CN101134949B - β-葡聚糖酶、其编码基因、重组质粒和菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的β-葡聚糖酶、其编码基因，含有该编码基因的重组质粒和重组菌株，以及重组β-葡聚糖酶的制备方法，该重组酶在饲料工业中的应用。本发明从类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.F-40)中分离、克隆出一个新的β-葡聚糖酶基因，构建了能够在酵母细胞中高效表达重组β-葡聚糖酶的表达质粒。本发明β-葡聚糖酶对β-葡聚糖的β-1，3键和β-1，4键都有分解作用，具有高比活性，良好的热稳定性和pH稳定性等优点，可应用于饲料和啤酒工业。

Description

β-葡聚糖酶、其编码基因、重组质粒和菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种葡聚糖酶、其编码基因，尤其涉及一种β-葡聚糖酶、其编码基因，含有该基因的重组质粒和菌株，以及该重组β-葡聚糖酶的制备方法及其在饲料工业中的应用，属于基因工程领域。

背景技术

β-葡聚糖是禾本科高等植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，在谷物(大麦、燕麦、高粱、大米和小麦)的胚乳细胞壁中含量尤其丰富。

β-葡聚糖是由D型β构象葡萄糖连接的多糖聚合物，具有线型的空间结构。依据糖苷键连接的不同，β-葡聚糖可以分为1，4-β-葡聚糖，1，3-β-葡聚糖，1，6-β-葡聚糖，1，3-1，6-β-葡聚糖，1，3-1，4-β-葡聚糖等。其中1，3-1，4-β-葡聚糖是由β-1，3和β-1，4混合的糖苷键连接，通常是由β-1，4糖苷键连接葡萄糖形成纤维三糖或纤维四糖，再由β-1，3键相互连接成直链多聚体形式。在大麦和燕麦等淀粉胚乳的细胞壁中含量在70％左右。

当含有β-葡聚糖的谷物用作饲料原料时，β-葡聚糖是重要的抗营养因子。β-葡聚糖包括水溶性和非水溶性两类，单胃动物肠道中不能分泌相关的酶消化分解β-葡聚糖。并且，水溶性葡聚糖可以增大食糜的粘性，减少动物消化酶与营养物质的接触，降低消化养分的吸收；食糜粘性增加还造成畜禽粪便含水量和粘稠度增加，影响畜禽舍周围环境；β-葡聚糖可以结合、吸附金属离子、有机质等营养物质，造成其代谢受阻；还能降低其他消化酶的活力，影响脂肪和蛋白质的消化吸收。

β-葡聚糖酶是能分解β-糖苷键链成的葡萄糖聚合物的一类酶的总称。按作用方式不同，β-葡聚糖酶可分为内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶两类。其中内切β-1，3-1，4-葡聚糖酶(酶学分类号E.C.3.2.1.73)可以水解β-1，3-1，4-葡聚糖，专一作用于与β-1，3键相连的β-1，4糖苷键，使其降解为低分子量片段，失去亲水性和粘性。从而改变单胃动物肠道内容物的特性，提高内源性消化酶活性，改变肠道微生物环境，利于动物对营养物质的消化和吸收，提高生长性能和饲料的转化率，(MathlouthiN et al.Amin Res，2002，51：395-406.)在食品和饲料工业等方面有广阔的应用前景。

植物和微生物都能产生β-1，3-1，4-葡聚糖酶，在植物种子发芽过程中可以由糊粉层和盾片分泌β-1，3-1，4-葡聚糖酶以分解胚乳细胞壁中的β-葡聚糖。生产中应用较多的是微生物所产的β-1，3-1，4-葡聚糖酶，包括细菌(主要为芽孢杆菌)、真菌和瘤胃微生物。目前已经有多种不同来源的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因被克隆和表达。包括芽孢杆菌Bacillus sublitis，(Hinchliff E et al.Curr Genet，1995，8：471-475.)B.amyloliquefaciens，B.circulans，(Kim JY et al.Biotechnol Lett，2003，25：1445-1449.)B.licheniformis，(Lloberas J et al.Eur J Biochem，1991，197：337-343.)B.brevis，类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa，(Gosalbes MJ et al.J Bacteriol，1991，173(23)：7705-7710.)P.macerans，(Borris R et al.Mol Gen Genet，1990，222：278-283.)它们所产的β-1，3-1，4-葡聚糖酶都具有相似的核苷酸和氨基酸序列，并且都有一个保守的氨基酸序列EIDIEF，其中的两个谷氨酸残基参与酶的水解.(Hahn M et al.J Biol Chem，1995，270：3081-3088.)在一些非芽孢杆菌的细菌中也克隆到β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，例如热纤梭菌Clostridium thermocellum，(Schimming S et al.Biochem Biophys ResCommun，1991，177：447-452.)牛链球菌Streptococcus bovis，(Ekinci MS et al.ApplEnviron Microbiol.1997，63：3752-3756.)产琥珀丝状杆菌酸Fibrobactersuccinogenes，(Chen JL et al.J Biol Chem，2001，276：17895-17901.)在厌氧真菌Orpinomyces中分离的β-1，3-1，4-葡聚糖酶序列与芽孢杆菌也很相似。(Chen H et al.Journal of Bacteriology 1997，179：6028-6034.)

不同来源的基因在不同的载体和寄主系统中得到表达，包括大肠杆菌(Escherichia coli)，芽孢杆菌，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及转基因大麦和烟草等，但不同表达系统的葡聚糖酶活性有较大的差异。

综上所述，具有优良特性新型葡聚糖酶的研究具有重大意义。克隆和分离具有高比活、良好稳定性和底物特异性的葡聚糖酶可以更好的应用于饲料和啤酒工业，而较高的表达量可以降低生产成本，都是葡聚糖酶应用于饲料工业必需的。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的β-葡聚糖酶，该β-葡聚糖酶具有比活高，稳定性良好和底物特异性广等优点，能够有效的应用于饲料工业生产。

本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

一种β-葡聚糖酶，其是以下(a)或(b)的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或

(b)将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有β-葡聚糖酶活性的蛋白衍生物。

优选的，本发明β-葡聚糖酶为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种编码上述β-葡聚糖酶的基因(Bgl)。

本发明所要解决的第二个技术问题是通过以下技术途径来实现的：

一种编码β-葡聚糖酶的基因(Bgl)，该基因是以下(a)、(b)、(c)或(d)的核苷酸序列：

(a)是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或

(b)在严谨条件下能与(a)所示的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列，且该核苷酸序列编码具有β-葡聚糖酶活性的蛋白；或

(c)编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或

(d)编码具有β-葡聚糖酶功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，该蛋白衍生物通过将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入而获得。

优选的，本发明编码β-葡聚糖酶的基因是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

所述的“多个”通常意味着2～60个，优选为2～15个，这些取决于β-葡聚糖酶的三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸序列的改变，其中分别缺少一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基；所述的“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件.通常，在严谨条件下，探针将杂交到核酸的复合混合物中的其目标子序列上，但并不杂交到复合混合物中的其它序列上.严谨条件是序列依赖性的并且在不同环境中将有所不同.严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(T_m)约5-10℃。T_m为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。

一种例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

本发明所要解决的第三个技术问题是构建含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组表达质粒及获取含有该重组表达载体的重组菌株。本发明所要解决的第三个技术问题是通过以下技术途径来实现的：

本发明的重组表达质粒可通过本领域的常规方法构建而成，即将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列插入到质粒pPIC9上的SnaBI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到酵母重组表达质粒pPIC-Bgl。

选择合适的宿主细胞用于表达β-葡聚糖酶(Bgl)是所属领域的普通技术人员的常规技术。该宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌细胞)，也可以是真核细胞(例如可以为酵母细胞)；优选为酵母细胞作为宿主细胞，在选择用于表达的酵母宿主时，可选择那些展示具有良好的分泌能力、低蛋白水解活性、良好的可溶蛋白产量和总体健康的酵母。例如，可为毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)、啤酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)或乳酸酵母细胞(Hansenula polymorpha)等。

本发明所构建的重组酵母表达质粒可通过常规的方法(这些方法包括：将受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔法、抛射物轰击和以病毒载体注射等)转化宿主细胞，作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将重组酵母表达质粒pPIC-Bgl通过电穿孔法转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株pPIC-Bgl/GS115。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种制备所述的重组β-葡聚糖酶的方法。

本发明所要解决的又一个技术问题是通过以下技术途径来实现的：

优选的，一种制备本发明重组β-葡聚糖酶的方法，包括以下步骤：

构建含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的重组表达质粒；培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组β-葡聚糖酶的表达，回收并纯化所表达的β-葡聚糖酶。

上述制备β-葡聚糖酶的方法中，优选的，所述的重组表达质粒是pPIC-Bgl；所述的宿主细胞是毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，所述的重组菌株为pPIC-Bgl/GS115。

本发明的一个最优选的整体技术方案详细描述如下：

1.基因克隆：提取类芽孢杆菌(Paenibacillus sp F-40)基因组DNA，通过基因组文库构建和活性筛选的方法克隆到编码β-葡聚糖酶的全长基因(Bgl)。

2.重组酶的制备：将β-葡聚糖酶成熟蛋白编码基因连接入真核生物毕赤酵母表达载体pPIC9，获得重组质粒pPIC-Bgl。利用常规方法转入毕赤酵母细胞(Pichiapastoris)GS115。诱导表达外源基因，制备重组酶。

3.重组β-葡聚糖酶的纯化：通过硫酸铵沉淀，离子交换层析和凝胶层析纯化出目的蛋白。

4.酶学性质鉴定：通过酶活测定检测酶的基本性质。

附图说明

图1.含有β-葡聚糖酶基因克隆的活性筛选。

图2.在毕赤酵母中表达的重组β-葡聚糖酶的SDS-PAGE分析。

M：低分子量蛋白质Marker；1：未诱导对照；2-7：甲醇诱导24，48，72，96，120，144小时后的发酵上清液。

图3.纯化的β-葡聚糖酶及其脱糖基化处理。

M：低分子量蛋白质Marker；1：Bgl/EndoH处理；2：纯化的Bgl。

图4.重组β-葡聚糖酶的酶学性质分析。

A：β-葡聚糖酶的最适pH；B：β-葡聚糖酶pH稳定性；C：β-葡聚糖酶作用的最适温度；D：β-葡聚糖酶的热稳定性；E：β-葡聚糖酶抗蛋白酶活性分析。

图5.重组β-葡聚糖酶的酶解产物分析。

A：大麦葡聚糖；B：地衣多糖；C：昆布多糖。

以下通过实施例来进一步描述本发明的制备方法及有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

具体实施方式

试验材料和试剂

1菌株及载体：类芽孢杆菌(Paenibacillus sp F-40)(微生物保藏号是：CGMCCNo.1775；保藏时间是：2006年08月10号；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。)，毕赤酵母及表达载体pPIC9(购自Invitrogen公司，Carlsbad，CA，USA)。

2酶类及其他生化试剂：内切酶购自Takara(大连，中国)公司，连接酶购自Invitrgen(Carlsbad，CA，USA)公司.作用底物地衣多糖和大麦葡聚糖均购自Sigma(Sigma-Aldrich，MO，USA)公司.其它都为国产试剂.

3.培养基：

LB培养基(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。RDB(RegenerationDextrose Base)，MM(Minimal Mathanol)，MD(Minimal Dextrose)，BMGY(BufferedGlycerol-complex Medium)，BMMY(Buffered Methanol-complex Medium)，BSM(Basal Salt Medium)以及PTM1微量盐溶液配方见http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/pich_man.pdf。

4.本发明各实施例中β-葡聚糖酶的活性分析按照以下方法进行：

酶学测定采用国际通用的DNS(3，5-二硝基水杨酸)法，将0.45ml 1％的可溶性地衣多糖(Sigma公司)溶液加入试管，放入55℃水浴中预热3min。再将0.05ml已经稀释好的酶液加入到试管中，继续在37℃水浴中反应10min，向试管中加入2mlDNS试剂终止反应，将试管在沸水中加热5min，立即用流水冷却到室温，显色，室温下放置10min，540nm处测吸光值。对照为先将0.05ml酶液加入到0.2ml柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，在100℃沸水中煮20分钟灭活，再加入同体积的底物保温。

β-葡聚糖酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解葡聚糖生成1μmol还原糖所需的酶量为1个活性单位(U)。

说明：本发明中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括：Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版.2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等人编，1994)。

实施例1类芽孢杆菌β-葡聚糖酶编码基因Bgl的克隆

提取类芽孢杆菌(Paenibacillus sp F-40)的基因组DNA：取30℃培养2天的类芽孢杆菌菌液，10000rpm离心10min。取50mg菌体加500μL无菌水清洗，离心取沉淀。沉淀重悬于500μL溶菌酶混合液，于37℃温育30min，再补加酶液100μL于40-50℃继续保温30min，至菌液透明后，加10％SDS至终浓度2％，搅拌约5min至菌液粘度显著下降，15000rpm离心10min去碎片。上清用等体积酚、酚∶氯仿、氯仿依次抽提。取上层溶液加0.6-1倍体积的异丙醇常温沉淀10min。16000rpm离心15min。沉淀用70％乙醇清洗，稍离心，将沉淀烘干后用30μL无菌水溶解，备用。

取提取的基因组DNA 5μg， 利用BamHI酶切，与同样酶切的pUC19载体(购自Takara公司)连接，转化大肠杆菌JM109，构建基因组文库。挑取白色的阳性克隆转移到活性筛选平板(LB培养基中含有3％的琼脂和1％的地衣多糖)上过夜培养，洗去平板上的菌体，用1％刚果红染色，再用0.5M NaCl溶液洗涤脱色，含有β-葡聚糖酶编码基因的克隆能够产生降解圈，如图1所示。2287号克隆产生降解圈，提取该克隆的质粒，进行测序，得到β-葡聚糖酶的全长编码基因，该基因包括717bp(SEQ ID NO：1)，编码蛋白含有238个氨基酸(SEQ ID NO：2)，与Genbank中序列比较发现，该基因最高相似性为79％，氨基酸最高相似性为82％，证明该基因为新基因。

实施例2制备重组β-葡聚糖酶

经过分子生物学软件分析，得到编码β-葡聚糖酶的成熟蛋白的序列，设计引物1，5′aaagaattcggttatgtgttctgggaacctc-3′，(EcoR I位点)和引物2，5′-accgcggccgcttaattactcgtatatttaaccc-3′(Not I位点)，PCR扩增得到成熟蛋白编码序列。用EcoR I和Not I酶切，连接到载体pPIC9中，获得含有类芽孢杆菌β-葡聚糖酶编码基因Bgl的重组质粒pPIC-Bgl并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株pPIC-Bgl/GS115。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于200mL YPD培养液中，30℃250rpm振荡过夜培养，然后接种于发酵基本培养基于3L发酵罐中发酵。经过基础培养、碳源饲喂和诱导培养三个阶段共156h，重组β-葡聚糖酶得到高效表达，表达酶的活性达到4554U/ml。SDS-PAGE结果(图2)表明，Bgl在毕赤酵母中得到了表达和积累。

实施例3本发明重组β-葡聚糖酶的纯化

将实施例2所制备的发酵培养液10000rpm离心10分钟除去菌体，取上清液作为粗酶液，将粗酶液置于冰浴中，边搅拌边缓慢加入硫酸铵至80％，13000rpm离心20min，取沉淀，用缓冲液重新溶解，得到浓缩酶液，进一步用HPLC(

Pharmacia公司)纯化。

经硫酸铵沉淀后上HiTrap_Q_Sepharose_XL(Amersham Pharmacia Biotech预装柱)阴离子柱。加样2mL，先用pH8.0，0.02mol/L的Tris-HCl缓冲溶液洗脱平衡柱子，然后用相同缓冲液配制的0～0.6mol/LNaCl梯度洗脱10个柱床(约50mL)，流速为5mL/min，分部收集，每管1mL。然后对收集管中的溶液测酶活及蛋白电泳分析。图3显示得到了电泳纯β-葡聚糖酶(Bgl)。

对纯化过程中的各步分别进行了酶活性测定及蛋白浓度测定，结果见表1。纯化完成后，比活性从粗酶液的3076U/mg提高到纯酶的6001U/mg，纯化倍数为1.95倍，得率29.6％。SDS-PAGE结果(图3)表明，纯化后的β-葡聚糖酶蛋白仅有一条单一的条带，分子量约为35kD。经脱糖基化酶Endo H处理后，分子量为27kD。

表1重组葡聚糖酶Bgl纯化结果

实施例4本发明重组β-葡聚糖酶Bgl的酶学性质分析实验

将实施例4所纯化的β-葡聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH2.2～8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠系列缓冲液及pH8.0～10.0Tris-HCl系列缓冲液。纯化的β-葡聚糖酶在不同pH的缓冲体系，37℃下测定的pH适性结果(图4A)表明：Bgl的最适pH为6.5。将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理30min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图4B)，在pH4.0～9.0之间保持最适pH下酶活的80％以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性。

最适温度的测定在柠檬酸-磷酸氢二钠(pH6.5)缓冲体系及不同温度下进行酶促反应.耐温性测定为在不同温度下处理30min，再进行酶活测定.酶反应最适温度测定结果(图4C)表明，Bgl最适温度为60℃.在40℃～70℃范围内，酶活性维持在60％以上.酶的热稳定性试验表明(图4D)，在50和60℃下保温30min，剩余酶活性为80％左右.70℃下保温5min，剩余酶活性为70％左右.说明此酶具有较好的耐热性.

在β-葡聚糖酶溶液中加入0.05mL胰蛋白酶(0.1mg/mL，用pH7.0、Tris-HCl缓冲液配制)，和胃蛋白酶(0.1mg/mL，用pH2.0、甘氨酸-HCl缓冲液配制)于37℃处理60min，稀释后再测定酶活性。用蛋白酶分别处理60min后，剩余60％以上的酶活性(图4E)。说明β-葡聚糖酶具有较好的抗蛋白酶水解的能力。

在酶促反应体系中加入不同的化学试剂(终浓度为1mmol/L)，研究不同化学试剂对酶活性的影响。表2的结果表明，Mn²⁺，Ag⁺对酶促反应有促进作用。其余化学试剂对酶促反应无显著影响(表2)。

表2各种化学试剂对本发明β-葡聚糖酶活力的影响

实施例5本发明β-葡聚糖酶的底物特异性

将不同的底物用柠檬酸-磷酸氢二钠(pH6.5)缓冲液溶解浓度为0.5％。在酶反应最适温度和最适pH值下，测定本发明β-葡聚糖酶对不同底物的作用。结果表明，本发明β-葡聚糖酶可作用于由β-1，3-1，4葡萄糖苷键连接的大麦葡聚糖、地衣多糖，和β-1，3葡萄糖苷键连接的昆布多糖，而对甲基纤维素，木聚糖没有活性。说明该酶具有酶切β-1，3-1，4葡萄糖苷键和β-1，3葡萄糖苷键的多功能活性。

表3本发明β-葡聚糖酶的底物特异性

利用高效离子交换层析技术对酶解产物进行分析，结果证明，以大麦葡聚糖、地衣多糖，和β-1，3葡萄糖苷键连接的昆布多糖作底物时，酶解反应都有寡糖产生(图5)，也说明本发明酶具有多功能活性。

序列表.txt

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>β-葡聚糖酶、其编码基因、重组质粒和菌株及其应用

<130>009

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>717

<212>DNA

<213>类芽孢杆菌(Paenibacillus sp)

<400>1

atgatgaaga ggaagtcttg gtatactttg gcggtaactg gtgtcatctc tttgattttt   60

tcagtaagcg ctttcgcggg ttatgtgttc tgggaacctc taacctattt taacgcaagt  120

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aacaagtttg attgcggaga gtatcgttcc acgaatacgt atgggtacgg cttatatgaa  300

gtcagtatga aacctgccaa gaacacaggt gtagtttcct catttttcac atacacaggg  360

cccgcgcatg gcacccaatg ggatgagatt gatatcgaat ttttaggaaa agacacaacc  420

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ggttttgatg catcacaggg cttccatacg tatgcatttg attggcagcc gggacatatc  540

aaatggtatg ttgatggtgt attgaagcat acggcaacca gcaatattcc taaaacaccc  600

ggaaaaatca tgatgaacct ctggaatgga acaggagtag atagctggct cggtccttat  660

aacggcgcca atccgctcta tgctgagtac gattgggtta aatatacgag taattaa     717

<210>2

<211>238

<212>PRT

<213>类芽孢杆菌(Paenibacillus sp)

<400>2

Met Met Lys Arg Lys Ser Trp Tyr Thr Leu Ala Val Thr Gly Val Ile

1               5                   10                  15

Ser Leu Ile Phe Ser Val Ser Ala Phe Ala Gly Tyr Val Phe Trp Glu

            20                  25                  30

Pro Leu Thr Tyr Phe Asn Ala Ser Thr Trp Gln Lys Ala Asp Gly Tyr

        35                  40                  45

Ser Asn Gly Asn Met Phe Asn Cys Thr Trp Arg Ala Asn Asn Val Asn

    50                  55                  60

Phe Thr Ser Asp Gly Lys Leu Lys Leu Gly Leu Thr Ser Ser Ala Gln

65                  70                  75                  80

Asn Lys Phe Asp Cys Gly Glu Tyr Arg Ser Thr Asn Thr Tyr Gly Tyr

                85                  90                  95

Gly Leu Tyr Glu Val Ser Met Lys Pro Ala Lys Asn Thr Gly Val Val

    100                 105                 110

Ser Ser Phe Phe Thr Tyr Thr Gly Pro Ala His Gly Thr Gln Trp Asp

                    115                 120                 125

Glu Ile Asp Ile Glu Phe Leu Gly Lys Asp Thr Thr Lys Val Gln Phe

                130                 135                 140

Asn Tyr Tyr Thr Asn Gly Ile Gly Asn His Glu Lys Ile Ile Asn Leu

145                 150                 155                 160

Gly Phe Asp Ala Ser Gln Gly Phe His Thr Tyr Ala Phe Asp Trp Gln

                165                 170                 175

Pro Gly His Ile Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Leu Lys His Thr Ala

            180                 185                 190

Thr Ser Asn Ile Pro Lys Thr Pro Gly Lys Ile Met Met Asn Leu Trp

        195                 200                 205

Asn Gly Thr Gly Val Asp Ser Trp Leu Gly Pro Tyr Asn Gly Ala Asn

    210                 215                 220

Pro Leu Tyr Ala Glu Tyr Asp Trp Val Lys Tyr Thr Ser Asn

225                 230                 235

Claims (8)

1.一种β-葡聚糖酶，其特征在于：其足SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1所述β-葡聚糖酶的基因，其特征在于：其是SEQ ID NO：I所示的核苷酸序列。

3.含有权利要求2所述基因的重组表达质粒。

4.按照权利要求3的重组表达质粒，其特征是所述的重组表达质粒是pPIC-Bg1；其中，Bg1的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

5.含有权利要求3或4所述重组表达质粒的重组菌株。

6.按照权利要求5的重组菌株，其特征是所述的重组菌株是pPIC-Bg1/GS115；其中，Bg1的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

7.一种制备权利要求1β-葡聚糖酶的方法，包括以下步骤：

构建含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的重组表达质粒；培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组β-葡聚糖酶的表达，回收并纯化所表达的β-葡聚糖酶。

8.按照权利要求7的方法，其特征是所述的重组表达质粒是pPIC-Bg1；所述的宿主细胞是毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，所述的重组菌株为pPIC-Bg1/GS115；其中，Bg1的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

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