CN109220514B

CN109220514B - 一种野生新食用菌的分离及其人工驯化栽培方法

Info

Publication number: CN109220514B
Application number: CN201710366948.2A
Authority: CN
Inventors: 赵瑞琳; 王慧君; 李国杰
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2017-05-23
Filing date: 2017-05-23
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2037-05-23
Also published as: CN109220514A

Abstract

本发明公开了一种野生新食用菌的分离及其人工驯化栽培方法。本发明提供了卵孢侧耳(Pleurotus placentodes)的菌株(保藏号CGMCC NO.13698)。还提供了上述卵孢侧耳在制备食品中的应用。本发明的实验证明了，本实验对野外采集侧耳菌株进行形态学鉴定和分子的生物学分析鉴定该菌为卵孢侧耳，在对卵孢侧耳的驯化栽培中，发现卵孢侧耳菌丝生长速度快，菇体口感好，且其中蛋白质和氨基酸含量均比平菇高，是一个具有潜在食用开发价值的可食用菌，对保护野生种质资源和遗传育种有着重要意义。

Description

一种野生新食用菌的分离及其人工驯化栽培方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种野生新食用菌的分离及其人工驯化栽培方法。

背景技术

侧耳属Pleurotus(Fr.)P.Kumm.真菌，隶属于担子菌门Basidiomycota、伞菌纲Agaricomycetes、伞菌目Agaricales、侧耳科Pleurotaceae，具有极大食药用潜质。该属的许多物种都含有丰富的多糖、氨基酸、蛋白质、脂肪酸等生物活性物质，可以提高机体免疫力、延缓衰老、抗疲劳、抗肿瘤、调节血糖、调节血脂。侧耳属真菌也是一类利用基质最为广泛的真菌，可以利用农业、工业废弃物为基质进行栽培生产，且生物学效率较高，具有重要应用价值，对农业可持续发展具有重要意义。此外，侧耳属真菌还是一类具有生物修复功能的环保菌，通过产生木质素氧化酶、锰过氧化物酶和漆酶等酶类可以降解多环芳烃、染料、工农业废弃物等有害物，广泛应用于纺织厂、造纸厂、橄榄油厂废水及城市废水的处理。

据记载我国是世界上最早食用侧耳属真菌的国家，同时侧耳属真菌因其适应性强、分布广泛、生物多样性丰富也成为我国目前栽培种类和品种最多的一类食用菌。目前世界广泛栽培的侧耳属真菌约有20种，主要包括糙皮侧耳P.ostreatus(Jacq.)

肺形侧耳P.pulmonarius(Fr.)

白黄侧耳P.cornucopiae(Paulet)Rolland、刺芹侧耳P.eryngii(DC.)

金顶侧耳P.citrinopileatus Singer、美味侧耳P.sapidus(Schulzer)Sacc.、佛州侧耳P.floridanus Singer、阿魏侧耳P.ferulae(Lanzi)X.L.Mao、白灵侧耳P.eryngii var.Tuoliensis(DC.)

等。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种卵孢侧耳(Pleurotus placentodes)。

本发明提供的卵孢侧耳(Pleurotus placentodes)，来自野生卵孢侧耳ZRL20152036，其保藏号为CGMCC NO.13698。

上述卵孢侧耳在制备食品中的应用也是本发明保护的范围。

上述卵孢侧耳在培育可食用卵孢侧耳中的应用也是本发明保护的范围。

本发明提供一种栽培卵孢侧耳的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：先扩繁上述的卵孢侧耳的菌丝，得到扩繁后菌丝；再将所述扩繁后菌丝进行原种培养，得到原种；再将所述原种在栽培料上出菇培养，实现卵孢侧耳栽培。

扩繁所用的培养基为PDA培养基。

原种培养基配方：500g/瓶：麦粒85％、石膏粉1.5％、碳酸钙0.5％,121℃下高压灭菌2小时；

栽培料配方：2Kg/袋：棉籽皮43％、玉米芯43％、麦麸12％、石灰2％、pH值自然,121℃下高压灭菌2小时；

扩繁条件25℃避光培养7天。

原种培养条件:22-26℃下避光培养30-32天；

出菇培养为：置于人工智能气候培养室内培养,温度18-22℃,空气湿度60％左右，菌丝长满袋后10d进行搔菌，8-10℃的低温刺激，空气湿度85％-90％，待原基出现后停止低温刺激，出菇温度15-22℃，出现原基后2-3周开始出菇。

来自野生卵孢侧耳ZRL20152036(标本保存于中国菌物标本馆，馆藏号HMAS279131)的菌株(即菌丝体)，于2017年03月24日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌株保藏编号为CGMCC NO.13698，分类命名为卵孢侧耳(Pleurotus placentodes)。

本发明对野外采集标本，人工驯化后的栽培菇及菌株的形态学和基于真菌通用条形码基因ITS序列的分子生物学分析，鉴定该菌为卵孢侧耳。在对卵孢侧耳的驯化栽培中，发现卵孢侧耳菌丝生长速度快，菇体口感好，且其中蛋白质和氨基酸含量均比现广泛商业栽培的平菇(P.ostreatus)高，是一个具有可开发价值的食用菌，对卵孢侧耳的研究与开发对保护我国野生种质资源和食用菌遗传育种都有着重要意义。

附图说明

图1为野外采集的卵孢侧耳P.placentodes宏观形态特征标尺为2cm。

图2为人工栽培条件下不同生长时期卵孢侧耳P.placentodes(馆藏号HMAS255159、菌种保藏号CGMCC NO.13698)的形态特征。a菇体的原基形成；b-d人工栽培形成的子实体。

图3为卵孢侧耳P.Placentodes的菌落及微观形态特征a.培养性状；b.担孢子，c.担子，d.侧生囊状体

图4为基于ITS1-5.8S-ITS2序列贝叶斯分析的侧耳属系统发育树。其中序列KY967596自野生标本HMAS279131；序列KY967597来自野生标本的菌株CGMCC NO.13698；序列KY967598来自人工驯化后的菇体，标本号为HMAS255159。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、卵孢侧耳可种植种的获得

一、标本分离与鉴定

1、野外标本分离

野生标本于2015年7月采自西藏自治区日喀则市定结县陈塘镇，位于喜马拉雅山脉中段南坡，珠峰东南侧的原始森林地带，标本采集号为ZRL20152036。

采用组织分离法分离菌种:野外采集侧耳的子实体菌盖和菌柄交接处组织,置于装有PDA培养基的2ml离心管培养基斜面上,25℃避光培养，得到侧耳菌丝，通过纯化，即得到菌种。

PDA培养基:取新鲜马铃薯200g加入1L蒸馏水煮30min后过滤、定容至1L,加入葡萄糖20g、琼脂18g。

2、标本鉴定

1)形态学鉴定首先观察其子实体的组成部分及其形态特征

用解剖刀纵切野外采集新鲜侧耳(ZRL20152036)的子实体观察其菇盖组成、菌肉的颜色、质地、菌褶形状和着生情况、菌柄的组成，菌柄的质地，中实或中空等特征；

显微形态观察：用尖头镊取一块2-3mm的野外采集新侧耳的菌褶放在清洁的载片中央，滴半滴75％的酒精晾干后加一滴10％刚果红染色剂，1min后用吸水纸将染色剂吸干，加入5％氢氧化钾水溶液制成镜检材料，用镊子加盖玻，注意避免产生气，在光学显微镜下观察其微观特性。

结果如图1、2、3所示：野生担子果单生(图1)，人工栽培条件下多簇生(图2)，鲜菇有海鲜气味，菇蕾期菌盖小而菌柄粗，浅灰色(图2‐a)，2‐5天后菌盖圆盘形，扁平深灰色，直径1.3‐3.5cm(图2‐b)，担子果成熟后菌盖逐渐形成凹面体，杯形或扇形，中央浅黄褐色，边缘灰褐色，有波状起伏的卷边，直径为4‐12cm(图2‐c、d)。菌褶1‐3mm，延生不等长，中等稀疏，白色至淡黄色。菌柄棒状，近基部稍细1.5‐7.5×0.5‐1.5cm，白色至浅棕色，表皮有纵纹，菌柄肉稍有韧性，菌柄基部有短绒毛，象牙白色。孢子印白色。在PDA培养基上，菌落白色(图3‐a)。显微镜下，担孢子4.3‐9.8×2.8‐5.6μm，椭圆至卵圆形，无色透明(图3‐b)。担子13‐24×5.5‐7.5μm,棒状，小梗4个，小梗长2‐3.5μm(图3‐c)。子实层体有侧生囊状体，8.5‐14.8×4.3‐6.8μm，无色，棒状(图3‐d)。

2)分子系统学分析

实验室DNA提取：本实验中将野外采集标本ZRL20152036(馆藏号HMAS279131)、野外获得菌株(保藏号CGMCC NO.13698)、人工栽培的子实体(馆藏号HMAS255159)采用CTAB法提取DNA，利用ITS1(5′‐TCCGTAGGTGAACCTGCGC‐3′)和ITS4(5′‐TCCTCCGCTTATTGATATGC‐3′)通用引物进行PCR扩增。

PCR反应体系(25)μl：2μlDNA模板、2μldNTP、1μlITS1、1μlITS4、2×TaqPCRMasterMix(200MdNTPsP、4.0mMMgCl₂、2.5UTaqDNA聚合酶)、ddH₂O补齐。扩增程序为94℃预变性4min，然后94℃变性40s、50℃退火50s、72℃延伸50s，35个循环，最后一个循环72℃延伸8分钟，PCR扩增产物由北京博迈德测序公司进行测序。

来自野生标本(HMAS279131)；菌株CGMCC NO.13698；及人工驯化后的菇体(HMAS255159)的ITS序列均一致(如序列1所示)。且根据构建的侧耳属系统发育图谱(图4)，它们与已报道的卵孢侧耳在一个系统发育分支里，并获得0.99的后验概率支持率，研究结果支持它们为同一物种卵孢侧耳。

经过上述鉴定，来自野生卵孢侧耳ZRL20152036的菌株(即菌丝体)，于2017年03月24日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌株保藏编号为CGMCC NO.13698，分类命名为卵孢侧耳(Pleurotus placentodes)。

实施例2、卵孢侧耳可种植种的人工栽培

一、培养基配制

栽培料配方：2Kg/袋：棉籽皮43％、玉米芯43％、麦麸12％、石灰2％、pH值自然，121℃下高压灭菌2小时；

二、栽培方法

1、母种扩繁：从实施例1的离心管斜面挑取少许卵孢侧耳(CGMCC NO.13698)菌丝,置入装有PDA培养基的90mm培养皿，25℃避光培养7天，得到扩繁后菌丝。

2、接种栽培

待菌丝在培养皿上长满后，切1cm×1cm小菌块接种于原种培养基中，25℃下避光培养32天，将长满菌丝的原种接种在栽培料上，置于人工智能气候培养室内培养,08:00-20：00温度为22℃,20:00-08:00温度为18℃空气湿度60％，菌丝长满袋后10d进行搔菌，8℃的低温刺激，空气湿度85％-90％，待原基出现后停止低温刺激，出菇温度08:00-20：00温度为15℃,20:00-08:00温度为22℃，出现原基后2-3周开始出菇。

结果显示，实施例1获得的卵孢侧耳菌株可以在以木屑、棉籽壳为主料,玉米面、石膏、磷酸二氢钾为辅料的聚丙烯袋装的栽培料上正常生长发育，麦粒原种接种32d长满瓶，栽培种接种约32d左右长满袋，长满后一周进行8℃持续10d的低温刺原基分化，原基分化后2周开始摘鲜菇，从接种原种到子实体采收107d，得到人工栽培卵孢侧耳子实体。

三、商品价值评价

1)营养成分分析

对上述二得到的人工栽培卵孢侧耳的子实体中的多糖含量采用硫酸苯酚法，参照NY/T 1676-2008《食用菌中粗多糖含量的测定》，蛋白质采用凯氏定氮法，参照GB/T15673-2009《食用菌中粗蛋白含量的测定》。氨基酸采用日立L 8900型氨基酸自动分析仪，参考国标GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》测定17种氨基酸含量。以已发表的文献(张璐，弓志青，王文亮等.7种大宗食用菌的呈味物质分析及鲜味评价[J].食品科技，2017，42(03)：274-278.)中香菇、金针菇、杏鲍菇、茶树菇、双孢菇相应营养成分作为对照。

结果见表1所示，卵孢侧耳含有丰富的营养物质其中含有粗蛋白、粗多糖、含有16种氨基酸、8种必需氨基酸。卵孢侧耳中氨基酸总量为18.54g/100g，8种必需氨基酸含量为7.07g/100g，必需氨基酸含量占氨基酸总量的38％。与香菇等人工栽培食用菌相比较，卵孢侧耳中含人体必需氨基酸的量最高，天冬氨酸、苏氨酸含量是香菇、平菇、金针菇、茶树菇的2倍多，亮氨酸与苯丙氨酸的含量也都高于香菇、金针菇、杏鲍菇、茶树菇、双孢菇等。卵孢侧耳的粗蛋白含量比平菇高。

表1.卵孢侧耳和其它5种食用菌营养成分含量表g/100g干重

注：T为氨基酸总量；E为必需氨基酸总量；N为非必需氨基酸

2、毒性及风味验证

将上述二得到的人工栽培卵孢侧耳喂食给动物均无毒，试吃后确定该种为可食性侧耳。

将上述二得到的人工栽培卵孢侧耳鲜菇清香，菌盖比市面上平菇薄，光滑有韧性，炖汤、清炒均有海鲜味。菌柄表皮纤维多，菌肉比菌盖味道淡，可煎炸食用，有韧性，口感好。干菇香味浓更适宜煲汤，炖煮。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种野生新食用菌的分离及其人工驯化栽培方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 633

<212> DNA

<213>卵孢侧耳（Pleurotus placentodes)

<400> 1

atatatggag ttgttgctgg cctttagggg catgtgcacg cttcactagt ctttcaacca 60

cctgtgaacc tttgatagat ctgtgaagtc gattctcaag tcattgactt ggtttgctgg 120

gacttgatcg tctcggtgtg actacgcagt ctatttactt acacacccta aatgtatgtc 180

tacgaatgtc atttaatggg ccttgtgcct ataaaccata atacaacttt caacaacgga 240

tctcttggct ctcgcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc gataagtaat gtgaattgca 300

gaattcagtg aatcatcgaa tctttgaacg caccttgcgc cccttggtat tccgaggggc 360

atgcctgttt gagtgtcatt aaattctcaa actcacgttg gttttgccaa ttgtgatgtt 420

tggatagttg ggggttgctg gctttaacaa gtcggctcct cttaaatgca ttagcaggac 480

ttctcattgc ctctgcgcat gatgtgataa ttatcactca tcaatagcac gcatgaatag 540

agtccagctc tctaacccgt ccgcaaggac aacttgacaa tttgacctca aatcaggtag 600

gactacccgc tgaacttaag catatcaata agc 633

Claims

1.卵孢侧耳(Pleurotus placentodes)，其保藏号为CGMCC NO.13698。

2.权利要求1所述的卵孢侧耳在制备食品中的应用。

3.权利要求1所述的卵孢侧耳在培育可食用卵孢侧耳中的应用。

4.一种栽培卵孢侧耳的方法，包括如下步骤：先扩繁权利要求1所述的卵孢侧耳的菌丝，得到扩繁后菌丝；再将所述扩繁后菌丝进行原种培养，得到原种；再将所述原种在栽培料上出菇培养，实现卵孢侧耳栽培。