CN102978188A

CN102978188A - 一种宽pH作用范围木聚糖酶及其应用

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Publication number: CN102978188A
Application number: CN201210284346XA
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 陈晟; 何洁; 宿玲恰; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-08-06
Filing date: 2012-08-06
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2032-08-06
Also published as: CN102978188B

Abstract

本发明提供一种宽pH作用范围木聚糖酶XynA（EC 3.2.1.8)及其应用，属于酶工程和基因工程领域。该木聚糖酶XynA来源于Streptomyces sp.HJ，其最适pH5.5，pH稳定范围3～11；最适温度60℃，50℃半衰期为30h；K_m和V_max分别为3.45mg/mL，845.23μmol/min/mg。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1，成熟蛋白436个氨基酸残基。重组XynA在E.coli BL21(DE3)中表达胞外酶活为213.5U/mL，是野生菌Streptomyces sp.HJ酶活的11倍。XynA有较宽的pH作用范围，尤其在碱性环境下，其可能在竹原纤维生物酶脱胶、纸浆漂白等行业具有潜在利用价值。

Description

一种宽pH作用范围木聚糖酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种木聚糖酶及其应用，特别是一种宽pH作用范围的木聚糖酶，属于酶工程和基因工程领域。

背景技术

木聚糖（Xylan)（EC 3.2.1.8)是植物细胞壁半纤维素组分的主要成分，占植物碳水化合物总量的三分之一。在自然界中，木聚糖是继纤维素之后含量最为丰富的多聚糖。木聚糖的主链由多个毗喃木糖基通过β-1,4-糖苷键连结形成，侧链含多种不同取代基。木聚糖酶属于O-glycoside hydrolases（EC 3.2.1.x），可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖单糖。它是一种复合酶，主要包括endo-β-1,4-xylanase（EC 3.2.1.8）和β-xylosidase（EC3.2.1.37）。前者从主链内部随机作用于β-1,4-糖苷键，将木聚糖分解成低聚木糖；后者则作用于低聚木糖的末端，释放出木糖单糖。

目前已经发现的endo-β-1,4-xylanase主要分布在5、7、8、10、11、43等家族的糖苷水解酶中，其中大部分属于GH family10和11两大家族。GH family10木聚糖酶通常含有两个结构域，包括催化结构域和纤维素结合结构域(Cellulose Binding Domain:CBD)，相对分子质量一般大于30kDa，在结构上呈现“桶状”；而GH family11木聚糖酶多为单结构域，只含有催化结构域，相对分子质量一般小于30kDa，在空间结构上呈“右手半握状”。

迄今，已经有一些关于放线菌来源的木聚糖酶的报道，其中大部分为链霉菌，如Streptomyces sp.SWU10，S.thermotrificans，S.lividans，S.olivaceoviridis E-68等等。现今一些来源于链霉菌的木聚糖酶在pH 10.0时已经没有酶活，如来源于Streptomyces sp.S9的XynAS9，Streptomyces sp.strain AMT-3的xylanase，Streptomyces sp.S2 7的xylanase，Streptomyces sp.SWU10的XynSW2A/B；而来源于Streptomyces megaspores DSM 41476的一个拥有宽pH的木聚糖酶XYNAM6在pH10.0和11.0的残留酶活也只有38%和15%。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题在于提供一种宽pH作用范围稳定性的木聚糖酶，所述其氨基酸序列如以下1）或2）或3）所示：

1）其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示序列；

2）在1）限定的氨基酸序列的基础上氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸取代、缺失或添加，且具有木聚糖酶活性的氨基酸序列；

3）与1）或2）限定的氨基酸序列具有90%以上同源性，且具有木聚糖酶活性的氨基酸序列。

所述木聚糖酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的木聚糖酶的宽pH作用范围是指pH 4.5～10.0。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供了一株含木聚糖酶的基因工程菌。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供了一种木聚糖酶基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1)设计引物克隆木聚糖酶的基因xynA；

2).将基因克隆到重组表达载体上；

3).将重组表达载体转化到宿主细胞中。

所述重组表达载体为pUC系列，pET系列，pT7-7，或pGEX中的任意一种。

所述重组表达载体为pET-20b。

所述宿主细胞为为细菌，酵母或真菌。

所述细菌为E.coli BL21(DE3)、E.coli W3110、E.coli JM109、E.coli JM109(DE3)、E.coli DH5α中任意一种。

本发明所述的木聚糖酶XynA的最适pH5.5，最适温度60℃；有较宽的pH作用范围，尤其在碱性环境下：pH4.5～10.0范围内相对酶活均在50%以上，pH11.0时仍有41%的酶活，比木聚糖酶XYNAM6的在碱性范围内残余酶活高；pH稳定范围在3~11之间，残余酶活力均在80%以上。重组XynA基因工程菌表达胞外酶活为213.5U/mL，是野生菌Streptomyces sp.HJ酶活的11倍。因此，在竹原纤维生物酶脱胶、纸浆漂白、食品等行业具有潜在利用价值。

附图说明

图1纯化所得XynA的SDS-PAGE图。

1、标准蛋白分子量；

2、纯化后样品（XynA）。

图2 XynA的最适pH及pH稳定性曲线图。

图3 XynA的最适温度及温度稳定性曲线图。

图4重组XynA的发酵过程图。

■:大肠杆菌OD₆₀₀曲线；

○:重组XynA的酶活曲线。

图5重组XynA的SDS-PAGE图。

1、标准蛋白分子量；

2、重组XynA。

具体实施方式

实施例1：菌种的筛选和鉴定

采用的竹块为一年生毛竹，将竹材沿纵向截成50cm左右的长段，洗净后浸入沤竹液中，室温发酵一段时间。将1ml沤竹液在100ml含木聚糖5g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L、酵母浸出液0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3g/L、K₂SO₄ 0.1g/L、KH₂PO₄ 1.0g/L、CaCl₂·2H₂O 0.2g/L、微量元素溶液0.5ml的培养基中37℃富集培养24h。然后将富集培养液以梯度稀释的方法接种到含上述培养基成分的琼脂培养皿中。在37℃培养2-4天后，挑单菌落至选择培养基（竹粉20g/L、(NH₄)₂SO₄ 2.5g/L、K₂HPO₄ 0.5/L、MgSO₄ 1g/L、琼脂20g/L）。在上述两种培养基平板上都可以生长的菌落被选出进行发酵培养，选出可产木聚糖酶的优势菌株。对选出的优势菌株进行16S ribosomal DNA鉴定，鉴定结果显示有一株优势菌株与Streptomyces viridochromogenes(FJ790787)同源性达99%，因此可确定为Streptomyces species。将该产木聚糖酶的链霉菌命名为Streptomyces sp.HJ，并保藏。

实施例2：Streptomyces sp.HJ的发酵及XynA的纯化

在含蛋白胨1%、酵母浸出液0.5%、牛肉膏0.1%、NaCl 0.5%的种子培养基中接入一定量的Streptomyces sp.HJ，30℃，200 rpm摇床培养24h后接含麸皮3%、蛋白胨0.3%、酵母浸出液0.3%、KNO₃ 1%、KH₂PO₄ 0.05%、Na₂HPO₄·12H₂O 0.05%、无水MgSO₄ 0.05%、Tween800.1%的发酵培养基，同样条件培养3~4d后，离心收集上清即为粗酶液，酶活达到19U/mL。

通过硫酸铵分级沉淀的方法确定40%(w/v)硫酸铵恰好使XynA完全盐析。因此，将发酵液上清缓慢加入40%(w/v)硫酸铵盐析过夜，12,000×g,4℃,离心30min；用适量缓冲液A（20mM醋酸-醋酸钠，pH5.0）将沉淀溶解，4℃透析过夜、膜过滤(0.45μm)后即为上样样品。SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱(16cm×15cm)用缓冲液A平衡后上样，依次用缓冲液A、含0~1MNaCl的缓冲液A、含1 M氯化钠的缓冲液A洗脱结合蛋白，流速为1mL/min。将收集管中有酶活的样品用缓冲液A透析过夜后，上缓冲液A平衡过的MonoS 5/50GL，分别用缓冲液A、含0~1 M NaCl的缓冲液A、含1 M NaCl的缓冲液A洗脱，收集酶活力组分并进行蛋白电泳分析。最终获得的纯酶比活为861U/mg，纯化倍数为47.8，得率为20%(表1)。SDS-PAGE表明，木聚糖酶纯化后为一条带，分子量约为43kDa（图1）。

表1 Streptomyces sp.HJ所产XynA的纯化

实施例3：XynA的酶学性质研究

酶活测定方法：

参照DNS还原糖量测定法：取1mL适当稀释的酶液，加入到1mL用50mmol/L，pH5.5的磷酸缓冲液配制的1%(w/v)beechwood xylan底物溶液中，50℃反应10min后加入3mLDNS，煮沸10min迅速冷却，稀释后540nm下测吸光度（以灭活的酶液同样操作作为空白对照）。以木糖作标准曲线测定释放的还原糖量。木聚糖酶活力单位（U）的定义为：在上述条件下,每分钟水解木聚糖生成1μmol还原糖所需要的酶量。

1、最适pH及pH稳定性

在pH3~11范围内，50℃条件下测酶活，确定酶的最适pH。以酶活最高的为100%，其余酶活与之相比计算相对酶活。使用缓冲体系：50 mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液(3.0~5.5)、磷酸缓冲液(5.5~8.0)、甘氨酸-NaOH缓冲液(8.0~11.0)。为考察酶的pH稳定性，将酶液用上述缓冲液于4℃保存24h后测定残余酶活力，以酶活最高的为100%，残留酶活与之相比计算相对酶活。

结果如图2A表明，pH5.5酶活最高，pH4.5~10.0范围内相对酶活均在50%以上，pH11.0时仍有41%的酶活。由此可见，XynA在碱性环境下催化的pH范围较宽，比木聚糖酶XYNAM6的残余酶活高。图2B显示XynA同样有较宽的pH稳定范围，在pH值3.0~11.0之间相对酶活力均在80%以上。

2、最适温度及热稳定性

在pH5.5的磷酸盐缓冲体系中，测定不同反应温度下(35~65℃)的酶活力，以酶活最高的为100%，其余酶活与之相比计算相对酶活。如图3A所示，在60℃时酶活力最高。为研究木聚糖酶的热稳定，将木聚糖酶在50℃保温，定期取样迅速冰浴冷却，50℃下测定残留酶活，以初始未保温时的酶活为100%，残留酶活与之相比计算相对酶活。图3B显示，XynA在50℃ 放置半衰期为30h。

3、动力学参数测定

以不同浓度(1~20mg/mL)Beechwood xylan为底物，pH5.5，50℃条件下测定K_m为3.45mg/mL；V_max为845.23μmol/min/mg。

实施例4：XynA蛋白质质谱鉴定

从SDS-PAGE凝胶中割下目的条带；经胰蛋白酶酶解后抽提酶解肽段；多肽片段经MALDI-TOF质谱分析得到各个肽段的精确分子量，然后与Mascot标准蛋白数据库比对，发现与多个链霉菌来源的木聚糖酶匹配，这些木聚糖酶之间的同源性在82%~100%之间，且都属于glycoside hydrolases family10。

实施例5：xynA的克隆、序列分析

蛋白质质谱鉴定结果中选取与XynA成熟蛋白分子量较接近的木聚糖酶进行序列比对，发现其N-末端和C-末端相对保守。根据上述序列分析，设计简并引物(F：5'-CATGCCATGGCCGAGARCACSCTNGGCGCCG，含NcoI酶切位点；R：5'-CCGGAATTCTCAGGYGCGGGTCCAGCGYTGGC，含EcoRI酶切位点)。以提取的Streptomyces sp.HJ基因组为模板进行PCR扩增，经纯化后连接pMD18-T-simple载体，连接产物转化E.coli JM109，提质粒酶切验证，将酶切验证正确的质粒进行DNA序列测定。

xynA基因，全长1311bp，序列如SEQ ID NO.2所示，编码436个氨基酸的成熟蛋白，序列如SEQ ID NO,1所示；预测分子量为46.7kDa。将XynA氨基酸序列与NCBI数据库已有的木聚糖酶比较，Blast结果显示XynA与其他链霉菌所产的木聚糖酶同源性大多在62%~89%之间，且这些木聚糖酶都属于GH10家族。由以上结构特征可推断该木聚糖酶为GH family10。此外，XynA的48-436位氨基酸序列与Streptomyces tendae来源的xylanase（成熟蛋白389aa)同源性高达97%。

根据数据库中已有的同源性较高的木聚糖酶的序列以及文献报道，可推断XynA含三个区域：一个N端CD结构域和一个C端CBM结构域，一个富含Gly/Pro的linker连接这两个结构域。利用SWISS-MODOL在线软件以同源性88.1%的Streptomyces olivaceoviridis E-86(PDB accession number:1v6w)为模板模拟了XynA的结构，结果显示其CD为(β/α)₈的桶状结构，活性中心位点为129位和237位的Glu(E)，位于(β/α)₈的桶状结构的内表面。

实施例6：含有XynA的基因工程菌的构建及其表达。

Claims

1.一种宽pH作用范围木聚糖酶，其特征在于其氨基酸序列如以下1）或2）或3）所示：

1）其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示序列；

2.编码权利要求1所述木聚糖酶的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1或2所述木聚糖酶的基因工程菌。

4.权利要求3所述基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1)设计引物克隆木聚糖酶的基因xynA；

2).将基因克隆到重组表达载体上；

3).将重组表达载体转化到宿主细胞中。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述重组表达载体为pUC系列，pET系列，pT7-7，或pGEX中的任意一种。

6.根据权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于所述重组表达载体为pET-20b。

7.根据权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于所述宿主细胞为为细菌，酵母或真菌。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于所述细菌为E.coli BL21(DE3)、E.coliW3110、E.coli JM109、E.coli JM109(DE3)、E.coli DH5α中任意一种。