CN105368740A - 粘滑白蚁球菌TSB47、木聚糖酶TmXyn1及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及粘滑白蚁球菌TSB47、木聚糖酶TmXyn1及其编码基因和应用。所述粘滑白蚁球菌TSB47，已于2015年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？1.12901。所述木聚糖酶TmXyn1的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。本发明所述木聚糖酶TmXyn1在低温和中温条件下具有酶活活性高且稳定的优点，在木聚糖酶的工业应用具有重要的实践价值，在食品、饲料等行业中具有广阔的应用前景。

Description

粘滑白蚁球菌TSB47、木聚糖酶TmXyn1及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及粘滑白蚁球菌TSB47、木聚糖酶TmXyn1及其编码基因和应用。

背景技术

木质纤维素是自然界最丰富的生物质资源，对其进行综合利用对人类社会的可持续发展具有重要意义。在自然界能降解木质纤维素的微生物主要是一些真菌和细菌，对这些微生物资源的挖掘将有助于对生物质的开发与利用。木质纤维素由纤维素、半纤维素和木质素这三种高分子化合物组成，在自然界能稳定存在。降解木质纤维素需要一系列复杂酶系中多种酶的相互作用。能降解木质纤维素的微生物均含有丰富的纤维素酶、半纤维素酶等，因此，从自然环境中筛选纤维素降解菌，将具有良好的开发与应用前景。

木聚糖在半纤维素中含量丰富，结构要比纤维素复杂，完全降解木聚糖需要多种水解酶(即木聚糖降解酶系统)的协同作用。木聚糖酶(E.C3.2.1.8)是一类以内切方式降解木聚糖分子中β-1,4-木糖苷键的酶系。内切-β-1,4-木聚糖酶是木聚糖降解的主要作用酶，它与β-木糖苷酶共同作用可以使木聚糖降解为木糖或者木聚寡糖。近年来，木聚糖酶在食品、纺织、饲料、能源工业中都显示了广阔的应用前景。在仔猪饲料中添加含有木聚糖酶的复合酶制剂能够提高干物质、粗蛋白质粗纤维等的表观消化率以及降低粪便中大肠杆菌数和腹泻率。在造纸工业中，应用半纤维素酶进行预漂、助漂，可以降低化学药品的使用量，已经成为一种较为成熟的工艺技术。在果汁生产过程中，采用木聚糖酶、纤维素酶和果胶酶共同处理能够降低提取液的粘度，有利于过滤和浓缩。但在实际的生产以及应用过程中，需要一些在中温和低温条件下稳定并且能够较好地发挥酶活作用的木聚糖酶。因此，获得活性高且在中温和低温稳定的木聚糖酶对于木聚糖酶的工业应用具有重要的实践价值。

发明内容

本发明目的在于提供一株粘滑白蚁球菌，该粘滑白蚁球菌的基因组中含有多个纤维素酶基因和半纤维素酶基因。

本发明的第二个目的在于提供一种在低温和中温条件下酶活活性高且稳定的木聚糖酶。

本发明的另一个目的在于提供一种编码所述木聚糖酶的基因。

本发明的又一个目的在于提供一种包含所述编码木聚糖酶的基因的重组载体、转化子、重组病毒、重组菌和转基因细胞系。

本发明的再一个目的在于提供所述木聚糖酶在降解木聚糖方面的应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一株粘滑白蚁球菌，该菌株命名为粘滑白蚁球菌TSB47(TermitidicoccusmucosusTSB47)，已于2015年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC1.12901。

上述粘滑白蚁球菌TSB47的菌落形态及生理生化特性为：菌落呈白色、圆形、边缘整齐、湿润、有光泽、不透明，菌细胞为大小约0.5～0.8μm的球菌，有一个至多个疣突，革兰氏染色阴性，不产孢，无鞭毛或周毛，不具有运动性(图1)；该菌生长温度范围为20℃-35℃，生长pH范围为5.5-9.0，生长盐度范围为0％-2.0％，能利用L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、D-半乳糖、果糖、D-甘露糖、山梨醇等为碳源生长，能同化精氨酸、尿素、七叶灵、对硝基-β-D-甲基半乳糖，具有碱性磷酸盐酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶等酶的活性；该菌不能水解酪素，氧化酶、触酶、酯酶、纤维素酶和淀粉水解酶均为阴性；细胞壁氨基酸主要成分为：组氨酸、甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和高丝氨酸等。

上述粘滑白蚁球菌TSB47的基因序列特征为：粘滑白蚁球菌TSB47基因组大小约为7.29Mb，具有5520个编码基因；该菌基因组中含有多个纤维素酶基因，包括3个内切葡聚糖酶基因，14个葡萄糖苷酶基因；还含有多种多样的半纤维素酶基因，其中木聚糖酶基因有4个，β-木糖苷酶基因有3个，半乳糖苷酶基因有41个。采用BLAST分析法将16SrRNA基因序列与GenBank数据库进行比对分析，发现该菌株与Opitutaceae科内细菌OpitutaceaebacteriumTAV1的亲缘关系最接近，但同源性也仅达98％，与Opitutaceae科内其他已描述菌株的同源性均低于92.5％。但是迄今为止未见对OpitutaceaebacteriumTAV1菌株的特征描述，而本发明所述菌株的生理生化等特征与除OpitutaceaebacteriumTAV1以外的其它菌株有明显差异，本发明中，将该菌命名为TermitidicoccusmucosusTSB47(粘滑白蚁球菌TSB47)，该菌与Opitutaceae科其它属细菌的系统发育关系详见图2。

一种来自于粘滑白蚁球菌TSB47的木聚糖酶，命名为木聚糖酶TmXyn1，其特征在于，所述木聚糖酶TmXyn1的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

一种编码上述木聚糖酶TmXyn1的基因。所述编码基因，为任何编码上述木聚糖酶TmXyn1的DNA序列。

上述方案中，所述编码木聚糖酶TmXyn1的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

一种包含上述编码木聚糖酶的基因的重组载体、转化子、重组病毒、重组菌和转基因细胞系。

上述木聚糖酶TmXyn1在降解木聚糖方面的应用。

本发明的有益效果如下：本发明筛选获得了一株具有多种纤维素降解酶的粘滑白蚁球菌TSB47，从粘滑白蚁球菌TSB47的基因中筛选获得了木聚糖酶TmXyn1的编码基因，通过构建重组质粒获得重组菌、编码基因表达后获得了木聚糖酶TmXyn1；本发明所述木聚糖酶TmXyn1在低温和中温条件下具有酶活活性高且稳定的优点，在木聚糖酶的工业应用具有重要的实践价值，在食品、饲料等行业中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为粘滑白蚁球菌TSB47的扫描电镜图片。

图2为粘滑白蚁球菌TSB47的系统发育分析图

图3为木聚糖酶TmXyn1最适反应温度的测定结果。

图4为木聚糖酶TmXyn1温度稳定性的测定结果。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1粘滑白蚁球菌TSB47的研究

本实验室从黑胸散白蚁肠道分离培养获得了一株粘滑白蚁球菌，命名为粘滑白蚁球菌TSB47。

(一)、对粘滑白蚁球菌TSB47的形态学特征和生长特性作如下研究：

粘滑白蚁球菌TSB47在1/3BHI培养基(配方：蛋白胨3.3g/L，脱水小牛脑浸粉4.2g/L，脱水牛心浸粉1.7g/L，氯化钠1.7g/L，葡萄糖0.7g/L，磷酸氢二钠0.8g/L，pH值7.4)中30℃恒温培养。将粘滑白蚁球菌TSB47接种到1/3BHI固体培养基培养五天，在平板上形成白色、圆形、边缘整齐、湿润、有光泽、不透明的菌落，菌细胞为大小约0.5～0.8μm的球菌(扫描电镜图片见图1)，有一个至多个疣突，革兰氏染色阴性，不产孢，无鞭毛或周毛，不具有运动性。将粘滑白蚁球菌TSB47以5％的接种量接种到1/3BHI液体培养基培养，测得该菌生长温度范围为20℃-35℃，最适生长温度为25℃左右；生长pH范围为5.5-9.0，最适生长pH为7.5；在0％-2.0％盐度范围内可以生长，最适生长盐度为0.5％。

(二)、对粘滑白蚁球菌TSB47的生理生化特性作如下研究：

(1)碳源利用：应用API50CH试剂条研究粘滑白蚁球菌TSB47对碳源利用的特性，结果表明，该菌可以利用L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、D-半乳糖、D-果糖、D-甘露糖、山梨醇、七叶灵等底物代谢产酸。

(2)细胞内酶活性与同化作用：应用APIZYM和API20NE试剂条研究粘滑白蚁球菌TSB47的细胞内酶活性和同化作用，结果表明，该菌具有碱性磷酸盐酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶等酶的活性；能够同化精氨酸、尿素、七叶灵、对硝基-β-D-甲基半乳糖等，具有精氨酸双水解酶、脲酶、β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶等酶的活性。

(3)氧化酶、触酶等其它酶活性：以粘滑白蚁球菌TSB47菌细胞作用等体积的1wt％(质量浓度)对-氨基二甲基苯胺盐酸盐水溶液和1vt％(体积浓度)α-奈酚乙醇溶液，根据颜色反应说明该菌氧化酶为阴性；以菌细胞作用5vt％H₂O₂未产生气泡，说明其触酶为阴性；粘滑白蚁球菌TSB47能将硫代硫酸钠还原为亚硫酸盐并释放出H₂S；此外，该菌不能水解酪素，酯酶、纤维素酶和淀粉水解酶均为阴性。

(4)细胞壁氨基酸组分分析：收集粘滑白蚁球菌TSB47菌细胞，制成全细胞水解液，用薄层分析的方法进行测试，结果表明，该菌细胞壁氨基酸组分主要为：组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)、高丝氨酸(Hom)等。

(三)、对粘滑白蚁球菌TSB47基因组的研究

以1/3BHI液体培养基培养粘滑白蚁球菌TSB47，收集菌细胞，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取粘滑白蚁球菌TSB-47的基因组DNA。使用Hiseq(大片段文库)或Miseq(小片段文库)测序平台对样品进行测序。对测序结果进行分析，结果表明，粘滑白蚁球菌TSB47基因组大小约为7.29Mb，具有5520个编码基因；该菌基因组中含有多个纤维素酶基因，包括3个内切葡聚糖酶基因，14个葡萄糖苷酶基因；还含有多种多样的半纤维素酶基因，其中木聚糖酶基因有4个，β-木糖苷酶基因有3个，半乳糖苷酶基因有41个；此外，该菌基因组还含有一些与氮代谢相关的基因。

采用BLAST分析法将粘滑白蚁球菌TSB47的16SrRNA基因序列与GenBank数据库进行比对分析，发现该菌株与Opitutaceae科的细菌OpitutaceaebacteriumTAV1的亲缘关系最接近，但同源性仅为98％，与Opitutaceae科内其他已描述菌株的同源性均低于92.5％。但是迄今为止未见对OpitutaceaebacteriumTAV1菌株的特征描述，而本发明所述菌株的生理生化等特征与除OpitutaceaebacteriumTAV1以外的其它菌株有明显差异。粘滑白蚁球菌TSB47，已于2015年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC1.12901。

实施例2木聚糖酶TmXyn1及其编码基因

(一)、木聚糖酶TmXyn1的制备

(1)PCR扩增获得木聚糖酶TmXyn1的编码基因：以粘滑白蚁球菌TSB47的基因组DNA为模板，用引物195930aF、195930aR(引物序列见下表1)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物1092bp。经NCBI比对发现该基因所编码的蛋白氨基酸序列较新，与来源于疣微菌科的细菌Pedosphaeraparvula的内切-β-1,4-木聚糖酶的序列相似性最高仅为62％。

表1用于克隆木聚糖酶TmXyn1的引物

(2)酶切、连接：用BamHI和XhoI双酶切PCR扩增产物，与预先使用BamHI和XhoI双酶切的pET-30a(+)(购自Novagen，产品目录号为69909-3)进行连接，得到重组载体。

(3)转化、筛选以及测序验证：用氯化钙化学转化法将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，用含有卡拉霉素(50μg/ml)的LB培养基进行筛选培养，挑取单菌落，并进行扩大培养和提取质粒，进行测序验证；获得的序列如SEQIDNO.1所示(即为木聚糖酶TmXyn1的编码基因)，证明构建的质粒及重组菌正确；将阳性克隆记作TmXyn1-PET30a(重组菌)。

(4)酶的表达：挑取TmXyn1-PET30a单菌落接入含有卡拉霉素(50μg/ml)的LB培养基中，于37℃过夜培养，将过夜培养物接种于1L含有卡拉霉素(50μg/ml)的LB培养基，37℃剧烈振荡(200rpm)培养，至发酵液的OD₆₀₀值达到0.4～0.6左右，再向发酵体系中加入IPTG(终浓度0.2mM)，25℃条件下再培养16-20小时。发酵完毕后，6000rpm离心5分钟，收集菌体；用pH8.0的BufferB重悬菌体，超高压破碎后在4℃下，10,000g离心30min，取上清液，即为含有目的蛋白的粗酶液。

(5)酶的纯化：采用镍柱亲和层析进行纯化，用HisPurNiNTAResin(Thermo)纯化上清，上清液用0.45μm滤器过滤。

a镍柱重生：用5-10倍柱体积的MES(20mM，pH5.0)洗柱，再用5-10倍柱体积的BufferB洗柱；b.将上清液加入到镍柱中，4℃过夜结合；c.用3-5倍的BufferC洗柱，再用3-5倍的BufferD洗柱；d.用BufferE洗脱目的蛋白，收集到1.5ml的EP管中，每次加入BufferE600μl，共加8次，12％SDS-PAGE电泳检测纯化蛋白的纯度；e.洗脱完目的蛋白后，先用5-10倍柱体积的MES洗柱，然后用5-10倍的灭菌去离子水洗柱，加入20％酒精，4℃保存；f.将纯化的蛋白注入透析袋(20DM)中，置于透析液中(20mMNaH2PO4，pH5.2)，4℃过夜透析。

所述BufferB(BindingBuffer，pH8.0)：50mMNaH₂PO₄，300mMNaCl；BufferC(WashingBuffer，pH8.0)：50mMNaH₂PO₄，300mMNaCl，5mM咪唑；BufferD(WashingBuffer，pH8.0)：50mMNaH₂PO₄，300mMNaCl，60mM咪唑；BufferE(ElutionBuffer，pH8.0)：50mMNaH₂PO₄，300mMNaCl，250mM咪唑。

(6)酶活检测：采用DNS法测定木聚糖酶酶活，取50μl适当稀释的酶液，加入100μL1％木聚糖(Sigmabeechwoodxylan)溶液，35℃温育30min，加入200μlDNS溶液后，沸水浴5min，冷却到室温后，加入1ml去离子水，540nm处测定吸光值。

酶活定义：每分钟水解木聚糖产生1μmol木糖的酶量定义为一个酶活单位。

1％木聚糖(Sigmabeechwoodxylan)溶液的组成：1g木聚糖溶于100mL0.1M乙酸-乙酸钠缓冲液(SAB，pH5.2)中。

DNS溶液的组成：称取185g酒石酸钾钠加到500ml去离子水中，在磁力搅拌器上搅拌至完全溶解后，加21.0gNaOH，然后再加入6.3g3,5-二硝基水杨酸(避光)，易形成结块，不断搅拌，颜色会逐渐变得深红；完全溶解后再加5g无水亚硫酸钠，5g结晶酚(结晶酚事先放到55度水浴锅中溶解，通过密度计算加入4.673ml)，按次序加；棕色瓶室温贮藏，放置一周以上后才可用。

制作DNS标准曲线，将酶液测定结果与DNS标准曲线比对，得到酶液中酶活的量。

对照组：同时将空载体pET-30a(+)转化至大肠杆菌BL21(DE3)，筛选验证，得到含有空载体pET-30a(+)的阳性克隆，记作BL21-pET-30a(+)，作为对照菌。按照上述步骤将对照菌进行酶的表达和纯化，对纯化得到的液体进行酶活检测。

实验设3次重复，实验组检测均具有木聚糖酶活性，而对照组均未检测到木聚糖酶酶活。

(二)、木聚糖酶TmXyn1的性能测定

(1)木聚糖酶TmXyn1的最适温度：比较木聚糖酶在不同温度下的酶活，测定其最适温度。最适温度的测定是在SAB缓冲液(pH5.2)中于不同温度下(10-55℃)进行酶促反应，测定木聚糖酶酶活。实验过程重复3次。

(2)木聚糖酶TmXyn1耐热稳定性测定：取在特定温度下处理不同时间的木聚糖酶酶液进行剩余酶活的测定。剩余酶活(％)＝P/Pmax*100％。其中P为木聚糖酶在25℃，30℃，35℃，40℃，45℃条件下分别处理不同时间，取样后迅速置于冰上，在35℃，pH5.2条件下测定的酶活。Pmax为木聚糖酶未进行热处理在35℃，pH5.2条件下测定的酶活。实验过程重复3次。

(3)木聚糖酶TmXyn1的Km和Vmax值测定：在酶促反应的最适反应条件下，以1wt％的山毛榉木聚糖为底物，依次在酶促反应的5、10、15、20，25，30min时测定酶的活性，并计算出酶活性与反应时间的比值，在一定时间内比值保持不变，在此时间内的酶促反应为一级反应，此时间内均可做为测Km和Vmax的反应时间。配0.1wt％，0.2wt％，0.3wt％，0.4wt％，0.5wt％，0.6wt％，0.7wt％，0.8wt％的山毛榉木聚糖为底物，取酶蛋白与各浓度山毛榉木聚糖(pH5.2)混合，35℃反应20min，测定酶活力。利用米氏方程双倒数法计算出Km和Vmax值。

木聚糖酶TmXyn1最适反应温度为35℃(见图2)。在25℃～35℃温育90min后，仍然有超过60％的剩余酶活(见图3)，在40℃温育60min后，剩余酶活约40％，而在45℃温育30min后便失去酶活，说明TmXyn1在低温和中温下比较稳定，不耐高温。木聚糖酶TmXyn1的比活力为37.91U/mg，以山毛榉木聚糖为底物，测得Km值和Vmax值分别为2.40mg/ml和65.03U/mg。由此，上述实验结果表明本发明获得的木聚糖酶TmXyn1在中温和低温条件下，其酶活活性较高且比较稳定，但不耐高温。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (6)

1.一株粘滑白蚁球菌，其特征在于，该菌株命名为粘滑白蚁球菌TSB47，已于2015年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC1.12901。

2.一种木聚糖酶，命名为木聚糖酶TmXyn1，其特征在于，所述木聚糖酶TmXyn1的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

3.一种编码权利要求2所述木聚糖酶TmXyn1的基因。

4.根据权利要求3所述的基因，所述编码木聚糖酶TmXyn1的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

5.包含权利要求3~4任一所述编码木聚糖酶TmXyn1的基因的重组载体、转化子、重组病毒、重组菌和转基因细胞系。

6.权利要求2所述木聚糖酶TmXyn1在降解木聚糖酶方面的应用。