CN103710317A

CN103710317A - 一种漆酶突变体及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN103710317A
Application number: CN201310700591.9A
Authority: CN
Inventors: 胡美荣; 周雪; 陶勇
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2013-12-18
Filing date: 2013-12-18
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2033-12-18
Also published as: CN103710317B

Abstract

本发明公开了一种漆酶突变体及其编码基因与应用。本发明所提供的漆酶突变体是如下a）-d）中任一种蛋白质：a）序列1所示的蛋白质；b）序列3所示的蛋白质；c）序列5所示的蛋白质；d）将a）-c）中任一所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有漆酶活性的蛋白质。实验证明，本发明所提供的漆酶突变体，较野生型漆酶相比，具有比活力高、可耐受pH广泛等特点。本发明所提供的漆酶突变体有望在纸浆漂白、印染工业中废水处理、医药领域中进行生物检测、以及食品工业、有机合成、有机农药降解等领域得到应用。

Description

一种漆酶突变体及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种漆酶突变体及其编码基因与应用。

背景技术

漆酶（EC.1.10.3.2）属于蓝色多铜氧化酶家族，能够氧化多种酚类及其他有机化合物，因而被广泛应用于染料降解，纸浆漂白，有机合成以及生物降解等工业领域。但是由于其比活力不高、稳定性差，价格较贵没有得到广泛应用。漆酶广泛的分布于真菌、细菌、植物等。其中以真菌中的漆酶研究最为广泛，真菌中表达的漆酶比活力较高，如变色栓菌、木腐层孔菌、糙皮侧耳等。但是他们表达的漆酶往往是含有几种同工酶的。有些同工酶的比活力很低，因此找到高比活力的漆酶并大量表达对推动漆酶的应用是意义的，同时漆酶是应用于工业领域的，其作用条件不是很温和，因此找到在不同pH值条件下热稳定性好的漆酶也是非常受欢迎的。

POXa1b是佛罗里达侧耳（Pleurotus florida）分泌的一种漆酶，其比活力约为151U·mg^-1，Faraco报道它具有惊人的热稳定性，在碱性条件下，其半衰期T₅₀为30天。毕赤酵母是近20年才逐渐发展起来的并已被广泛应用的外源蛋白高效表达宿主，具有生物量高，表达量高，生产成本低，产物稳定性好的优点。

因此，若能在佛罗里达侧耳（Pleurotus florida）中能够克隆得到和POXa1b的催化性质相近，比活力更高的酶，同时再将其在毕赤酵母中大量表达，推动其广泛应用将具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种漆酶突变体及其编码基因与应用。

本发明所提供的漆酶突变体，是在佛罗里达侧耳（Pleurotus florida）ACCC No.50035中野生型漆酶POXA1c（序列7）的基础上进行突变得到的，具有比活力高、作用的pH广泛等特点。具体而言，是如下（a）-（d）中任一种蛋白质：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质（POXA1cΔ13-R5V）；

（b）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质（POXA1cΔ13）；

（c）由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质（POXA1c-R5V）；

（d）将（a）-（c）中任一所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有漆酶活性的蛋白质。

上述（d）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（d）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2、序列4或序列6所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的无义突变。

其中，序列表中序列7由513个氨基酸残基组成（POXA1c）；将序列7自N端起第5个氨基酸由精氨酸（R）突变为缬氨酸（V）即得到序列5（POXA1c-R5V）；将序列7自C端起缺失13个氨基酸即得到序列3（POXA1cΔ13）；将序列5自C端起缺失13个氨基酸即得到序列1（POXA1cΔ13-R5V）。

编码所述蛋白质（漆酶突变体）的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子是编码所述蛋白质（漆酶突变体）的基因；所述基因具体可为如下1）至5）中任一所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子（POXA1cΔ13-R5V）；

2）编码序列为序列表中序列4所示的DNA分子（POXA1cΔ13）；

3）编码序列为序列表中序列6所示的DNA分子（POXA1c-R5V）；

4）在严格条件下与1）-3）中任一限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质（漆酶突变体）的DNA分子；

5）与1）-4）中任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述蛋白质（漆酶突变体）的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，序列2由1503个核苷酸组成，整个序列2即为编码序列，编码序列表中序列1所示的漆酶突变体POXA1cΔ13-R5V。序列4由1503个核苷酸组成，整个序列4即为编码序列，编码序列表中序列3所示的漆酶突变体POXA1cΔ13。序列6由1542个核苷酸组成，整个序列6即为编码序列，编码序列表中序列5所示的漆酶突变体POXA1c-R5V。

含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为AOX1启动子。

更为具体的，所述重组表达载体为在pPICZαA载体的多克隆位点（如EcoR I和Not I）之间插入所述基因后得到的重组质粒。

所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。

所述重组菌为将所述基因导入毕赤酵母中得到的重组菌。

在本发明中，所述毕赤酵母具体为毕赤酵母（Pichia pastoris）X33。

所述蛋白质（漆酶突变体），或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在对漆酶作用底物进行氧化反应中的应用也属于本发明的保护范围。

在本发明中，所述漆酶作用底物具体为2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）或愈创木酚（guaiacol）。

在本发明的一个实施例中，对所述漆酶作用底物进行氧化反应的pH为4.5；进一步，所用缓冲液为200mM的pH4.5的醋酸缓冲溶液。

具体的，200mM的pH4.5的醋酸缓冲溶液的溶剂为水，溶质是醋酸和醋酸钠；醋酸钠的浓度为200mM，用醋酸调pH值为4.5。

更加具体的，当底物为ABTS时，反应体系如下（以2ml反应体系为例）：100μl待测漆酶，1.7ml200mM的pH4.5的醋酸缓冲溶液，0.2ml50mM ABTS。当底物为愈创木酚时，反应体系可如下（以2ml反应体系为例）：100μl待测漆酶，1.7ml200mM的pH4.5的醋酸缓冲溶液，0.2ml50mM愈创木酚。

所述蛋白质（漆酶突变体）的制备方法也属于本发明的保护范围。

所述蛋白质（漆酶突变体）的制备方法包括如下步骤：培养所述重组菌，如含有所述基因的毕赤酵母（Pichia pastoris）X33，从所述重组菌中获得所述蛋白质（漆酶突变体）。

实验证明，本发明所提供的漆酶突变体，较野生型漆酶相比，具有比活力高、可耐受pH广泛等特点。本发明所提供的漆酶突变体有望在纸浆漂白、印染工业中废水处理、医药领域中进行生物检测、以及食品工业、有机合成、有机农药降解等领域得到应用。

附图说明

图1为重组表达载体pPICZαA-POXA1c的质粒图谱。

图2为野生型漆酶及其突变体在不同pH条件下的稳定性测定结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pPICZαA载体：Invitrogen，其产品目录号为V19020。pPICZαA载体中位于多克隆位点（MCS）上游的启动子为AOX1启动子，在AOX1启动子下游MCS上游有信号肽，信号肽带有起始密码子ATG，故而在MCS处插入的外源基因，可以没有起始密码子，只要三联密码子与之相符，没有移码即可。在蛋白表达加工成熟的过程中，信号肽会自行切除。

实施例1、野生型漆酶基因的克隆及重组工程菌的构建

一、佛罗里达侧耳（Pleurotus florida）ACCC No.50035来源漆酶的POXA1b基因的克隆

从佛罗里达侧耳（Pleurotus florida）ACCC No.50035中扩增漆酶POXA1c基因的具体步骤：

1、采用TRIZOL总RNA抽提试剂盒（Invitrogen）抽提佛罗里达侧耳（Pleurotusflorida）ACCC No.50035的总RNA。

2、以oligo-(dT)₁₅（Promega）为引物，按照常规的方法反转录合成cDNA。

3、采用如下引物扩增出漆酶的POXa1b的基因。

poxa1c-F：5’-CGGAATTCAGCATTGGGCCCCGCGGAACGCTG-3’（下划线部分为EcoR I的识别序列，其后的序列为序列8的第1-24位）；

poxa1c-R：5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTCATGCTTTCAATGGCGCAGGCAG-3’（下划线部分为Not I的识别序列，其后的序列为序列8的第1518-1542位的反向互补序列）。

4、将所得PCR扩增产物进行序列测定，结果显示该PCR产物的序列为“CGGAATTC+序列8+GCGGCCGCTAAACTAT”。序列表中序列8编码序列表中序列7所示的蛋白质（野生型漆酶），将该蛋白质命名为POXA1c。

二、表达野生型漆酶POXA1c的工程菌的构建

1、重组表达载体pPICZαA-POXA1c的构建及鉴定

将实施例1所得PCR产物野生型漆酶POXA1c基因片段经EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，回收酶切产物后与经相同限制性内切酶作用的pPICZαA载体（Invitrogen，其产品目录号为V19020）骨架大片段相连，将所得重组载体命名为pPICZαA-POXA1c，其质粒图谱如图1所示。

将重组表达载体pPICZαA-POXA1c用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切鉴定，结果显示，酶切后得到大小约为1542bp和3593bp两个条带，与预期结果一致。进一步，对重组表达载体pPICZαA-POXA1c进行序列测定，结果显示，重组表达载体pPICZαA-POXA1c为在pPICZαA载体的酶切位点EcoR Ⅰ和Not Ⅰ之间插入序列表中序列8后得到的重组质粒。

2、表达野生型漆酶POXA1c的工程菌的构建及鉴定

将步骤一获得的重组表达载体pPICZαA-POXA1c用限制性内切酶Sac Ⅰ线性化，按照常规的方法电激转化毕赤酵母（Pichia pastoris）X33（invitrogen，货号为C18000），用Zeocin抗性筛选阳性转化子。

对所得阳性转化子进行分子鉴定，具体如下：提取阳性转化子的基因组DNA，以其为模板，采用引物poxa1c-F和poxa1c-R（序列见实施例1）进行PCR扩增，将经鉴定得到大小约为1542bp的目的条带（序列8）的阳性转化子命名为X33/pPICZαA-POXA1c。

同时设置向毕赤酵母（Pichia pastoris）X33中转入X33/pPICZαA空载体的对照，将所得重组菌命名为X33/pPICZαA。

实施例2、漆酶突变体基因的获得及重组工程菌的构建

一、漆酶突变体POXA1c R5V编码基因的获得及重组表达载体的构建

以实施例1中所得重组表达载体pPICZαA-POXA1c为模板，采用引物poxa1cR5V-F和poxa1c R5V-R进行PCR扩增。

poxa1c R5V-F：5’-ATTGGGCCCGTTGGAACGCTGAACATCGCGAAC-3’（序列6的第4-36位，下划线部分为与序列8相比突变位点）；

poxa1c R5V-R：5’-TTCCAACGGGCCCAATGCTGAATTC-3’（下划线斜体部分为EcoR Ⅰ的识别序列，其前的序列为序列6的第1-19位的反向互补序列，下划线部分为与序列8相比突变位点）。

将所得PCR产物转化大肠杆菌感受态DH5α，PCR产物在大肠杆菌体内自身环化，将提取得到环形质粒命名为pPICZαA-POXA1c R5V。

对重组表达载体pPICZαA-POXA1c R5V进行序列测定，结果显示，重组表达载体pPICZαA-POXA1c R5V为在pPICZαA载体的酶切位点EcoR Ⅰ和Not Ⅰ之间插入序列表中序列6后得到的重组质粒。序列6编码序列表中序列5所示的蛋白质（漆酶突变体），将该蛋白质命名为POXA1c R5V。

二、漆酶突变体POXA1cΔ13-R5V编码基因的获得及重组表达载体的构建

以步骤一所得重组表达载体pPICZαA-POXA1cR5V为模板，采用引物poxa1cR5V-F2和poxa1cΔ13-R进行PCR扩增。

poxa1c R5V-F2：5’-CGGAATTCAGCATTGGGCCCGTTGGAACGCTGAAC-3’（下划线斜体部分为EcoR Ⅰ的识别序列，其后的序列为序列2的第1-27位，下划线部分为与序列8相比突变位点）；

poxa1cΔ13-R：5’-ATAGTTTAGCGGCCGCctagcccattaggagtttcgatg-3’（下划线部分为Not I的识别序列，其后的序列为序列2的第1481-1503位的反向互补序列）。

将所得PCR产物跑胶回收后，用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，回收酶切产物后与经相同限制性内切酶作用的pPICZαA载体（Invitrogen，其产品目录号为V19020）骨架大片段相连，将所得重组载体命名为pPICZαA-POXA1cΔ13-R5V。

将重组表达载体pPICZA-POXA1cΔ13-R5V用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切鉴定，结果显示，酶切后得到大小约为1503bp和3593bp两个条带，与预期结果一致。进一步，对重组表达载体pPICZαA-POXA1cΔ13-R5V进行序列测定，结果显示，重组表达载体pPICZαA-POXA1cΔ13-R5V为在pPICZαA载体的酶切位点EcoRⅠ和Not Ⅰ之间插入序列表中序列2后得到的重组质粒。序列2编码序列表中序列1所示的蛋白质（漆酶突变体），将该蛋白质命名为POXA1cΔ13-R5V。

三、漆酶突变体POXA1cΔ13编码基因的获得及重组表达载体的构建

以实施例1中所得重组表达载体pPICZαA-POXA1c为模板，采用引物poxa1c-F和poxa1cΔ13-R进行PCR扩增。

poxa1c-F：5’-CGGAATTCAGCATTGGGCCCCGCGGAACGCTG-3’（下划线部分为EcoR I的识别序列，其后的序列为序列4和序列8的第1-24位）；

poxa1cΔ13-R：5’-ATAGTTTAGCGGCCGCctagcccattaggagtttcgatg-3’（下划线部分为Not I的识别序列，其后的序列为序列4的第1481-1503位的反向互补序列）。

将所得PCR产物跑胶回收后，用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，回收酶切产物后与经相同限制性内切酶作用的pPICZαA载体（Invitrogen，其产品目录号为V19020）骨架大片段相连，将所得重组载体命名为pPICZαA-POXA1cΔ13。

将重组表达载体pPICZαA-POXA1cΔ13用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切鉴定，结果显示，酶切后得到大小约为1503bp和3593bp两个条带，与预期结果一致。进一步，对重组表达载体pPICZαA-POXA1cΔ13进行序列测定，结果显示，重组表达载体pPICZA-POXA1cΔ13为在pPICZαA载体的酶切位点EcoR Ⅰ和Not Ⅰ之间插入序列表中序列4后得到的重组质粒。序列4编码序列表中序列3所示的蛋白质（漆酶突变体），将该蛋白质命名为POXA1cΔ13。

四、表达漆酶突变体的工程菌的构建及鉴定

将步骤一至三获得的三个重组表达载体pPICZαA-POXA1c-R5V、pPICZαA-POXA1cΔ13-R5V和pPICZαA-POXA1cΔ13分别用限制性内切酶SacⅠ线性化，再分别按照常规的方法电激转化毕赤酵母（Pichia pastoris）X33，用Zeocin抗性筛选阳性转化子。

对所得阳性转化子进行分子鉴定，具体如下：

对于转入pPICZαA-POXA1c R5V的转化子：提取阳性转化子的基因组DNA，以其为模板，采用引物poxa1c-F和poxa1c-R（序列同上）进行PCR扩增，将经鉴定得到大小约为1542bp的目的条带（序列6的阳性转化子命名为X33/pPICZαA-POXA1cR5V。

对于转入pPICZαA-POXA1cΔ13-R5V的转化子：提取阳性转化子的基因组DNA，以其为模板，采用引物poxa1c-F和poxa1cΔ13-R（序列同上）进行PCR扩增，将经鉴定得到大小约为1503bp的目的条带（序列2）的阳性转化子命名为X33/pPICZA-POXA1cΔ13-R5V。

对于转入pPICZαA-POXA1cΔ13的转化子：提取阳性转化子的基因组DNA，以其为模板，采用引物poxa1c-F和poxa1cΔ13-R（序列同上）进行PCR扩增，将经鉴定得到大小约为1503bp的目的条带（序列4）的阳性转化子命名为X33/pPICZαA-POXA1c。

实施例3、野生型漆酶及不同漆酶突变体的酶活力测定

一、产漆酶工程菌株的发酵、漆酶的获得及纯化

1、产漆酶工程菌株的发酵

将实施例1获得的表达野生型漆酶POXA1c的工程菌X33/pPICZαA-POXA1c、实施例2获得的表达漆酶突变体的工程菌X33/pPICZαA-POXA1c R5V、X33/pPICZαA-POXA1cΔ13-R5V和X33/pPICZαA-POXA1cΔ13，分别采用发酵培养液进行培养，培养24小时后，向发酵体系中加入无水甲醇，以诱导漆酶的表达；无水甲醇的加入方式为每隔12小时加入一次（第一次加入的时间点为培养第24小时），共加入5次，每次加入无水甲醇使发酵体系中无水甲醇的初始浓度为0.5%（体积分数）。在第5次加入无水甲醇后继续培养12小时，取上清即为粗酶液。

同时设置按照如上方法发酵转入pPICZαA空载体的重组菌X33/pPICZAαA的对照。

其中，发酵培养液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、山梨醇5g/L、0.4mM CuCl₂，自然pH。以上各浓度均为相应组分在培养基中的终浓度。

2、漆酶的纯化

（1）粗酶液硫酸铵沉淀：将步骤1所得上清（粗酶液）置于烧杯中，放于磁力搅拌器上，在4℃环境下缓慢向烧杯中加入打碎成细粉的硫酸铵粉末，至最终饱和度为80%（约为51.6g/100ml）。后将溶液在4℃继续搅拌1h，后10000rmp，4℃离心30min，弃去上清，收集沉淀。

（2）透析：将步骤（1）收集到的沉淀在4℃条件下用pH8.0的PBS缓冲液溶解，装入透析袋中，封口，放于pH8.0的PBS缓冲液中，4℃透析12h，每4h更换一次透析缓冲液（pH8.0的PBS缓冲液）。

（3）浓缩：将透析后的蛋白液置于PEG20000中浓缩约12h，至酶液剩余约5mL。

（4）将浓缩后的酶液取出，10000rmp，4℃离心30min，后将上清用0.2mm滤器过滤，备用。

（5）将处理好的蛋白样品用HiTrapTM脱盐柱（GE Healthcare，产品目录编号为：GE17-5130-01）脱盐，脱盐缓冲液为20mM pH8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，用2mL EP管收集蛋白峰值处的流出液。

其中，20mM pH8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：磷酸氢二钠18.94mM，磷酸二氢钠1.06mM。各浓度为相应组分在溶液中的终浓度。

pH8.0PBS的溶剂为水，溶质及其浓度如下：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄4.3mmol/L，KH₂PO₄1.4mmol/L。各浓度为相应组分在溶液中的终浓度。

（6）将收集到的液体放入超滤管中，4℃，10000rmp离心1h，浓缩蛋白液到2mL。

（7）将脱盐后的蛋白液用阴离子柱HiTrap Q Column（GE Healthcare，产品目录编号为：17-5159-01）分离蛋白，用20mM pH8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液充分平衡柱子后，上样，洗5个柱体积即25ml后，然后用含有0.1M NaCl的20mM pH8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗2个柱体积，收集洗脱峰，洗脱峰即为含有漆酶的溶液，得到纯化后的漆酶。后用含有1M NaCl的20mM pH8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗脱5个柱体积，将柱子上的其他杂蛋白洗下，然后用20mM pH8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗脱3个柱体积，柱子可以重新利用。

二、野生型漆酶及不同漆酶突变体的比活力测定

待测漆酶：步骤一获得的野生型漆酶及不同漆酶突变体的纯化产物。

底物：2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）或愈创木酚（guaiacol）。

漆酶酶活测定原理：漆酶能够利用氧气将ABTS氧化生成ABTS⁺并且生成水，’ABTS⁺在420nm处有较强的吸收峰，常用来检测漆酶的活性；漆酶利用氧气将愈创木酚氧化成醌类和水，醌类在465nm处有较高的吸收峰，用来检测漆酶的活性。

酶活力测定的反应体系为：

当底物为ABTS时，在2ml反应体系中，含有100μl待测漆酶，1.7ml200mM的pH4.5的醋酸缓冲溶液，用0.2ml50mM ABTS启动反应，25℃水浴保温5min，测A₄₂₀，用分光光度计在420nm处测定其反应前后吸光值的差值，以事先灭活的酶为对照（酶的灭活方法：沸水中煮10分钟），根据如下公式计算出酶活力。每一样品平行3份进行测定，取值为标准偏差小于5%的数据的平均值。

当底物为愈创木酚时，反应体系可如下：在2ml反应体系中，含有100μl待测漆酶，1.7ml200mM的pH4.5的醋酸缓冲溶液，加入0.2ml50mM愈创木酚启动反应，25℃水浴保温5min，测A₄₆₅，用分光光度计在465nm处测定其反应前后吸光值的差值，以事先灭活的酶为对照（酶的灭活方法：沸水中煮10分钟），根据如下公式计算出酶的比活力。每一样品平行3份进行测定，取值为标准偏差小于5%的数据的平均值。

其中，200mM的pH4.5的醋酸缓冲溶液的溶剂为水，溶质是醋酸和醋酸钠；醋酸钠的浓度为200mM，用醋酸调pH值为4.5。

1个酶活单位(U)：是指在上述反应条件下，每分钟催化1μmol底物（如ABTS或愈创木酚）氧化所需的酶量。

酶活力单位（U）计算：

A=εLC，（其中消光系数ε420=36,000M^-1·cm^-1对ABTS，ε465=12,100M^-1·cm^-1对愈创木酚；L为比色杯的光径，本试验中L=0.5cm），C=A/(εL)。

又因U=CV_总/t

所以U=AV_总/(εLt)

其中：V_总=2ml，t=5min，A=A_420nm或A_465nm条件下的吸光值。

酶的比活力的计算：

比活力的计算：

酶的活力单位除以酶的质量。

比活力=U/C_酶

其中：C_酶=酶的量，单位为mg。

酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数，即将反应体系中测得酶的活力除以体系中酶的量，即得到比活力，单位为U/mg。

蛋白浓度的测定方法：改良型Bradford法蛋白质浓度测定试剂盒，购买生工生物工程（上海）股份有限公司，产品编号为SK3041。

同时设置转入pPICZαA空载体的重组菌X33/pPICZAαA的发酵上清替代待测漆酶的对照组。

结果显示，三种漆酶突变体对不同底物的比活力较野生型漆酶均有较大幅度的提高。其中，漆酶突变体POXA1c-R5V对ABTS的比活是野生型漆酶的2.3倍，对愈创木酚的比活是野生型漆酶的3.4倍；漆酶突变体POXA1cΔ13对ABTS的比活是野生型漆酶的2.1倍，对愈创木酚的比活是野生型漆酶的3.5倍；漆酶双突变体POXA1cΔ13-R5V对酶比活力的提高效果更大，对ABTS比活力是野生型漆酶的3.9倍，达到了1321.37U/mg，对愈创木酚的比活是野生型漆酶的11.3倍，达到29.36U/mg。详见表1。而转入pPICZ空载体的重组菌X33/pPICZA的发酵上清替代待测漆酶的对照组与事先灭活的待测漆酶对照组均无酶活。可见，三种漆酶突变体，特别是双突变体POXA1cΔ13-R5V，在比活力上较野生型漆酶具有明显的优势，在工业方面有巨大的应用潜能。

表1野生型漆酶及不同漆酶突变体比活力的测定结果（单位：U/mg）

	POXA1c	POXA1cΔ13	POXA1c-R5V	POXA1cΔ13-R5V
					ABTS	335.40	688.74	775.32	1321.37
愈创木酚	2.59	9.17	8.91	29.36

实施例4、野生型漆酶及不同漆酶突变体的稳定性分析

本实施对野生型漆酶及不同漆酶突变体在不同pH值下的稳定性进行测定。

一、产漆酶工程菌株的发酵、漆酶的获得及纯化

同实施例3步骤一。

二、野生型漆酶及不同漆酶突变体的稳定性分析

底物：2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）。

稳定性测试溶液为如下四种：

第一种（pH4.50.的磷酸-柠檬酸缓冲液）：溶剂为水，溶质及其浓度如下：100mM的磷酸氢二钠；采用柠檬酸调pH为4.5。

第二种（pH7.0100mM的磷酸-柠檬酸缓冲液）：溶剂为水，溶质及其浓度如下：100mM的磷酸氢二钠；采用柠檬酸调pH为7.0。

第三种（pH7.0的100mM Tris-HCl缓冲液）：溶剂为水，溶质及其浓度如下：100mMTris；用HCl调pH为7.0。

第四种（pH9.0的100mM Tris-HCl缓冲液）：溶剂为水，溶质及其浓度如下：100mMTris；用HCl调pH为9.0。

野生型漆酶及不同漆酶突变体在不同pH值下的稳定性测定方法如下：一方面，对各待测漆酶的酶活进行测定，具体测定方法参照实施例3进行，得到处理前漆酶活性。另一方面，取10μL待测漆酶置于1mL不同稳定性测试溶液中，室温放置24h，得到处理后漆酶待测液，并对其中漆酶的剩余活性进行测定，具体测定方法参照实施例3进行，得到处理后漆酶活性。然后，用处理后漆酶活性比上处理前漆酶活性，得到漆酶剩余活性比值（%）。实验重复三次，结果取平均值。

结果如图2所示，从图中可以看出，野生型漆酶及不同漆酶突变体除经pH7.0的Tris-HCl的缓冲体系处理组外，在较宽的pH范围内孵育24h（pH4.5-9.0），漆酶剩余活性比值都在60%以上。经pH4.5和pH7.0的磷酸二氢钾-柠檬酸缓冲液处理的漆酶突变体POXA1cΔ13、POXA1c-R5V和POXA1cΔ13-R5V的稳定性较野生型漆酶POXA1c均有提高，其中双突变体POXA1cΔ13-R5V的效果最为明显。