷水量为0.5L，每天喷水5次。子实体完全开片后，每天空气对流通风4h，光照强度1000-4500Lx。

在栽培袋埋袋前一个月，将准备种植灵芝大棚中的杂草清除，撒上一层石灰进行翻耕，暴晒，浇透水，在埋袋前5天再翻耕一次。

应用实例

1试验材料与方法

1.1样品来源

采摘于云南省楚雄州南华县楚雄州南华县虎头山野生灵芝标本，通过组织分离法，分离获得菌株保存，标本和菌株编号：L5478。

1.2仪器与试剂

1.2.1主要仪器设备

主要的仪器设备：尺子，比色卡，解剖镜，移液枪，离心机，磁力粉碎机，水浴锅，电子天平，微波炉，硅胶板，电泳池，凝胶成像分析仪。

1.2.1主要试剂材料

主要的试剂：FG1，FG2，RNA酶，FG3，Wash Buffer，E Buffer，ITS4，ITS5，去离子水，MIX，DNA，琼脂糖，TBE，核酸染料(具体参照北京擎科新业生物技术有限公司试剂盒)。

1.3形态学鉴定

通过宏观形态鉴定与微观形态鉴定对L5478菌株进行形态学初步鉴定。

1.3.1宏观形态鉴定

用尺子、比色卡与解剖镜观察灵芝宏观形态。宏观形态主要包括：菌盖的形状、大小(菌盖长度，宽度，厚度)，菌盖上表面，下表面的颜色，菌柄着生方式，厚度，长度，颜色，质地；菌肉颜色，质地，厚度；菌管密集程度。

1.3.2微观形态学鉴定

微观形态观察主要采用徒手切片法，获取少量组织，分别置于滴有棉蓝试剂和碘试剂的玻片上，压片加以观察。先将玻片放置10倍镜下，找到需要观察的部位后，逐渐扩大放大倍数，后用100倍油镜观察。需要观察的微观形态主要包括：孢子的形态、颜色、大小以及是否有脐状突起和平截现象；皮壳细胞形态、颜色与大小；担子和拟担子的形态与大小；菌肉和菌管菌丝的种类、形态与粗度。记录所观察到的数据，担孢子大小数据至少要测量30个，本发明所测得的孢子大小均包括外壁。

1.4分子生物学鉴定

1.4.1DNA提取

a、处理样品，将灵芝子实体撕开，用消过毒的手术刀在撕开部位取一小块子实体放在2mL离心管中，加600μL的FG1并加入3颗直径0.3mm的小钢珠，用磁力粉碎机进行粉碎。

b、加5μL的RNA酶→振荡均匀→水浴10分钟(水浴温度65℃)。

c、加FG2 140μL→冰浴5min→离心10min(转数r为10000r/min)。

d、移液枪吸取上清液650-700μL注入2mL离心管中，加入340μL FG3→加900μL无水乙醇(99.9％)，充分颠倒混匀，吸取800μL注入有膜的1.5mL离心管中→离心1min(转数r为10000r/min)。DNA吸附在膜上，除去滤液，多次重复，直到滤液滤完。

e、加Wash Buffer 600μL进行洗脱，洗脱2次，离心1min(转数r为12000r/min)。再离心5min(空离)，将离心管打开，室温放置几分钟，晾干残留的Wash Buffer。

f、加入E Buffer 50μL，离心3min(1.5mL离心管，转数r为12000r/min)，收集DNA溶液。放-20℃冰箱中保存。

1.4.2PCR扩增

PCR的每个循环过程包括高温变性、低温退火、中温延伸三个不同的事件。高温变性：加热使模板DNA在高温下(94℃左右)双链间的氢键断裂而形成两条单链；低温退火：使溶液温度降至50-60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合；中温延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)，按5'-3'方向复制出互补DNA。选择的四个基因片段：ITS、LSU、TEF-1a和RBP2，具体引物的碱基组成如下：

ITS引物对：

ITS1-F：5'-cttggtcatttagaggaagtaa-3'；(SEQ ID NO.1)

ITS4：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'；(SEQ ID NO.2)

nLSU引物对：

LR0R：5'-acccgctgaacttaagc-3'；(SEQ ID NO.3)

LR5：5'-tcctgagggaaacttcg-3'；(SEQ ID NO.4)

TEF-1α引物对：

983F：5'-gcyccygghcaycgtgayttyat-3'；(SEQ ID NO.5)

1567R：5'-achgtrccrataccaccratctt-3'；(SEQ ID NO.6)

RBP2引物对：

fRrbp2-6F：5'-tggggyatggtntgyccygc-3'；(SEQ ID NO.7)

fRrbp2-7cR：5'-cccatrgcttgyttrcccat-3'。(SEQ ID NO.8)

注：碱基包括a、t、c、g，引物中出现其他字母代表简并碱基。

用于扩增的PCR反应体系为：去离子水9.5uL、Mix 12.5uL、正向引物1uL(浓度为100pmol/μl)、反向引物1uL(浓度为100pmol/μl)、DNA 1uL，总计25uL；PCR扩增程序设置为：95℃预变性3min、(95℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸1min)35cycles、72℃延伸5min。扩增结果4℃冰箱保存。

1.4.3琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖1g/100mL，0.5×TBE(10×TBE用蒸馏水稀释)。用量筒量取50ml的TBE放入烧杯，用万分之一的电子天平称取0.5g琼脂糖放入盛有TBE的烧杯中，用玻璃杯搅拌溶解，微波炉中火加热2.5分钟，溶液澄清透明时取出；冷却到65℃左右，加入1μL核酸染料，摇荡混匀，倒入硅胶板制模；冷却后取出放入电泳池，用容量为10μL移液枪点样，点样量为4μL，电压160v，电流80毫安，跑25分钟。使用凝胶成像分析仪中紫外检测是否有DNA条带以及看条带大小和明亮程度，进行图像采集记录结果，阳性产物送样检测，检测所提取的DNA浓度。

1.4.4产物测序

将PCR扩增产物送样双向测序(生工生物工程上海股份有限公司)。

1.4.5系统发育数据分析

将测序所获得的DNA序列在CNBI数据库中进行BLAST相似性检索，从全部的同源性序列对比中筛选出同源性较高的序列。

1.5菌种制作

1.5.1菌株获取及配方选择

采用组织分离法获取纯菌种，用酒精灯把手术刀高温消毒，冷却后，将灵芝子实体撕开，用手术刀切灵芝内部0.2-0.3厘米大小的组织块放入母种培养基中，用专用的封口膜把平板封好，放入温度23℃的恒温箱里面培养，培养期间，注意观察，及时挑出污染或生长慢的菌株，转接培养2-3代，纯化出长势好、活力强的母种菌株，用消毒的手术刀取一部分放入装有PDA斜面培养基的试管中，放进23℃恒温培养箱培养，当菌丝长满时，放入4.0℃冰箱保存菌株。

采用三级制种法(即：母种、原种、栽培种)开展亮盖灵芝菌株L5478的驯化栽培研究。

母种培养基：按重量份数计，马铃薯198-202份、葡萄糖18-20份、蛋白胨2-3份、磷酸二氢钾0.19-0.21份、硫酸镁0.19-0.21份、琼脂16-17份，水998-1002份

原种料，按重量份数计，荞子59-61份、木屑19-21份、麦麸16-18份、糖1-2份、石膏1-2份、石灰1-2份；

栽培种料，按重量份数计，荞子10-15份、木屑70-75份、麦麸10-15份、糖1-2份、石膏1-2份、石灰1-2份；

栽培料，按重量份数计，木屑76-78份、麦麸19-21份、石灰0.98-1.02份、石膏0.98-1.02份、白糖0.98-1.02份；

1.5.2母种扩繁

(1)制作培养基

制备母种培养基：200g削皮马铃薯剁碎加水至1L煮透之后用纱布过滤去马铃薯残渣得到马铃薯淀粉液，将其转移到1.5L或2.0L的三角瓶种，依次加入琼脂18g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，磷酸二氢钾0.2g，硫酸镁0.2g，再加水定容至1.0L，盖上专用石棉网纸，用橡筋扎紧。高温高压，121℃灭菌20min，气压降为0时取出，在超净工作台上，酒精灯旁倒入直径5cm平板中，倒入量为培养皿的1/3容积，冷却待用。

(2)母种复壮及扩繁

将保存的灵芝菌株取出，用消过毒的钩针取出玉米粒大小的组织块放进母种培养基，封口膜封好，23℃恒温暗培养复壮，挑选出菌丝体生长快，菌落边缘整齐，活力旺的培养物进行母种扩繁。

1.5.3原种制备

提前12h进行原料处理，将原种实验配方需要用到的荞子、杂木屑(干重)，进行称量，分别加入重量比1份石灰(该石灰不计入配方用量，其加入目的是防止原料酸败)用大盆进行浸泡。

将浸泡透的荞子清洗之后，放入较大盆中，加入滤去石灰水的木屑，放入麦麸、白糖拌匀后，加入石灰和石膏调pH至pH＝8，水分含量在55％-60％(用手捏，手指周围有水，但没有水滴滴下为宜。将混合均匀的培养料装进规格为(8cm*11cm)的原种瓶内。

将原种瓶周围擦洗干净，盖上封口膜，在放上2层报纸用橡皮筋扎紧，放在高压蒸汽灭菌锅灭菌，121℃、0.103MPa，2h。灭菌完成，气压降为0时，打开放气阀，放完气之后，打开灭菌锅，取出原种瓶，在预冷室冷却备用。

接种时，将冷却的原种瓶抬进接种室，打开超净工作台和接种室的紫外灯消毒20分钟，待臭氧气味散去，打开超净工作台的无菌风，并用体积浓度为75％的酒精棉擦手和超净台。点燃酒精灯，将用酒精棉擦拭过的手术刀烧透，冷却之后，将平板封口膜去掉，用手术刀将培养皿中菌丝体划成8等份，在无菌区域(酒精灯10cm范围内)打开原种瓶，把接种块放入原种瓶，盖上取下的封口膜和报纸，橡皮筋扎紧，接种瓶瓶身写上标签，放入培养室培养(培养室温度23-25℃)，CO₂浓度低于0.05％，避光暗培养。

1.5.4栽培种制备

提前12h进行原料处理，将栽培种料配方中需要用到的荞子、杂木屑(干重)，进行称量，分别加入重量比1份石灰(该石灰不计入配方用量，其加入目的是防止原料酸败)用大盆进行浸泡。

将浸泡透的荞子清洗之后，放入较大盆中，加入滤去石灰水的木屑，放入麦麸、白糖拌匀后，加入石灰和石膏调pH至pH＝8，水分含量在55％-60％(用手捏，手指周围有水，但没有水滴滴下为宜。将混合均匀的培养料装进规格为500mL的菌种瓶内。

将菌种瓶周围擦洗干净，盖上封口膜，在放上2层报纸用橡皮筋扎紧，放在高压蒸汽灭菌锅灭菌，121℃、0.103MPa，2h。灭菌完成，气压降为0时，打开放气阀，放完气之后，打开灭菌锅，取出菌种瓶，在预冷室冷却备用。

接种时，将冷却的菌种瓶抬进接种室，打开超净工作台和接种室的紫外灯紫外消毒20分钟，待臭氧气味散去，打开超净工作台的无菌风，并用体积浓度为75％的酒精棉擦手和超净台。点燃酒精灯，将用酒精棉擦拭过的接种铲烧透，冷却之后，将原种瓶封口膜去掉，用接种铲将原种的菌种块在无菌区域放入菌种瓶内，盖上封口膜和报纸，橡皮筋扎紧，瓶身写上标签，放入培养室培养(培养室温度23-25℃)，CO₂浓度低于0.05％，避光暗培养。

1.5.5栽培种制备

将木屑加工为0.5到0.8cm大小，预先浸水24h，使之浸湿泡透，防止成为污染源。将培养料按栽培袋配方进行称料，拌料，初始pH为8，含水量在55％-60％，(辨别方法，取一把拌好的料，用手用力挤压，有水渗出，但不会滴下为宜)。培养料用装袋窝口一体机装填于17cm×35cm×0.05cm聚丙烯折角塑料袋，检查无破损袋后放入铁框，放入时注意不要造成磨损，以免污染。

接种工作台处理，在接种前、后必须清洁台面，要用体积浓度为75％酒精棉花轻擦工作台。接种工具高温高压灭菌，在烘箱烘干备用，工作服定期清洗，并进行紫外灭菌。料袋需在紫外灯下消毒处理30min。料袋必须进行预冷冷却至25℃以下方可接种。操作前必须洗手，佩戴无菌手套，进入操作间就不能随意出入。菌种瓶口用体积浓度为75％的酒精棉擦拭，之后用酒精灯烧一下瓶口，方可接种；接种时，拔掉引孔棒，放入菌种，迅速盖上小海绵。菌种不能长期置于接种操作台外，会导致污染，每接完一袋菌种后，必须用体积浓度为75％酒精棉签擦拭操作工具，然后用酒精灯烧透，冷却至室温后再接种。接种完成之后，要用专用拖把把接种室拖干净，在地面喷洒一些消毒液。

将接完种的菌包放入菌棒培养室进行培养。培养温度在22-26℃，4天左右菌丝开始萌发，15天左右可在表层看到菌丝长出，30-40天菌丝长满菌包。在培养时发现污染的及时清除，以免污染其他菌包。培养室有良好的通风条件，内置空调，便于调节温度，直立码放时，菌包与菌包之间间隔3-5cm，墙式码放时码三层左右，过高会发热，影响菌丝发育。培养室要按时消毒，使用菌类专用的消毒剂，以减少污染。

1.6栽培

1.6.1栽培前准备

在埋袋前一个月，将准备种植灵芝的大棚内的杂草清除，撒上石灰进行翻耕，暴晒，浇水，在种植前5天再翻耕一次。

1.6.2具体栽培

菌袋30-40天即可完成发菌，发菌完成搬运至栽培地，将菌袋放置于阴凉干燥的地方养菌后熟7-10天后。用机械或人工开0.80-1.20米宽，深0.10-0.20米，长度依场地而定的种植槽。栽培方式主要以小孔开袋覆土栽培为主。用开口工具在灵芝菌棒的上端棒肩处剪去上端菌袋塑料，开出小孔进行袋口覆土栽培。竖立排放在菌床上，保持间距3-5cm，行距8-15cm；然后覆盖土壤填充，覆土厚度3-5cm。

1.6.3出芝管理

催蕾及出蕾管理：温度保持20-26℃，空气相对湿度80％-90％；每天上下午各通风2h，7-10d可形成白色原基。菌蕾分化初期，根据商品需求，可去除部分劣质芝芽。

湿度管理：菌蕾形成至开片时，定时向大棚空间雾化喷水，保持地表土壤湿度，使空间相对湿度保持在80％-95％，子实体开片基本开足，菌盖边缘稍有黄色时，空气湿度保持75％-85％，子实体趋于成熟，空气相对湿度保持60％以上。

温度管理：原基分化和子实体发育的最适温度为22-26℃，菌丝生长阶段，温度控制在22℃，可促使菌蕾形成，子实体趋于成熟时，适宜温度为24-28℃。

光照及通风管理：子实体完全开片后，每天空气对流通风3-5h，以降低二氧化碳浓度。光照一般采取“三分阳七分阴”原则，保持均匀散射光，光线强度1000-5000Lx。

待子实体长至成熟期，菌盖不再增大，菌盖的颜色从红棕色转为红褐色，漆样光泽明显，且菌盖仅有1-2mm淡黄色边缘时采收。

2结果与分析

2.1形态学鉴定结果

通过形态学鉴定，如图1所示，发现编号L5478号灵芝：子实体稍大，菌盖长为13cm，宽6cm，近柄处厚1.8cm，菌盖多变，为匙形至圆形，菌盖上表面从边缘至中部颜色逐渐加深从红褐色到棕褐色，呈环纹状，有漆样光泽。菌柄为紫褐色侧生，近圆形，菌柄长12cm，菌柄直径1cm，菌肉白色至淡黄色，下表面奶油色，管孔面浅黄色，平均每毫米4-6个，硬木栓质，菌柄近表皮有一薄的深褐色皮层。

担孢子为广卵圆形，脐状突起不明显，黄褐色顶端平截，孢子颜色为深褐色联络菌丝无色，呈树枝状分叉，壁薄且腔窄，直径2-3微米；生殖菌丝无色，透明没有分叉，壁薄腔薄，直径1-2.5微米；骨架菌丝，呈浅棕蓝色，条状弯曲，菌丝壁较厚，直径3-4微米。形态学初步鉴定该灵芝为亮盖灵芝。

2.2分子生物学鉴定结果

2.2.1凝胶电泳结果

将灵芝菌丝体提取DNA后，通过PCR扩增和凝胶电泳的检测，在其紫外投影中看到了目的条带，并将扩增产物送至生工生物工程上海股份有限公司进行测序。

2.2.2基于ITS+LSU+TEF1-α+RPB2系统发育树分析

基于ITS+LSU+TEF1-α+RPB2构建灵芝属系统发育树，编号：L5478的灵芝与亮盖灵芝(Ganoderma lucidum KU572485)聚在一支(如图2)，因此，结合形态学特征，确定L5478菌株为亮盖灵芝。其ITS、nrLSU、tef1-α和rpb2基因序列如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示。

2.3栽培结果

通过优选的栽培基质和小孔开袋的栽培方式进行生产培养，以菌袋均重1.1kg菌袋种植L5478亮盖灵芝菌袋200袋，从种植到现原基子实体周期为26d，分化菌盖周期为44d，部分子实体60d左右可成熟，菌袋产量平均鲜重153g，出菇产量可观，出菇整齐。从商品性状看，菌盖肥厚色泽鲜艳，生长健壮(见图3)，认为，该菌株可继续扩大人工栽培研究。

对亮盖灵芝菌株L5478的栽培基质进行配方优化，栽培料基质中，按重量份数计，固定石灰1份、石膏1份、白糖1份，以木屑和麦麸不同质量比生产栽培菌袋各200袋(具体见表1)，不同栽培基质收获亮盖灵芝L5478子实体产量及功能成分含量见表1，栽培基质配方对亮盖灵芝L5478产量及功能成分含量均有较大影响。通过对比可知，亮盖灵芝菌株L5478最优选的栽培基质配方为：按重量份数计，木屑77份、麦麸20份、石灰1份、石膏1份、白糖1份。

表1亮盖灵芝L5478不同栽培基质收获子实体产量及功能成分对比

亮盖灵芝菌株L5478菌包栽培时采用全脱袋、小孔开袋、半脱袋、上开口四种不同的方式各栽培200袋菌包，采用不同方式栽培的亮盖灵芝L5478农艺性状有较大差异(见表2)，其中平均鲜重和干重最高的为小孔开袋方式栽培的灵芝，分别为153g和48.1g，并且小孔开袋方式栽培的亮盖灵芝L5478菌盖肥大，菌柄粗壮，菌盖长度平均可达16.8cm，菌盖厚度平均2.0cm。不同栽培方式对比可知，亮盖灵芝L5478最佳栽培方式为小孔开袋栽培。

表2亮盖灵芝菌株L5478不同驯化栽培方式农艺性状对比

注：种植方法包括qt(全脱袋)，td(开小孔)，bt(半脱袋)，st(上开口)四种方式。

本发明通过对云南省楚雄州南华县采集的灵芝样品进行形态学鉴定和分子生物学研究，确定了该灵芝样品的分类学地位，确定了亮盖灵芝L5478菌株的分子标记。同时进行了选择育种研究，确定了菌株的栽培技术，为菌种知识产权保护和合理开发利用提供了可靠依据。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

SEQ ID NO.9

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SEQ ID NO.10

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SEQ ID NO.11

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SEQ ID NO.12

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Claims (6)

1.一种亮盖灵芝菌株L5478，其特征在于，已于2021年12月27日保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No：62107。

2.权利要求1所述的亮盖灵芝菌株L5478的人工栽培方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），菌种制作：取野生灵芝组织分离获得的母种采用母种培养基复壮后接种于原种培养瓶中扩大培养，待菌丝体长满培养瓶后，将原种续转接于栽培种容器中培养，菌丝体长满栽培种容器后，最后将栽培种转接入栽培料袋中，培养至菌丝体长满料袋；

步骤（2），栽培管理：将步骤（1）获得的栽培袋搬运至栽培地，进行小孔开袋覆土栽培；

步骤（3），子实体采收：待子实体长至成熟期，菌盖不再增大，菌盖的颜色从红棕色转为红褐色，且菌盖仅有1-2mm淡黄色边缘时采收；

所述的母种培养基，包括按重量份数计如下组分：马铃薯198-202份、葡萄糖18-20份、蛋白胨2-3份、磷酸二氢钾0.19-0.21份、硫酸镁0.19-0.21份、琼脂16-17份，水998-1002份；

原种培养瓶中的原种料，包括按重量份数计如下组分：荞子59-61份、木屑19-21份、麦麸16-18份、糖1-2份、石膏1-2份、石灰1-2份；

栽培种容器中的栽培种料，包括按重量份数计如下组分：荞子10-15份、木屑70-75份、麦麸10-15份、糖1-2份、石膏1-2份、石灰1-2份；

栽培袋中的栽培料，包括按重量份数计如下组分：木屑76-78份、麦麸19-21份、石灰0.98-1.02份、石膏0.98-1.02份、白糖0.98-1.02份。

3.根据权利要求2所述的亮盖灵芝菌株L5478的人工栽培方法，其特征在于，步骤（1）的具体方法为：采用组织分离法获得亮盖灵芝L5478纯菌种，4℃低温冰箱保存；使用前4-6h将母种试管取出，放置20-25℃恒温暗培养箱活化，采用母种培养基复壮及扩繁，培养10-15天，制得平板母种，按1：10比例转接至原种培养瓶中扩大培养，22-25℃恒温暗培养25-30天，待菌丝体长满培养瓶后，将原种按1：20比例转接至栽培种培养容器中扩大培养，22-25℃恒温暗培养25-30天，待菌丝体长满培养容器后，将栽培种按1：40比例接入栽培袋中，20-25℃暗光培养40-50天、保持空气相对湿度50%-70%。

4.根据权利要求2所述的亮盖灵芝菌株L5478的人工栽培方法，其特征在于，步骤（2）的具体方法为：将长满菌丝的栽培菌袋搬运至栽培地，放置于阴凉的地方恢复养菌和后熟7-10天后，用开口工具在灵芝菌棒的上端棒肩处剪去上端菌袋塑料，开出2-5厘米小孔进行小孔开袋覆土栽培；

用机械或人工开0.80-1.20米宽，深0.10-0.20米，将栽培袋立袋放置，袋间距10-15cm进行摆袋，然后进行覆土，厚度3-5cm，覆土后进行亮盖灵芝出菇管理。

5.根据权利要求4所述的亮盖灵芝菌株L5478的人工栽培方法，其特征在于，亮盖灵芝出菇管理时，保持温度20-26℃，空气相对湿度80%-90%，菌袋覆土后6-8天开始喷水，从上午9:30-10:00气温升高开始喷，每次5分钟，1m²喷水量为0.3-0.4L，每天喷水5-6次；

子实体完全开片后，每天空气对流通风3-5h，光照强度1000-4500Lx。

6.根据权利要求2所述的亮盖灵芝菌株L5478的人工栽培方法，其特征在于，在栽培袋埋袋前一个月，将准备种植灵芝大棚中的杂草清除，撒上一层石灰进行翻耕，暴晒，浇透水，在埋袋前5天再翻耕一次。

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