CN102816728A - β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建及其酶的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建及其酶的应用。β-1，4-内切木聚糖酶基因来源于热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，命名为木聚糖酶基因Cb Xyn10C。本发明采用生物工程技术，通过细菌的培养、目的基因提取、构建表达载体、及将载体转化到宿主细胞中等步骤构建成β-1，4-内切木聚糖酶工程菌。再将含有目的基因的大肠杆菌工程菌进行放大培养，然后通过超声破碎、对杂蛋白热失活，并通过进一步的分离纯化，获得嗜热木聚糖酶。本发明中的嗜热木聚糖酶具有很好的热稳定性，可用于造纸、食品、饲料、纺织和能源的生产领域中。

Description

β-1,4-内切木聚糖酶工程菌的构建及其酶的应用

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及一种β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建、利用该工程菌制备的嗜热木聚糖酶及该酶在工业中的应用。

背景技术

木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一类酶的总称。它是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的重要组分，它占植物碳水化合物总量的三分之一，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的可再生生物资源。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一类酶的总称。它可以将木聚糖降解为寡聚木糖、木糖和少量单糖。它在饲料、造纸、食品、制药以及能源工业中均有着广泛的应用。

β-1，4-内切木聚糖酶能够专一降解木聚糖为低聚木糖和木糖，主要从主链内部作用于木糖苷键。其作用方式是在不同位点上作用于木聚糖和长链木寡糖，从β-1，4-D-木聚糖主链的内部切割木糖苷键，从而使木聚糖降解为木寡糖。其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的低聚木糖，也有少量的木糖、阿拉伯糖和甘露糖微生物中木聚糖酶。根据木聚糖酶催化区域的结构和性质分析，可将其分为不同的家族，其中糖苷水解酶以第10家族和第11家族居多。由于来源菌株不同而导致其理化性质和分子量不尽相同，其分子量分布在7.7-150kDa，最适pH值分布在2-11。在过去20年中，有大量的木聚糖酶被分离纯化出来，它们的基因已经被克隆，并在大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母等系统中进行了表达。当前，木聚糖酶的应用领域不断扩大，它在造纸、食品、饲料、纺织、酿酒、医药、环境和能源等工业都有应用。但能够应用于工业生产的天然木聚糖酶却很少，工业用酶要求有较高的酶活性，良好的pH稳定性及热稳定性。到目前为止，国内有关木聚糖酶产生菌的报道较多，其中以真菌的研究居多，而细菌类研究偏少。

Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725是实验室购买的一株木聚糖酶产生菌株，可以在70-75℃的条件下生长，我们由此推断它所产生的木聚糖酶具有良好的热稳定性，具备应用于工业生产的潜力。我们应用转基因技术，将嗜热菌中的相关基因转接到更易培养的大肠杆菌中以高效表达。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种能应用于工业的嗜热内切木聚糖酶；

本发明的目的之二是提供编码上述嗜热木聚糖酶的基因；

本发明的目的之三是提供包含上述嗜热木聚糖酶基因的重组菌株；

本发明的目的之四是提供一种制备上述嗜热木聚糖酶的基因工程菌的构建方法；

本发明的目的之五是提供上述嗜热木聚糖酶的应用。

本发明中的内切木聚糖酶工程菌已于2011年12月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏编号为CGMCC No.5596。其分类命名为：大肠埃希氏菌，拉丁名：Escherichia coli。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种β-1，4-内切木聚糖酶工程菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，命名为木聚糖酶基因Cb Xyn10C。

所述木聚糖酶基因Cb Xyn10C来源于热解纤维素菌（Caldicellulosiruptor besciiDSM 6725）。

上述β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建方法，包括以下步骤：

Ａ、基因组DNA的提取

取5ml小试管培养的Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725，用细菌基因组DNA小量提取试剂盒提取细菌的基因组，得到基因组DNA溶液；

Ｂ、引物设计及用PCR法提取木聚糖酶目的基因

引物设计如下：

上游引物：5′GGGTCGCGGATCCATAGAAACTACTAAAAC 3′，划线部分为BamH Ⅰ的酶切位点；

下游引物：5′GGTGGTGCTCGAGTTATTCTTCTGGCACAACTG 3′，划线部分为Xho Ⅰ的酶切位点；

以步骤Ａ所得基因组DNA溶液为模板，在上述上游引物和下游引物的参与下进行PCR反应，得到扩增产物，再对扩增产物用扩增产物纯化试剂盒进行纯化，得到纯化的PCR产物，然后用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，37℃下保温2小时，然后用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳，再用DNA凝胶检测试剂盒回收酶切后的目的基因片段，得到Cb Xyn10C，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

Ｃ、构建重组表达载体

以pET28a为载体，对载体用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，37℃下保温2小时，再用磷酸酶（FastAP）处理去磷酸化，反应20分钟，用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，用胶回收试剂盒回收线性载体片段；

然后将目的基因片段与线性载体片段利用T4DNA连接酶连接，得到重组表达载体；

Ｄ、将重组表达载体转化到宿主细胞中

将步骤Ｃ所得重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）Codon Plus中，用含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基进行阳性克隆筛选，得到含有目的基因的大肠杆菌工程菌。

所述的PCR反应的反应体系按以下方法配制：DNA聚合酶（Primer star）1μl，DNA聚合酶缓冲液（Primer star buffer）20μl，作为模板的基因组DNA溶液2μl，2.5mM脱氧核苷酸混合物（dNTP）8μl，上下游引物各加40pmol，加超纯水至总体积100μl；所述的PCR反应的反应程序为：95℃预变性3min；然后95℃变性30s，57℃退火10s，72℃延伸120s，再72℃延伸15min，共30个循环。

步骤Ｃ所述的用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切的酶切体系包括：pET28a空载体45μl，上下游引物各2μl，FD-buffer 7μl，加ddH₂O14μl至总体积70μl。

所述的脱氧核苷酸混合物是脱氧腺嘌呤苷酸、脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物，每种核苷酸的浓度均为25nmol/L。

所述的嗜热木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，该嗜热内切木聚糖酶的最适反应温度为68℃，最适pH为6.7。

上述的嗜热木聚糖酶的制备方法是，将含有目的基因的大肠杆菌工程菌进行放大培养，然后通过超声破碎、对杂蛋白热失活，并通过进一步的分离纯化，即得到嗜热木聚糖酶。

上述的嗜热木聚糖酶用于造纸、食品、饲料、纺织和能源的生产领域中。

热解纤维素菌（Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725）是一株极度嗜热的细菌，可以降解纤维素，半纤维素，其最适生长温度为75℃。菌种购买于德国微生物菌种保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)，通过NCBI对热解纤维素菌（Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725）的全基因组进行预测，发现其全基因组的701714-703783区域的核苷酸可以编码一种木聚糖酶，该段基因序列我们命名为木聚糖酶基因Cb Xyn10C。但是Caldicellulosiruptor besciiDSM 6725是一种厌氧菌，需要在严格厌氧条件下培养，且培养方法复杂，如果直接用该菌株来生产此木聚糖酶不仅生产成本高而且周期长，满足不了工业应用，因此，我们尝试将该基因导入易培养、可快速繁殖的大肠杆菌内，可解决该问题，满足工业需求。

附图说明

图1是纯化得到的木聚糖酶Cb Xyn10C的电泳图；

图2是木聚糖酶Cb Xyn10C的pH-活力曲线；

图3是木聚糖酶Cb Xyn10C的温度-活力曲线；

图4是木聚糖酶Cb Xyn10C的热稳定性-活力曲线；

图5是木聚糖酶Cb Xyn10C的底物特异性。

具体实施方式

实施例1：嗜热酶工程菌的构建及酶的表达

一、目的基因提取，引物设计及用PCR法提取木聚糖酶目的基因

取5ml小试管培养的Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725，用细菌基因组DNA小量提取试剂盒提取细菌的基因组，所得染色体DNA溶液放4℃冰箱备用。

嗜热细菌Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725基因组中的701714-703783区域的核苷酸可以编码一种木聚糖酶。选择如表SEQ ID No.1所示的Xyn10C作为研究对象。根据基因的序列及载体的限制性内切酶位点而设计设计引物，委托上海生工生物工程公司合成。该引物用以扩增上述得到的基因组。

上游引物：5′GGGTCGCGGATCCATAGAAACTACTAAAAC 3′，划线部分为BamH Ⅰ的酶切位点；

下游引物：5′GGTGGTGCTCGAGTTATTCTTCTGGCACAACTG 3′，划线部分为Xho Ⅰ的酶切位点；

两个引物所设置的酶切位点与表达载体pET28a的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ相匹配。

PCR反应体系：在100μl反应体系中含有1μl Primer star DNA聚合酶，Primerstar buffer20μl，模板DNA 2μl，2.5mM dNTP混合物（每种核苷酸浓度25nmol/L）8μl，上下游引物各加40pmol，加ddH₂O至总体积100μl。PCR反应条件为：95℃预变性10min；循环程序为95℃变性30s，57℃退火10s，72℃延伸120s；最后再72℃延伸15min，共30个循环。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，分子量大小为2070bp，与预测的结果一致。使用PCR产物纯化试剂盒对扩增产物进行纯化。

将纯化的PCR产物用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切。37℃下保温2小时。酶切完毕后用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳，再用DNA凝胶检测试剂盒回收酶切后的DNA片段。

用同样的限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ来酶切pET28a载体，反应体系为70μl，体系包括：pET28a空载体45μl，Nco Ⅰ和Xho Ⅰ各2μl，FD-buffer 7μl，加ddH₂O14μl至总体积70μl。37℃下保温2小时，用磷酸酶（FastAP）处理去磷酸化，反应20分钟，用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，应用胶回收试剂盒回收。

二、重组载体的制备及在宿主细菌中的表达

将处理过的目的基因片段与线性载体片段利用T4DNA连接酶(NEB公司)连接。将连接产物转入大肠杆菌BL21（DE3）Codon Plus中，用含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基进行阳性克隆筛选。随机挑取单克隆进行测序，结果与报道的一致，证明目的基因已经与载体连接并转化到宿主中。

测序正确后，提取重组质粒转化到Escherichia coli BL21(DE3)CodonPlus中进行表达pET28a-cbxyn10C-his。挑取阳性转化菌接种到5ml含有50ug/ml卡那霉素的培养液中37℃振荡培养过夜；次日接种到100ml新鲜的含卡那霉素的2YT培养基中，37℃继续培养4h。将初步放大的种子液以1%的比例接入1L的2YT培养基中培养（37℃，120rpm/min），其中加入了100mg/ml的卡那霉素，当OD₆₀₀达到0.8左右时加入200mg/ml的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），降低培养温度至25℃，对菌体进行诱导使其产生大量目的蛋白，同时避免产生酶的包涵体，培养16小时后收获菌体。

10000rpm,10min离心收集菌体；加入50mM，pH8.0的Tris-HCl缓冲液重悬菌体；超声破碎（1s×1s，30min）；破碎液在55℃下热失活30min；4℃，13000rpm离心30min，取上清即为粗酶液。

因为所表达的目标蛋白N-端含有组氨酸标签，应用镍亲和柱对重组蛋白进行纯化，用1M咪唑洗脱与柱料结合的重组酶，洗脱体积为10ml。洗脱液过夜层析后产生沉淀；4℃，10000rpm,10min离心得到上清，即为目的酶；在pH7.0、温度55℃条件下，以Oat-spelt为底物测定不同处理后的酶活力以及相应的蛋白浓度（蛋白浓度通过Bradford法测定，以牛血清白蛋白作为标准品），得到不同处理后的蛋白纯化表，如表1所示。应用SDS-PAGE（12%）电泳检测重组蛋白的纯度，可见70KDa附近可见一条电泳条带，如图1所示。

实施例2：重组木聚糖酶Cb Xyn10C的活性分析

使用DNS法分析重组木聚糖酶活性。在pH6.7，68℃条件下，300μl的反应体系包括：5uL适当稀释的酶液，150uL1%的底物（g/100mL），60μl缓冲液（20mM）和85μl ddH₂O；反应5min，加入600μl DNS终止反应；沸水煮5min，冷却。540nm测定OD值，以木糖为标准曲线，计算酶活力。1个酶活单位（U）定义为在给定条件下每分钟降解1%的木聚糖溶液释放1umol还原糖所需要的酶量。

实施例3：重组木聚糖酶Cb Xyn10C的性质测定

一、重组木聚糖酶Cb Xyn10C的最适pH的测定方法如下：

最适pH的测定是以宽范围pH缓冲液(成分为乙酸、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸、N-三羟甲基甲基-3-氨基丙磺酸、3-环已胺基丙磺酸、2-码啉乙磺酸)为反应体系，在60℃精确配制浓度为100mM不同pH值的缓冲液。以Oat-spelt作为底物，测定酶在上述pH条件下活力的变化。结果如图2所示，表明Cb Xyn10C的最适pH为6.7，在pH6.0-8.5的范围内，酶活性可以维持最大酶活性的60%以上。

二、重组木聚糖酶Cb Xyn10C的最适反应温度和热稳定性的测定方法

最适温度是以Oat-spelt作为反应底物，在宽范围缓冲液（pH6.7）体系及40-85℃的温度范围内测定磷酸三酯酶活力。热稳定性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在55℃下进行酶活测定。酶反应最适温度测定结果（图3）表明最适温度为68℃。酶的热稳定性试验表明如图4所示，表明木聚糖酶在55℃下稳定性非常好，在60℃下保温50min仍然可以保持50%的酶活力。

三、金属离子对酶活力的影响

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子（主要包括Mg²⁺﹑Ni²⁺﹑Zn²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺，Mn²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺），研究其对酶活性的影响，在最适条件（68℃、pH6.7）下测定酶活性。结果表明：二价金属离子在1mM条件下，部分离子有较大抑制作用，10mM条件下各离子普遍对其有较大的抑制作用。不同浓度条件下它们对酶活力的影响如表2所示。

四、底物特异性

分别以Birchwood，Beechhood，Oat Spelts，CMC（低粘度）为底物，在68℃，pH6.7的条件下测定Cb Xyn10C的底物特异性。用实施例2中的反应体系，每种底物测定3组平行数据，取平均值为酶活力值，以底物对相对酶活力作图即得Cb Xyn10C底物特异性曲线，如图5所示。木聚糖酶对不同底物的动力学参数如表3所示。

五、木聚糖酶的Kcat和Km值测定方法如下：

分别以不同浓度Birchwood，Beechhood，Oat Spelts作为底物，在宽范围缓冲液（pH6.7）缓冲体系中，68℃下测定酶活性，计算Km和Kcat值。

经测定，Birchwood的Km为3.29mg/ml,Kcat为222.9s-1，最大反应速度为0.00457umol/s；Beechhood的Km为2.34mg/ml,Kcat为315.4s-1，最大反应速度为0.00534umol/s；Oat Spelts的Km为3.41mg/ml,Kcat为215.9s-1，最大反应速度为0.00516umol/s。

表1.木聚糖酶Cb Xyn10C的蛋白纯化表

表2金属离子对Cb Xyn10C酶活力的影响

表3.木聚糖酶对不同底物的动力学参数比较表

Claims (9)

1.一种β-1，4-内切木聚糖酶工程菌，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，命名为木聚糖酶基因Cb Xyn10C。

2.如权利要求1所述的β-1，4-内切木聚糖酶工程菌，其特征在于：所述木聚糖酶基因Cb Xyn10C来源于热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)。

3.如权利要求1所述的一种β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、基因组DNA的提取

取5ml小试管培养的Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725，用细菌基因组DNA小量提取试剂盒提取细菌的基因组，得到基因组DNA溶液；

B、引物设计及用PCR法提取木聚糖酶目的基因

引物设计如下：

上游引物：：5′GGGTCGCGGATCCATAGAAACTACTAAAAC 3′，划线部分为BamH I的酶切位点；

下游引物：5′GGTGGTGCTCGAGTTATTCTTCTGGCACAACTG 3′，划线部分为Xho I的酶切位点；

以步骤A所得基因组DNA溶液为模板，在上述上游引物和下游引物的参与下进行PCR反应，得到扩增产物，再对扩增产物用扩增产物纯化试剂盒进行纯化，得到纯化的PCR产物，然后用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切，37℃下保温2小时，然后用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，再用DNA凝胶检测试剂盒回收酶切后的目的基因片段，得到Cb Xyn10C，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

C、构建重组表达载体

以pET28a为载体，对载体用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切，37℃下保温2小时，再用磷酸酶(FastAP)处理去磷酸化，反应20分钟，用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，用胶回收试剂盒回收线性载体片段；

然后将目的基因片段与线性载体片段利用T4DNA连接酶连接，得到重组表达载体；

D、将重组表达载体转化到宿主细胞中

将步骤C所得重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)Codon Plus中，用含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基进行阳性克隆筛选，得到含有目的基因的大肠杆菌工程菌。

4.如权利要求3所述的β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建方法，其特征在于：所述的PCR反应的反应体系按以下方法配制：DNA聚合酶(Primer star)1μl，DNA聚合酶缓冲液(Primer star buffer)20μl，作为模板的基因组DNA溶液2μl，2.5mM脱氧核苷酸混合物(dNTP)8μl，上下游引物各加40pmol，加超纯水至总体积100μl；所述的PCR反应的反应程序为：95℃预变性3min；然后95℃变性30s，57℃退火10s，72℃延伸120s，再72℃延伸15min，共30个循环。

5.如权利要求3所述的β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建方法，其特征在于：步骤C所述的用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切的酶切体系包括：pET28a空载体45μl，上下游引物各2μl，FD-buffer 7μl，加ddH₂O 14μl至总体积70μl。

6.如权利要求3所述的β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建方法，其特征在于：所述的脱氧核苷酸混合物是脱氧腺嘌呤苷酸、脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物，每种核苷酸的浓度均为25nmol/L。

7.一种用权利要求1或3所述的β-1，4-内切木聚糖酶工程菌制备的嗜热木聚糖酶，其特征在于：所述的嗜热木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，该嗜热内切木聚糖酶的最适反应温度为68℃，最适pH为6.7。

8.一种如权利要求7所述的嗜热木聚糖酶的制备方法，其特征在于：将含有目的基因的大肠杆菌工程菌进行放大培养，然后通过超声破碎、对杂蛋白热失活，并通过进一步的分离纯化，即得到嗜热木聚糖酶。

9.一种如权利要求7所述的嗜热木聚糖酶的应用，其特征在于：所述的嗜热木聚糖酶用于造纸、食品、饲料、纺织和能源的生产领域中。

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