CN101955952B

CN101955952B - 一种细菌漆酶基因及其表达与应用

Info

Publication number: CN101955952B
Application number: CN2010102482180A
Authority: CN
Inventors: 肖亚中; 方泽民; 李同亮; 张学成; 彭惠; 房伟; 洪宇植
Original assignee: Anhui University
Current assignee: Anhui University
Priority date: 2010-08-02
Filing date: 2010-08-02
Publication date: 2012-05-09
Anticipated expiration: 2030-08-02
Also published as: CN101955952A

Abstract

本发明公开了一种细菌漆酶及其表达及其应用，其基因编码序列如SEQ ID No：1所示，该细菌漆酶是具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的多肽，本发明还公开了含有该细菌漆酶的表达菌株。本发明所述细菌漆酶来自海洋未培养微生物，在pH6-8范围内具有好的稳定性，45℃半衰期为73分钟，且对偶氮染料的脱色作用强，可用于工业染料的脱色。

Description

一种细菌漆酶基因及其表达与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说一种细菌漆酶及其表达，以及该细菌漆酶蛋白在工业上的应用。

背景技术

漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶，能够催化多种酚类和非酚类化合物氧化，同时伴随有分子氧还原成水。漆酶作用底物广泛、催化效率高，在生物制浆和漂白、食品风味改良、饲料营养改善、人工合成染料脱色、纺织纤维软化细化、新型药物开发、生物传感器制造及新型能源开发等领域具有潜在重要应用价值，近年来成为国际酶工程学和环境科学交叉领域研究的一个热点。

漆酶广泛存在于高等真菌(特别是担子菌)中。近年来，部分真菌漆酶已经应用于工业生产，如

Zylite等。然而，真菌漆酶受羟基离子的影响较大，在碱性条件下活性迅速降低，严重影响了其在工业中的应用。随着全基因组测序技术的迅速发展，人们发现，漆酶在细菌中同样广泛存在。细菌漆酶可以克服真菌漆酶的缺点，其在碱性条件下具有良好的催化活性并具有较高的稳定性。目前，已经在地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等微生物中发现漆酶，但被系统研究的细菌漆酶基因不超过20个，需要进一步开发与研究，且目前还没有细菌漆酶在工业方面应用的报道。

发明内容

本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种细菌漆酶及其表达该细菌漆酶基因的工程菌株。

本发明的细菌漆酶，其原始来源于中国南海海洋海水未培养微生物，其基因编码，具有如下核苷酸序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID No：1；

(2)序列表中的SEQ ID No：1经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；

(3)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸序列。

本发明的细菌漆酶，具有下列氨基酸序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID No：2；

(2)序列表中的SEQ ID No：2经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。

含有上述细菌漆酶基因的重组表达载体、宿主菌也是本发明的保护范围。

含有上述细菌漆酶基因的重组表达载体的构建方法，以包含细菌漆酶基因的BAC(Bacterial Artificial Chromosome)载体DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并与pMD18-T质粒连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有细菌漆酶基因(lac15)的pMD18-T重组质粒，用Nde I和Xho I双酶切所得的pMD18-T重组质粒和表达质粒载体，然后用T4连接酶将酶切后的lac15与表达质粒载体连接，得到连接产物；连接产物转化宿主菌，筛选阳性克隆，得到含有本发明lac15基因的工程菌株；其中所述引物为：

P1：5′-CATATGAACAGGCGAGACTTCCTGG-3′

P2：5′-CTCGAGTGCGACCTCCACCCAGGTCT-3′

上述构建方法中所述表达质粒载体指pCold、pET15、pET22或pET28等。

上述构建方法中所述宿主菌是指E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α、E.coli JM109或E.coli Rosetta等。

下面以表达质粒载体pET22b(+)、E.coli BL21(DE3)为例，具体介绍含有本发明细菌漆酶基因的重组表达菌株的构建方法，具体包括以下步骤：

(1)以包含细菌漆酶基因的BAC载体DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述引物为：

P1：5′-CATATGAACAGGCGAGACTTCCTGG-3′

P2：5′-CTCGAGTGCGACCTCCACCCAGGTCT-3′

(2)将步骤(1)所得PCR扩增产物和pMD18-T质粒连接，得连接产物；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有细菌漆酶基因(lac15)的pMD18-T重组质粒；

(3)用Nde I和Xho I双酶切步骤(2)所得的pMD18-T重组质粒和pET22质粒，然后用T4连接酶将酶切后的lac15与pET22b(+)质粒连接，得到连接产物；连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，得到含有本发明lac15基因的工程菌株BL21(DE3)。

与现有的细菌漆酶相比，本发明具有的优点为：(1)本发明细菌漆酶基因来自于海洋未培养微生物；2)本发明细菌漆酶在pH6-8范围内具有好的稳定性，45℃半衰期为73分钟；(3)本发明细菌漆酶对偶氮染料的脱色作用强，可用于工业染料的脱色。

保藏说明：本发明的菌株Escherichia Coli BL21(DE3)/pET22b(+)-lac15已送往中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection，CCTCC)保藏，保藏中心地址：中国湖北省武汉市武昌珞珈山；保藏编号：CCTCC NO：M2010160，保藏日期：2010年6月25日。

附图说明

图1为本发明PCR扩增产物的电泳图谱；

图1中1为分子量标准；2为PCR扩增产物。

图2为本发明表达载体pET22b(+)/lac15质粒的鉴定电泳图谱

图2中1为分子量标准；2为pET22b(+)/lac15质粒；3为经过Nde I/Xho I双酶切的pET22b(+)/lac15；4为经过NdeI/Xho I双酶切的pET22b(+)；5为重组pET22b(+)/lac15质粒PCR扩增产物。

图3为以丁香醛连氮为底物时测定的Lac15催化的最适pH和pH稳定性。

图3中○为最适pH，●为pH稳定性。

图4为以丁香醛连氮为底物时测定的Lac15催化的最适稳定和温度稳定性。

图4中○为最适pH，●为pH稳定性。

具体实施方式

下列实施例中的实施方法，如无特别说明，均为常规方法。

(一)、含有本发明细菌漆酶基因的表达菌株的构建

1、含有本发明细菌漆酶基因的阳性克隆的筛选及全长基因的获得

从中国南海海洋表层海水100L(24°21′17N，118°08′59E)，分离微生物并提取基因组，分离和提取方法同申请号为CN200810024342.1，按照试剂盒(购自Epicentre公司)提供的说明构建宏基因组文库。(Chu XM，He HZ，Guo CQ，Sun BL，2008.Identificationof two novel esterases from a marine metagenomic library derived from South ChinaSea.Appli.Microbiol.Biotechnol.80，615-625.)得到的单克隆放置于384孔板并于-70℃保存。

将每个384孔板中的菌株混合接种在同一LB液体培养基中培养，抽提混合质粒作为模板(萨姆布鲁克等著，黄培堂等译.2002，科学出版社，349-350.)，

以Cu1S：ACMWCKGTTCAYTGGCACGG；Cu2A：GGCTGTGGTACCAGAAKGT为引物，扩增本发明细菌漆酶基因Cu1和Cu2之间的DNA序列。PCR扩增程序如下：第一阶段变性94℃，3min；第二阶段变性94℃，30sec，退火50℃，30sec，延伸72℃，80sec，共进行35个循环；第三阶段延伸72℃，10min。得到的PCR产物用3％琼脂糖电泳检测，在140bp左右出现条带的初步认为是阳性克隆。利用上述方法将阳性克隆定位到单克隆。抽提上述得到阳性单克隆的质粒作为模板，以Cu1S：ACMWCKGTTCAYTGGCACGG，Cu4A：TGNTCNAGNAWGTGRCARTG为引物，扩增Cu1和Cu4之间的DNA序列。PCR扩增程序如下：第一阶段变性94℃，3min；第二阶段变性94℃，30sec，退火48℃，30sec，延伸72℃，150sec，共进行30个循环；第三阶段延伸72℃，10min。得到的PCR产物用1％琼脂糖电泳检测，将得到的1100bp左右的片段送到上海生工生物工程公司测序，获得编码序列。

选取Nde I(TaKaRa)对阳性克隆质粒进行单酶切，建立如下酶切体系：10ul 10×Hbuffer，4ug阳性克隆质粒，20U内切酶，补水至100ul。反应体系于37℃温育4h。常规的酚∶氯仿(25∶24，v/v)抽提和75％乙醇沉淀，60ul无菌水溶解DNA片段，-20℃保存备用。

在5ml EP管中建立如下自身环化连接体系：10ul 10×ligation buffer，5ul(约0.2ug)上述单酶切回收产物，1ul T4DNA连接酶(TaKaRa)，补水至100ul。反应体系在16℃保温16h。常规的酚∶氯仿(25∶24，v/v)抽提和75％乙醇沉淀，60ul无菌水溶解自身环化连接DNA片段，-20℃保存备用。

以上述自身环化连接产物为模板，以得到的1100bp左右的DNA序列为基础，设计反向PCR引物D15IS：5’-TACACTTGTGGATGCGGGTG，

D15IA：5’-AGACCCTTCGCAACTTGTTCCCAT-3’，扩增已知1100bp左右的DNA序列的侧翼序列。PCR程序如下：第一阶段变性94℃，5min；第二阶段变性94℃，1min，退火54℃，30sec，延伸72℃，5min，共进行30个循环；第三阶段延伸72℃，10min。得到的PCR产物用1％琼脂糖电泳检测，将得到的3.8kb左右的片段送到上海生工生物工程公司测序，获得侧翼编码序列，结合前期得到的1100bp长度片段，获得本发明细菌漆酶全长基因编码序列。2、细菌漆酶基因的扩增

设计一对寡核苷酸引物P1和P2，其序列为：

P1：5′-CATATGAACAGGCGAGACTTCCTGG-3′

P2：5′-CTCGAGTGCGACCTCCACCCAGGTCT-3′

在引物的5′分别引入Nde I和Xho I酶切位点，以步骤1抽提的BAC DNA为模板，扩增细菌漆酶基因。PCR反应程序如下：第一阶段变性94℃，5min；第二阶段变性94℃，1min，退火52℃，30sec，延伸72℃，2min，共进行30个循环；第三阶段延伸72℃，10min。得到的PCR产物用1％琼脂糖电泳检测，结果见图1。得到的细菌漆酶的核苷酸序列如SEQ IDNo：1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

3、表达载体的构建

将步骤2中得到PCR扩增产物，与pMD18-T质粒连接(TaKaRa)，建立如下酶切体系：25ng pMD18-T载体，50ngPCR扩增产物，5ul ligation mix，补水至10ul，16℃连接1h。连接产物热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到的转化子测序验证是否突变；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有细菌漆酶基因(lac15)的pMD18-T重组质粒；用Nde I和XhoI双酶切所得的pMD18-T重组质粒和pET22b(+)载体，然后用T4连接酶将酶切后的lac15与表达质粒载体连接，建立如下酶切体系：25ng pET22b(+)载体，50ng lac15酶切片段，3ul10×ligation buffer，1ul T4DNA连接酶(TaKaRa)，补水至30ul，16℃连接8h，得到连接产物；连接产物转化宿主菌，得到的转化子测序验证是否突变，挑选序列正确的转化子得到含有本发明lac15基因的工程菌株E.coli BL21(DE3)/lac15。

(二)、含本发明细菌漆酶基因工程菌的表达与蛋白纯化

将(一)中获得的基因的工程菌株E.coli BL21(DE3)/lac15接种于含有氨苄青霉素的200ml LB液体培养基中，放置于37℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝0.6(UNICO UV2102紫外可见分光光度计，以培养LB培养基为空白)；加入终浓度为1.0mM的IPTG进行诱导，并于16℃、180rpm条件下继续培养20小时；4℃、8000g离心收集菌体，加入0.1倍菌液体积的Binding buffer，350W冰浴条件下超声40min破碎细胞，30000g离心收集上清，得到粗酶液。

粗酶液经过Ni-NTA柱层析进行纯化。洗脱液中咪唑浓度分别为60mM、70mM、80mM、90mM、100mM，每个浓度洗脱3个柱体积。在咪唑浓度为90-100mM时，得到的蛋白经过检测达到SDS-PAGE纯度。

以丁香醛连氮为底物，纯化的细菌漆酶Lac15的最适pH为7.5，酶在pH5.5-8.0范围内有较高的稳定性，能够维持原酶活力的60％以上。以ABTS为底物，细菌漆酶Lac15的最适pH为4.5-5.0。Lac15在15℃-55℃范围内均能显示催化活性，其最适温度为45℃，45℃时酶的半衰期为73min。

(三)、含本发明细菌漆酶蛋白脱色偶氮染料能力检测

在pH7.5的Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液中加入终浓度为0.4g/L的偶氮类染料(活性深蓝M-2GE、活性艳橙K-7R、活性红KM-8B、活性红KD-8B)，加入终浓度为100ug/L的介体丁香酸甲酯、丁香醛或ABTS(2，2’-连氮基-双-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]，并加入终浓度为5U/L的经Ni-NTA柱层析纯化的细菌漆酶蛋白，40℃条件下反应1小时，测定不同染料在各自最大光吸收下的光吸收值(A1)，以失活的细菌漆酶蛋白为对照(A0)。脱色率通过下述公式计算：

Lac15对各种染料的脱色能力如下表所示(表1)：

表1不同介体存在条件下Lac15对各种染料的脱色能力(％)

Claims

1.一种编码细菌漆酶的基因lac15，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.如权利要求1基因编码的细菌漆酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

3.含有权利要求1所述的细菌漆酶基因的重组表达载体。

4.含有权利要求1所述细菌漆酶基因的宿主菌。

5.含有权利要求1所述细菌漆酶基因的重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以包含细菌漆酶基因的细菌人工染色体载体(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，所述引物为：

P1：5′-CATATGAACAGGCGAGACTTCCTGG-3′

P2：5′-CTCGAGTGCGACCTCCACCCAGGTCT-3′

(2)将步骤(1)所得PCR扩增产物和pMD18-T质粒连接，得连接产物；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有细菌漆酶基因lac15的pMD18-T重组质粒；

(3)用Nde I和Xho I双酶切步骤(2)所得的pMD18-T重组质粒和pET22b(+)质粒，然后用T4连接酶将酶切后的lac15与pET22b(+)质粒连接，得到连接产物；连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，得到含有lac15基因的工程菌株E.coliBL21(DE3)/lac15。

6.如权利要求1所述编码细菌漆酶的基因或权利要求2所述细菌漆酶在偶氮染料脱色方面的应用。