CN110205313A

CN110205313A - 泡盛曲霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶的表达纯化方法

Info

Publication number: CN110205313A
Application number: CN201910479903.5A
Authority: CN
Inventors: 闫巧娟; 江正强; 刘学强; 杨绍青; 马帅; 余静
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-06-04
Filing date: 2019-06-04
Publication date: 2019-09-06
Anticipated expiration: 2039-06-04
Also published as: CN110205313B

Abstract

本发明公开了泡盛曲霉β‑1,3‑1,4‑葡聚糖酶的表达纯化方法。本发明提供了一种生产β‑1,3‑1,4‑葡聚糖酶的方法，包括将泡盛曲霉β‑1,3‑1,4‑葡聚糖酶编码基因导入受体酵母；将重组酵母于BSM培养基培养，待甘油消耗完全进行甘油补料发酵阶段、甲醇补料诱导表达阶段和混合补料诱导表达阶段。本发明工程菌经高密度发酵，发酵液酶活可达159500U/mL(蛋白含量31.7mg/mL)。所产β‑1,3‑1,4‑葡聚糖酶最适pH5.0，在pH 2.0‑9.0保持稳定；最适温度55℃，在60℃以下保持高酶活力；底物特异性专一。本发明在食品、饲料等行业具有应用价值。

Description

泡盛曲霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶的表达纯化方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种泡盛曲霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶的表达纯化方法。

背景技术

β-葡聚糖酶是一类能够降解谷物中β-葡聚糖的酶类，包括β-1,3-1,4-葡聚糖酶(地衣多糖酶，EC 3.2.1.73)、β-1,4-葡聚糖酶(纤维素酶，EC 3.2.1.4)、β-1,3-葡聚糖酶(昆布多糖酶，EC 3.2.1.39)和β-1,3(4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)(专利号：CN201410246941，申请日：20140530)。其中，β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有严格的底物特异性，其水解β-葡聚糖的3-O-取代葡萄糖残基上的β-1,4-糖苷键，生成主要包含3-O-β-纤维二糖基-D-葡萄糖和3-O-β-纤维三糖基-D-葡萄糖的水解产物(专利号：CN201610416008，申请日：20160614；Yang et al.,Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56:5345-5351)。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶广泛应用于啤酒生产和饲料工业中。在啤酒生产中，β-1,3-1,4-葡聚糖酶能够专一分解大麦葡聚糖，使大麦胚乳细胞壁疏松，促进细胞内溶物外溢，进而提高大麦的利用率，同时使糖化醪粘度降低，大大减少麦芽汁的过滤时间，还可增加啤酒产量，改善啤酒混浊度，提升啤酒的品质(专利号：CN201210197691，申请日：20120615；Furtado et al.,Process Biochemistry,2011,46:1202-1206)。在饲料工业中，β-1,3-1,4-葡聚糖酶能特异性将饲料中β-1,3-1,4-葡聚糖水解为葡寡糖，使植物细胞壁的构造遭到破坏，进而释放出营养物质，并且降解后的葡寡糖没有亲水性和黏性，不仅防止β-1,3-1,4-葡聚糖在畜禽肠道中发生膨胀黏连，还提高了食糜消化率和饲料利用率(专利号：CN201110310945；申请日：20111014；Fernandes et al.,Animal Feed Science andTechnology,2016,211:153-163)。除此之外，β-1,3-1,4-葡聚糖水解物(葡寡糖)可促进人和动物体内益生菌的增殖，还可以改善机体的脂代谢和蛋白质代谢(Bode,NutritionReviews,2009,67:S183-S191)。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶广泛存在于植物和微生物中。植物β-1,3-1,4-葡聚糖酶报道较少，根据氨基酸序列相似性，多属于糖苷水解酶17家族(Zhang et al.,Food Chemistry,2017,234:68-75)。微生物β-1,3-1,4-葡聚糖酶大多数归属于糖苷水解酶16家族，仅有少数属于糖苷水解酶3、5、7和12家族(Wang et al.,Process Biochemistry,2014,1448-1456)。目前，已有多种微生物β-1,3-1,4-葡聚糖酶被发掘研究，其中细菌来源报道较多，且大多属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)(Goldenkova-Pavlova et al.,Applied Microbiology and Biotechnology,2018,102:3951-3965；专利号：CN200610112092，申请日：20060830)，而真菌来源的β-1,3-1,4-葡聚糖酶报道相对较少，近年来报道的有嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)(专利号：CN201010115773，申请日：20100301)、米黑根毛霉(Rhizpmucor miehei)(Tang et al.,Journal ofAgricultural and Food Chemistry,2012,60:2354-2361)和樟绒枝霉(Malbrancheacinnamomea)(Yang et al.,Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,2014,41:1487-1495)等，其中曲霉属(Aspergillus sp.)作为工业化糖苷水解酶的重要来源，目前有黑曲霉(A.niger)(Elgharbi et al.,Carbohydrate Polymers,2013,98:967-975)，烟曲霉(A.fumigatus)(Bernardi et al.,Protein Expression and Purification,2018,150:1-11)和棘孢曲霉(A.japonicus)(Grishutin et al.,2006,341:218-229)报道了β-1,3-1,4-葡聚糖酶，但至今尚未有泡盛曲霉(A.awamori)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的研究报道。

利用基因工程的手段可提高酶的产量，以满足大规模工业化应用的要求。迄今，已有一些β-1,3-1,4-葡聚糖酶在大肠杆菌(Escherchia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和毕赤酵母(Pichia pastoris)中成功表达(专利号：CN200610112092，申请日：20060830；Goldenkova-Pavlova et al.,Applied Microbiology and Biotechnology,2018,102:3951-3965)，但绝大多数报道β-1,3-1,4-葡聚糖酶产量仍旧较低，如芽孢杆菌属A3菌株(Bacillus sp.A3)β-1,3-1,4-葡聚糖酶在枯草芽孢杆菌中表达，高密度发酵后酶活力可达80.56U/mL，蛋白含量0.05g/L(Bai et al.,Applied Microbiology andBiotechnology,2010,87:251-259)。Bispora sp.β-1,3-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中成功表达，高密度发酵后酶活力可达1000U/mL，蛋白含量0.37g/L(专利号：CN2001810239309，申请日：20081209)。截止目前，仅见Talaromyces emersonii(Wang et al.,ProcessBiochemistry,2014,49:1448-1456)和嗜热拟青霉(专利号：CN201010115773，申请日：20100301)β-1,3-1,4-葡聚糖酶表达于毕赤酵母后可高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶，高密度发酵后酶活力分别可达52015U/mL(7.0g/L)和55300U/mL(9.1g/L)，这是目前报道β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最高表达水平。尽管如此，为了降低β-1,3-1,4-葡聚糖酶的生产和应用成本，β-1,3-1,4-葡聚糖酶产量仍需进一步提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种泡盛曲霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶的表达纯化方法。

第一方面，本发明要求保护一种生产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的方法。

本发明所提供的生产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的方法，可包括如下步骤：

(A)将来源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的编码基因导入受体酵母，得到重组酵母；

(B)按照如下步骤对所述重组酵母进行发酵培养，从发酵产物中获得β-1,3-1,4-葡聚糖酶：

B1)基础发酵培养：将所述重组酵母接种于BSM培养基中培养，待甘油消耗完全进行甘油补料发酵阶段；

B2)甘油补料发酵阶段：在步骤B1)的基础上，将甘油以30mL/h/L起始发酵液的速度流加到发酵体系中，流加4h，待甘油消耗完全后饥饿1h，然后进行甲醇补料诱导表达阶段；

B3)甲醇补料诱导表达阶段：在步骤B2)的基础上，将甲醇以6mL/h/L起始发酵液的速度加流到发酵体系中，流加甲醇至菌体湿重达320g/L时停止流加；

B4)混合补料诱导表达阶段：在步骤B3)的基础上，将甲醇以4-5mL/h/L起始发酵液的速度，甘油以90mL/h/L起始发酵液的速度同时流加到发酵体系中，流加至发酵结束。

在步骤(A)中，所述来源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶可为如下任一所示蛋白质：

a1)SEQ ID No.1自N末端第17至239位氨基酸残基组成的蛋白质(不含信号肽)；

a2)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质(含信号肽)。

a3)将a1)或a2)所述的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性的蛋白质。

a4)与a1)-a3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性的蛋白质；

a5)在a1)-a4)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

SEQ ID No.1共由239个氨基酸残基组成，其中第1-16位为信号肽序列。

在步骤(A)中，所述来源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的编码基因可通过重组载体的形式导入所述受体酵母中。

在本发明中，所述重组载体为重组表达载体1或重组表达载体2。

所述重组表达载体1(pPCAU-AaBglu12A)具体为将表达盒1按照顺式-反式-顺式依次串联然后克隆到pPIC9K载体的多克隆位点(如EcoRⅠ和NotⅠ)后得到的重组质粒；所述表达盒1由2×AOX1启动子、α-factor信号肽的编码基因、所述来源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的编码基因和AOX1终止子依次连接而成。

进一步地，所述α-factor信号肽的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述2×AOX1启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述AOX1终止子的核苷酸序列如SEQID No.5所示。

所述重组表达载体2(pPIC9K-AaBglu12A)具体为将所述来源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的编码基因插入到pPIC9K载体的多克隆位点(如EcoRⅠ和NotⅠ)后得到的重组质粒。

在本发明中，所述酵母为毕赤酵母。

进一步地，所述毕赤酵母具体为毕赤酵母GS115。

在步骤(A)中，所述来源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的编码基因可为如下任一所述的DNA分子：

b1)SEQ ID No.2的自5′末端第49-720位所示的DNA分子(不含信号肽编码序列)；

b2)SEQ ID No.2所示的DNA分子(含信号肽编码序列)；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的DNA分子杂交且编码所述来源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的DNA分子；

b4)与b1)-b3)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述来源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

SEQ ID No.2共由720个核苷酸组成，自5′端第1-48位碱基为信号肽编码序列，自5′端第49-720位碱基为成熟蛋白编码序列。

在步骤B1)中，接种于所述BSM培养基中的所述重组酵母为所述重组酵母的种子液(OD600为2.0-6.0)。所述重组酵母的种子液为将步骤(A)所得的所述重组酵母接种于BMGY培养基或YPD培养基，在30℃、200rpm振荡培养24-30h所得。

其中，所述BMGY培养基的组成如下：质量百分浓度为1％的酵母提取物，质量百分浓度为2％的蛋白胨，质量百分浓度为1.34％的无氨基酵母氮源YNB，质量百分浓度为4×10^-5％的生物素，体积百分比1％的甘油，余量为100mmol/L pH 6.0磷酸盐缓冲液。所述YPD培养基的组成如下：质量百分浓度为1％的酵母提取物，质量百分浓度为2％的蛋白胨，质量百分浓度为2％的葡萄糖，余量为水。

进一步地，在步骤B1)中，将所述种子液接种于所述BSM培养基为接种于装有所述BSM培养基的发酵罐中，所述BSM培养基在所述发酵罐中的装液量为所述发酵罐容积的1.5/5(如5-L发酵罐中装有1.5L所述BSM培养基)。

在步骤B1)中，所述BSM培养基的组成如下：每1.5L所述BSM培养基中含有浓度为85g/100mL的磷酸40mL，CaSO₄ 1.4g，K₂SO₄ 27.3g，MgSO₄·7H₂O 22.4g，KOH 6.19g，甘油60g，余量为水。

在步骤B1)中，所述培养的温度为30℃、pH为5.0、控制溶氧大于20％。

在步骤B2)中，所述甘油是溶于水中而形成的500g/L的甘油水溶液。所述甘油补料发酵阶段的培养温度为30℃、pH为5.0、控制溶氧大于20％。

在步骤B3)中，所述甲醇补料诱导表达阶段的培养温度为30℃、pH为6.0、控制溶氧大于20％。该步骤中如不能使溶氧保持在20％以上，可适当减小甲醇流加速度。

在步骤B4)中，所述甘油是溶于水中而形成的500g/L的甘油水溶液。所述混合补料诱导表达阶段的培养温度为30℃、pH为6.0、控制溶氧大于20％。该步骤中如不能使溶氧保持在20％以上，可适当减小甘油和甲醇流加速度。

在本发明中，所述控制溶氧大于20％具体可通过如下实现：调节搅拌转速600-800rpm，调节通气量2.0vvm。

在本发明的具体实施方式中，步骤(B)中的所述发酵培养的时间具体为168小时。

在所述方法的步骤(B)中，对所述重组酵母进行发酵培养后还可包括如下步骤：将发酵液的上清液进行透析除盐，然后进行阴离子交换层析，用含0-500mM NaCl的20mMTris-HCl pH 8.0缓冲液进行线性洗脱，收集得到纯化后β-1,3-1,4-葡聚糖酶。

进一步地，所述阴离子交换层析可为Q-琼脂糖凝胶FF(Q-Sepharose FF)离子交换层析。所述用含0-500mM NaCl的20mM Tris-HCl pH 8.0缓冲液进行线性洗脱的洗脱程序为：50min内NaCl的浓度从0线性升至500mM。

所述发酵液的上清液是所述发酵液在10000×g条件下离心10min所得的上清液。所述发酵液的上清液经透析后平衡至20mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中。进行所述阴离子交换层析(Q-琼脂糖凝胶FF，Q-Sepharose FF离子交换层析)时，是使用20mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液进行柱平衡的。进行所述阴离子交换层析(Q-琼脂糖凝胶FF，Q-SepharoseFF离子交换层析)时，是先用5个柱体积的20mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗净未结合的蛋白后，再用含0-500mM NaCl的pH 8.0Tris-HCl缓冲液进行线性洗脱(50min内NaCl浓度从0线性升至500mM)。使用20mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液进行柱平衡时的流速为1mL/min；上样时流速为0.5mL/min；用5个柱体积的20mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗净未结合的蛋白时的流速为1mL/min；用含0-500mM NaCl的pH 8.0Tris-HCl缓冲液进行线性洗脱时的流速为1mL/min。在经0-500mM NaCl线性洗脱后还包括如下步骤：用pH 5.0的柠檬酸缓冲液透析备用。

第二方面，本发明要求保护利用前文第一方面中所述方法制备得到的β-1,3-1,4-葡聚糖酶。

第三方面，本发明要求保护如下任一所示应用：

(C1)前文第二方面所述的β-1,3-1,4-葡聚糖酶在麦芽糖化中的应用；

(C2)前文第二方面所述的β-1,3-1,4-葡聚糖酶在燕麦麸皮水解中的应用。

进一步地，步骤(C1)中，所述β-1,3-1,4-葡聚糖酶在麦芽糖化过程中的添加量为60-100U/g麦芽。

更进一步地，步骤(C1)中，所述β-1,3-1,4-葡聚糖酶在麦芽糖化过程中的添加量为70U/g麦芽。

进一步地，步骤(C2)中，所述β-1,3-1,4-葡聚糖酶水解燕麦麸皮时的添加量为100U/g燕麦麸皮，水解温度为50℃，水解时间为4h。

实验证明，本发明利用基因工程技术从泡盛曲霉CAU33中获得一个糖苷水解酶(GH)12家族的基因，将其导入毕赤酵母中构建的工程菌在5-L发酵罐中高密度发酵，发酵液的酶活力可达159500U/mL(蛋白含量为31.7mg/mL)，实现了高效表达。该β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最适pH为5.0，在pH 2.0-9.0保持稳定；最适温度为55℃，在60℃以下保持较高酶活力；其底物特异性专一，水解大麦葡聚糖、燕麦葡聚糖和地衣多糖的产物为葡三糖和葡四糖。将该β-1,3-1,4-葡聚糖酶应用于麦芽糖化过程，可降低麦芽汁粘度(9.6％)和过滤时间(34.5％)。另外，该酶可水解燕麦麸皮中β-葡聚糖，转化率可达90％，其中葡三糖和葡四糖分别为53.3％和33.8％。本发明的β-1,3-1,4-葡聚糖酶在食品、饲料等行业具有应用的潜力。

附图说明

图1为重组载体pPIC9K-AaBglu12A的载体图谱。

图2为重组载体pPCAU-AaBglu12A的载体图谱。

图3为重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A毕赤酵母菌株在5-L发酵罐的产酶历程(■：酶活力；●：蛋白浓度；▲：菌体湿重)。

图4为β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A在5-L发酵罐中高密度发酵过程的电泳图(泳道M：低分子量标准蛋白；泳道1-8：分别为诱导0、24、48、72、96、120、144、168h的发酵上清液)。

图5为β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A的纯化电泳图(泳道M：低分子量标准蛋白；泳道1：粗酶液；泳道2：纯酶液；泳道3：经N-去糖基化酶去糖基后的纯酶)。

图6为β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A的最适pH测定曲线图(Glycine-HCl(■,pH3.0-7.0)；Sodium Citrate(●,pH 3.0-6.0)；Acetic acid-Sodium acetate(▲,pH4.0-6.0)；MES(◆,pH 5.5-6.5)；MOPS(▼,6.5-7.5)；Tris-HCl(□,pH 7.0-9.0)；CHES(○,pH8.0-10.0)；Glycine-NaOH(△,9.0-10.5)；Na₂HPO₄-NaOH(◇,pH 11.0-12.0))。

图7为β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A的pH稳定性测定曲线图(Glycine-HCl(甘氨酸-盐酸)(■,pH 3.0-7.0)；Sodium Citrate(柠檬酸-柠檬酸三钠)(●,pH 3.0-6.0)；Acetic acid-Sodium acetate(醋酸盐缓冲液)(▲,pH 4.0-6.0)；MES(◆,pH 5.5-6.5)；MOPS(▼,6.5-7.5)；Tris-HCl(□,pH 7.0-9.0)；CHES(○,pH 8.0-10.0)；Glycine-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)(△,9.0-10.5)；Na₂HPO₄-NaOH(◇,pH 11.0-12.0))。

图8为β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A的最适温度测定曲线图。

图9为β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A的温度稳定性测定曲线图。

图10为AaBglu12A水解大麦葡聚糖、燕麦葡聚糖和地衣多糖薄层层析分析结果图(G：葡萄糖；G2：纤维二糖；G3：纤维三糖；G4：纤维四糖)。

图11为β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A水解内源酶失活燕麦麸皮酶解历程图。

图12为β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A水解内源酶失活燕麦麸皮产物的高效液相色谱(HPLC)分析图(G2：纤维二糖；G3：葡三糖；G4：葡四糖)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在以下实施例中，参照Yang等(Yang et al.,Journal of IndustrialMicrobiology and Biotechnology,2014,41:1487-1495)测定β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力：添加50μL 1％(w/v)的燕麦β-葡聚糖于小试管中，55℃预热3min，然后加入150μL适当稀释的待测酶液(即待测蛋白的溶液)，55℃反应10min后加入200μL DNS试剂(每1L水溶液包含10g 3,5-二硝基水杨酸，10g NaOH和2g苯酚)，煮沸15min后加入200μL饱和酒石酸钾钠溶液，冷却后于540nm波长下测定吸光值，以葡萄糖作为标准。酶活力定义：上述条件下每分钟水解燕麦葡聚糖生成1μmol葡萄糖所需要的酶量。

下述实施例中所涉及的培养基：

1、BMGY培养基的组成如下：质量百分浓度为1％的酵母提取物，质量百分浓度为2％的蛋白胨，质量百分浓度为1.34％的无氨基酵母氮源YNB，质量百分浓度为4×10^-5％的生物素，体积百分比1％的甘油，余量为100mmol/L pH 6.0磷酸盐缓冲液。

2、改进的BMMY培养基的组成如下：质量百分浓度为1％的酵母提取物，质量百分浓度为2％的蛋白胨，质量百分浓度为1.34％的无氨基酵母氮源YNB，质量百分浓度为4×10^-5％的生物素，体积百分比0.5％的甲醇，余量为100mmol/L pH 6.0磷酸盐缓冲液。

3、YPD培养基的组成如下：质量百分浓度为1％的酵母提取物，质量百分浓度为2％的蛋白胨，质量百分浓度为2％的葡萄糖，质量百分浓度为2％的琼脂，余量为水。

4、MD培养基的组成如下：质量百分浓度为2％的葡萄糖，质量百分浓度为1.34％的无氨基酵母氮源YNB，质量百分浓度为4×10^-5％的生物素，质量百分浓度为2％的琼脂，余量为水。

5、BSM培养基：85％磷酸(85％磷酸是分析纯，％表示g/100mL)40mL，CaSO₄ 1.4g，K₂SO₄ 27.3g，MgSO₄·7H₂O 22.4g，KOH 6.19g，甘油60g，加蒸馏水至1.5L。

下述实施例中所涉及的生物材料：

泡盛曲霉CAU33筛选于土壤并保存于实验室(记载于“刘二伟等，泡盛曲霉液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件优化.食品科学，2017，16：29-35”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用)。

载体pPIC9K为美国Invitrogen公司产品。

实施例1、β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆和毕赤酵母表达

一、重组载体pPIC9K-AaBglu12A和pPCAU-AaBglu12A的构建

重组载体pPIC9K-AaBglu12A的构建：设计上游引物AaBgluEcoRIF和下游引物AaBgluNotIR，并以泡盛曲霉CAU33的cDNA为模板PCR，扩增编码成熟蛋白的核苷酸序列。扩增条件为：95℃预变性2min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸10min。产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收，以EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，将酶切后的产物与相同酶切的表达载体pPIC9K与T4DNA连接酶进行连接，热激转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，37℃倒置培养12-16h。挑选菌落PCR验证为阳性的转化子测序。将经测序表明在pPIC9K载体的多克隆位点(EcoRⅠ和NotⅠ)之间插入SEQ IDNo.2的第49-720位所示DNA片段的重组质粒命名为pPIC9K-AaBglu12A，质粒图谱如图1所示。

AaBgluEcoRIF：5′-CATGGAATTCCAGACGATGTGCTCTCAGTATGACAG-3′；

AaBgluNotIR：5′-GAATGCGGCCGCTTAGTTGACACTAGCGGTCCAGTTG-3。

重组多拷贝载体pPCAU-AaBglu12A的构建：设计上游引物AaBgluF和下游引物AaBgluR，并以泡盛曲霉CAU33的cDNA为模板PCR，扩增编码成熟蛋白的核苷酸序列。扩增条件为：95℃预变性2min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸10min。产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收。利用吉布森组装方法体外串联AOX1启动子，连接目的基因AaBglu12A(SEQ ID No.2的第49-720位)、α-factor信号肽的编码基因(SEQ IDNo.3)、2×AOX1启动子(SEQ ID No.4)和AOX1终止子(SEQ ID No.5)，形成单拷贝表达盒，再将三个如上表述的表达盒按照顺式-反式-顺式依次串联，连接到通用载体pPIC9K质粒骨架上，构建多拷贝强表达质粒pPCAU-AaBglu12A，质粒图谱见图2。热激转化E.coli Top10感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，37℃倒置培养12-16h。挑选转化子利用验证引物PCR扩增测序，提取测序正确的转化子质粒命名为pPCAU-AaBglu12A，用于下一步实验。

AaBgluF：5′-GCTGAAGCTTACGTAGAATTCCAGACGATGTGCTCTCAGTATGACAG-3′；

AaBgluR：5′-AAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCTTAGTTGACACTAGCGGTCCAGTTG-3′。

SEQ ID No.2为泡盛曲霉CAU33β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(命名AaBglu12A)的全长编码序列。SEQ ID No.2编码SEQ ID No.1所示的蛋白。预测成熟蛋白分子量为24kDa，等电点为4.63。Signal P4.1分析N端有16个氨基酸为信号肽序列。

将上述氨基酸序列在NCBI比对分析，发现AaBglu12A与来源于白曲霉(A.kawachii)GH12家族的纤维素酶(Q12679)同源性最高，为96％，与来自于棘孢曲霉(A.aculeatus)GH12家族的纤维素酶(P22669)同源性为66％。比对结果表明该蛋白具有GH12家族共同的保守序列，另Q12679与P22669注释为纤维素酶是通过基因预测，并未经过实验验证，经底物特异性评价，AaBgu12A表现为专一β-1,3-1,4-葡聚糖酶，无纤维素酶活性(实施例3，表2)。因此AaBglu12A为新型GH12家族β-1,3-1,4-葡聚糖酶。

二、β-1,3-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的表达

毕赤酵母GS115(Invitrogen公司)感受态按照毕赤酵母使用说明(Invitrogen公司)所述方法制备。用限制性内切酶SalⅠ线性化上述重组载体pPIC9K-AaBglu12A和pPCAU-AaBglu12A，并调整各自浓度1μg/μL。取80μL酵母感受态细胞，与10μL线性化的pPIC9K-AaBglu12A或pPCAU-AaBglu12A质粒混匀，置于预冷的0.2cm的电击杯中(Bio-rad公司)，电击转化。电击后，迅速加入1.0mL预冷的1M山梨醇水溶液，分别涂布于营养缺陷筛选板(MD)上，培养3-4d，分别从pPIC9K-AaBglu12A或pPCAU-AaBglu12A的MD板上挑选50个单菌落进行产酶发酵水平比较，产酶发酵过程如下：将单菌落接种于25mL BMGY培养基，30℃200rpm振荡培养至OD600nm为12左右，离心收集菌体，转接到装有100mL改进的BMMY培养基的500mL三角瓶中，使OD600nm达到8，相同培养条件培养，每24h补加甲醇至终浓度0.5％(体积百分含量，即100mL BMMY每24h补加甲醇500μL)，诱导5d。

表1不同质粒转化毕赤酵母转化子β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A酶活力比较

表1为各自pPIC9K-AaBglu12A和pPCAU-AaBglu12A质粒代表性转化子测定的β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活力，从表中可以看出，构建的多拷贝载体pPCAU-AaBglu12A比通用载体pPIC9K-AaBglu12A酶活力可高2-3倍，因此选择多拷贝载体pPCAU-AaBglu12A构建的毕赤酵母用于下一步的G418筛选。

用无菌水收集pPCAU-AaBglu12A的MD板上的菌体，将收集的菌体适当稀释后涂布不同浓度G418筛选板上，G418的浓度分别为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL，分别挑选不同G418浓度下生长良好的单菌落，进行摇瓶复筛。按照下述方法选择表达量高的菌株(摇瓶发酵验证)：挑选毕赤酵母转化子单菌落，接种于25mL BMGY培养基，30℃200rpm振荡培养至OD600nm为12左右，离心收集菌体，转接到装有100mL改进的BMMY培养基的500mL三角瓶中，使OD600nm达到8，相同培养条件培养，每24h补加甲醇至终浓度0.5％(体积百分含量，即100mL BMMY每24h补加甲醇500μL)，诱导5d。

经过筛选，获得产酶量最高的毕赤酵母菌株泡-50，采用毕赤酵母菌株泡-50使用摇瓶发酵验证，重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶表达量1600U/mL(表2)。后续将采用毕赤酵母菌株泡-50进行发酵罐高密度发酵验证。

表2部分重组毕赤酵母摇瓶发酵β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A酶活力

实施例2、重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高密度发酵及纯化

一、重组β-1,3-葡聚糖酶的高密度发酵

种子培养：将实验例1获得的重组毕赤酵母菌株泡-50接种到装有100mL BMGY或YPD培养基的500mL三角瓶中，在30℃、200rpm振荡培养24-30h，得到OD600nm约为2.0-6.0的种子液。

甘油发酵阶段：接种到5-L发酵罐中(装有1.5L BSM培养基)。过程中温度为30℃，用氨水和磷酸调节pH至5.0，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于20％(相对值，本发明以发酵条件30℃，pH 5.0，转速600rpm确定为100％，以饱和亚硫酸钠溶液溶氧为0，下同)(如搅拌转速为600rpm，通气量为2.0vvm)。待甘油消耗完全(溶氧DO值迅速上升)，进入甘油补料发酵阶段。

甘油补料发酵阶段：甘油(50％w/v，即500g/L的甘油水溶液)流速为30mL/h/L起始发酵液，流加4h。待甘油消耗完全后，停止流加，饥饿1h然后进入甲醇补料诱导表达阶段。甘油补料发酵阶段培养温度为30℃、pH为5.0、控制溶氧大于20％。

甲醇补料诱导表达阶段：温度为30℃，将pH调整到6.0，控制甲醇流速约为6mL/h/L起始发酵液，流加甲醇至菌体湿重达320g/L时停止流加，该阶段保持溶氧在20％以上，如不能使溶氧保持在20％以上，适当减小流加速度。

混合补料诱导表达阶段：温度继续保持30℃，pH继续控制在6.0，控制甲醇流速约为4-5mL/h/L起始发酵液，同时控制甘油(50％w/v，即500g/L的甘油水溶液)流速约为90mL/h/L起始发酵液至发酵结束，该阶段保持溶氧在20％以上，如不能使溶氧保持在20％以上，适当减小甘油和甲醇流加速度。

发酵过程见图3，(■)为发酵上清液(发酵结束后发酵液在10000×g条件下离心10min所得的上清液)中β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活；(●)为发酵上清液中蛋白质含量；(▲)：为菌体湿重。酶活在第7天达到最大，最高酶活达到159500U/mL，同时发酵上清液中的蛋白含量达到31.7mg/mL，菌体湿重为404g/L。发酵历程SDS-PAGE分析见图4，泳道M：低分子量标准蛋白；泳道1-8：分别为诱导0、24、48、72、96、120、144、168h的发酵上清液。

二、重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的纯化

Q-琼脂糖凝胶FF(Q-Sepharose FF)离子交换层析：取10mL发酵罐中的发酵液上清液(发酵结束后发酵液在10000×g条件下离心10min所得的上清液，即表3中的粗酶液)，透析平衡至20mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中，随后上样于用20mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液平衡的Q-Sepharose层析柱。用5个柱体积的缓冲液(20mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液)洗净未结合的蛋白后，0-500mM NaCl(NaCl添加到20mM Tris-HCl pH 8.0缓冲液中)线性洗脱并分部收集。缓冲液平衡Q-Sepharose的流速为1mL/min，上样时流速为0.5mL/min，5个柱体积洗脱未结合蛋白流速为1mL/min，含0-500mM NaCl缓冲液线性洗脱速度为1mL/min(50min内NaCl从0线性升至500mM)。将得到的纯酶合并后，用pH 5.0的柠檬酸缓冲液透析备用。

AaBglu12A经Q-Sepharose(Tris-HCl pH8.0)阴离子交换层析一步纯化，得到电泳级纯酶，该酶回收率为92％，纯化倍数为1.4倍，纯酶比酶活为7049U/mg(表3)。重组毕赤酵母菌株的粗酶液及其得到的纯化产物(AaBglu12A)的SDS-PAGE如图5所示。其中，泳道M为分子量标准，泳道1为发酵液上清，泳道2为经Q-Sepharose柱层析纯化后的纯酶。图5的结果表明，重组蛋白AaBglu12A的大小为29kDa。

表3β-1,3-1,4-葡聚糖酶的纯化表

实施例3、重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶(AaBglu12A)的性质

一、AaBglu12A的最适pH测定

分别以下述具有不同pH值的缓冲体系测定该酶最适pH值：(甘氨酸-盐酸)Glycine-HCl(pH 3.0-7.0)；(柠檬酸-柠檬酸钠)Sodium Citrate(pH 3.0-6.0)；(醋酸盐)Acetic acid-Sodium acetate(pH 4.0-6.0)；MES(pH 5.5-6.5)；MOPS(6.5-7.5)；Tris-HCl(pH 7.0-9.0)；CHES(pH 8.0-10.0)；(甘氨酸-氢氧化钠)Glycine-NaOH(9.0-10.5)；Na₂HPO₄-NaOH(pH 11.0-12.0)。然后在55℃采用标准方法测定β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活力，以酶活力最高为100％，分别计算各个pH下测定的酶活力。

结果如图6所示，重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶(AaBglu12A)的最适pH值为5.0。

二、AaBglu12A的pH稳定性测定

分别用上述不同pH的缓冲液稀释AaBglu12A酶液，将稀释的酶液在45℃恒温水浴锅中保温30min，然后冰水浴中冷却30min，最后在55℃和pH 5.0条件下按照上述方法测定β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活力，以未经处理的酶液的酶活力作为对照，分别计算经过不同酸碱条件处理后酶液的残余酶活力。以残余酶活力占对照酶活力的百分比计算相对酶活力。

结果如图7所示，重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶(AaBglu12A)具有较宽的pH稳定范围，当pH为2.0-9.0时，残余酶活力在80％以上。

三、AaBglu12A的最适反应温度测定

将AaBglu12A在50mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)中适当稀释，然后分别在30-75℃不同温度下按照上述方法测定β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力，以酶活力最高值作为100％，分别计算各个温度下测定的相对酶活力。

结果如图8所示，AaBglu12A的最适温度为55℃。

四、AaBglu12A的温度稳定性测定

将AaBglu12A在50mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)中适当稀释，然后分别在30-75℃保温30min，随后置于冰水浴中冷却30min，最后在55℃和pH 5.0条件下按照上述方法测定β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力，以未经热处理的酶液作为对照，分别计算不同热处理后酶液的残余酶活力。以残余酶活力占对照酶活力的百分比计算相对酶活力。

结果如图9所示，AaBglu12A在60℃下保持稳定，残余酶活力在80％以上。

五、底物特异性

使用多种聚糖和人工合成的对硝基苯酚-糖苷(pNP-糖苷)作为底物测定AaBglu12A的底物特异性。聚糖包括：大麦葡聚糖、燕麦葡聚糖、地衣多糖、可得然胶、昆布多糖、CMC、Avicel、罗望子胶、槐豆胶、可溶性淀粉、壳聚糖和胶体几丁质。pNP-糖苷包括：pNP-β-xylopyranoside、pNP-β-glucopyranoside、pNP-β-galactopyranoside和pNP-β-cellobioside。

具体测定方法如下：

聚糖类底物：用50mM pH 5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制为1％(w/v)的浓度，根据上述β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力测测定方法测定。

pNP-糖苷类底物：上述不同人工合成糖苷类底物用50mM pH 5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制为5mM的浓度，在55℃下反应10min，于OD540nm测定吸光值，酶活力单位(U)定义在上述反应条件下每分钟水解底物释放1μmol pNP所需要的酶量。

结果如表4所示，AaBglu12A对由β-1,3糖苷键和β-1,4糖苷键组成的大麦葡聚糖、燕麦葡聚糖和地衣多糖表现出高活性，对其他底物均未表现出活性，证实该酶底物特异性专一。

表4重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A的底物特异性

底物种类	比酶活力(U/mg)	相对酶活力(％)
			燕麦葡聚糖	7049	100
大麦葡聚糖	8247	117
			地衣多糖	4864	69
可得然胶	-
			昆布多糖	-
CMC	-
			Avicel	-
罗望子胶	-
			pNP-β-glucopyranoside	-
pNP-β-cellobioside	-

“-”表示未测到活性

六、AaBglu12A的水解特性

以50mM pH 5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制1％(即1g/100mL)不同底物(大麦葡聚糖、燕麦葡聚糖和地衣多糖)，加酶量为10U/mL，50℃保温12h。为监测反应进程，分别于0min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h取样，沸水浴保温10min灭酶。通过薄层层析(TLC)分析水解产物(展层剂：正丁醇/乙酸/水＝2:1:1(体积比)；显色剂：硫酸/甲醇＝5/95(体积比))。

薄层层析结果如图10所示。可以看出，AaBglu12A能够有效水解大麦葡聚糖、燕麦葡聚糖和地衣多糖，水解产物以葡三糖和葡四糖为主。

实施例4、重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A在麦芽糖化中的应用

一、麦芽汁的制备及相关参数测定方法

麦芽汁制备采用协定糖化。称取已磨好的麦芽细粉(<0.2mm)50.0g，放入糖化杯(重量已知)中，倒入已预热至45℃的水200mL，于45℃糖化仪中保温30min(实验组加入一定量酶液，对照不加酶)，不断搅拌。然后使醪液以每分钟1℃的速率在25min内升温至70℃，再往糖化杯中加入已预热好70℃的水100mL，在70℃下保温1h，糖化过程不断搅拌。糖化结束后，将醪液在10-15min内迅速冷却至室温，用蒸馏水将搅拌器上残渣冲洗干净，擦干糖化杯外壁的水，用蒸馏水将醪液补重至450.0g，然后用中速滤纸(18折)过滤，将最初收集的100mL滤液倒回重滤，此时开始计时，记录收集200mL滤液所需的时间即为麦芽汁过滤时间，直至滤层表面没有液体为止，所收集的滤液即为协定麦芽汁。每次制备好的协定麦芽汁，理化指标应在4h内测定完毕(QB/T1686,2008)。麦芽汁比重计浸出物含量和麦芽汁粘度的测定参照闫巧娟等专利(专利号：CN201610416008，申请日：20160614)

重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶(AaBglu12A)对麦芽糖化的影响如表5所示。结果表明随着AaBglu12A的添加量增大，麦芽的过滤时间和粘度均在降低，当加酶量为70U/g麦芽时，麦芽汁粘度降低了9.6％，过滤时间减少了34.5％。

表5重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶(AaBglu12A)对麦芽糖化的影响

实施例5、重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶AaBglu12A水解燕麦麸皮制备葡寡糖

本实施例所用的燕麦麸皮为常规脱油燕麦麸皮，粒径在10-200目之间。

内源酶失活燕麦麸皮是通过将燕麦麸皮以1:10(w/v)加入80％乙醇(即1g燕麦麸皮加入10ml 80％乙醇)，并在75℃下加热回流2h制备获得的。以下提到的燕麦麸皮均为内源酶失活燕麦麸皮。

取40目燕麦麸皮2g，加50mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(50mM pH 5.0)，加酶100U/g底物，于50℃酶解4h，然后煮沸10min终止酶解反应，10000g离心10min后取上清液过0.45μm滤膜备TLC和HPLC分析。TLC分析方法同实施例3中步骤六。HPLC分析：Agilent高效液相；RID检测器；色谱条件：色谱柱为Shodex KS-802，流动相：水，流速：0.8mL/min，柱温：65℃，运行时间：20min；RID检测器温度：35℃。

β-葡寡糖转化率计算方法：Y_GOS(％)＝C_G2-G4×V/2000×8.9％×100％

其中C_G2-G4为酶解上清液二糖-四糖的浓度(mg/mL)，V为酶解完成后离心上清液体积，2000mg为燕麦麸皮质量，8.9％为本实验燕麦麸皮中的β-1,3-1,4葡聚糖含量。

水解燕麦麸皮制备β-葡寡糖历程如图11所示。随着水解时间的增加，葡三糖和葡四糖得率不断提高，当酶解时间为4h时，葡寡糖转化率达到最高(90％)，此时葡三糖和葡四糖的得率分别为53.3％和33.8％。水解终产物如图12所示。酶解产物以葡三糖和葡四糖为主，有少量的纤维二糖产生。

另外，采用表2中泡-50外的其他重组毕赤酵母进行实施例3-5的实验，所得结果与上述大体一致，均能得到性能较好的β-1,3-1,4-葡聚糖酶。

<110> 中国农业大学

<120> 泡盛曲霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶的表达纯化方法

<130> GNCLN190307

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 239

<212> PRT

<213> Aspergillus awamori

<400> 1

Met Lys Leu Ala Val Thr Leu Ser Met Leu Ala Ala Thr Ala Met Gly

1 5 10 15

Gln Thr Met Cys Ser Gln Tyr Asp Ser Ala Ser Ser Pro Pro Tyr Ser

20 25 30

Val Asn Gln Asn Leu Trp Gly Glu Tyr Gln Gly Thr Gly Ser Gln Cys

35 40 45

Val Tyr Val Asp Lys Leu Ser Ser Ser Gly Ala Ser Trp His Thr Lys

50 55 60

Trp Thr Trp Ser Gly Gly Glu Gly Thr Val Lys Ser Tyr Ser Asn Ser

65 70 75 80

Gly Leu Thr Phe Asp Lys Lys Leu Val Ser Asp Val Ser Ser Ile Pro

85 90 95

Thr Ser Val Lys Trp Ser Gln Asp Asp Thr Asn Val Gln Ala Asp Val

100 105 110

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn Ala Asp His Ala Thr Ser Ser

115 120 125

Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Ala Arg Tyr Gly Thr Val Gln

130 135 140

Pro Ile Gly Lys Gln Ile Ala Thr Ala Thr Val Gly Gly Lys Ser Trp

145 150 155 160

Glu Val Trp Tyr Gly Thr Ser Val Gln Ala Gly Ala Glu Gln Lys Thr

165 170 175

Tyr Ser Phe Val Ala Gly Ser Pro Ile Asn Ser Tyr Ser Gly Asp Ile

180 185 190

Lys Asp Phe Phe Asn Tyr Leu Thr Gln Asn Gln Gly Phe Pro Ala Ser

195 200 205

Ser Gln His Leu Ile Thr Leu Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly

210 215 220

Gly Pro Ala Thr Phe Thr Val Asp Asn Trp Thr Ala Ser Val Asn

225 230 235

<210> 2

<211> 720

<212> DNA

<213> Aspergillus awamori

<400> 2

atgaagctcg ctgtgacact ttctatgctt gcggccaccg ccatgggcca gacgatgtgc 60

tctcagtatg acagtgcctc gagcccccca tactcggtga accagaacct ctggggcgaa 120

taccagggca ctggcagcca gtgtgtctac gtcgacaagc tcagcagcag tggtgcctca 180

tggcatacca agtggacctg gagtggtggc gagggaacag tgaaaagtta ctctaactcc 240

ggtcttacgt ttgacaagaa gctagtcagc gatgtgtcaa gcattcccac ctcggtgaaa 300

tggagccagg acgacaccaa tgtccaagcc gatgtctcat atgatctgtt caccgcggca 360

aatgcggatc atgccacttc cagcggtgac tatgagctta tgatttggct tgcccgctac 420

ggcacagtcc agcctattgg caagcagatt gccactgcca ctgtgggagg caagtcctgg 480

gaggtgtggt atggtaccag cgtccaggcc ggtgcggagc agaagacata tagcttcgtg 540

gcaggatctc ctatcaactc gtacagtggg gacatcaagg acttcttcaa ctatctcacc 600

cagaaccaag gcttcccggc tagctctcag catttgatca ccctgcaatt tggaactgag 660

ccgttcaccg gtggcccggc aaccttcacg gttgacaact ggaccgctag tgtcaactaa 720

<210> 3

<211> 267

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagct 267

<210> 4

<211> 1476

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

attggagctc gctcattcca attccttcta ttaggctact aacaccatga ctttattagc 60

ctgtctatcc tggcccccct ggcgaggttc atgtttgttt atttccgaat gcaacaagct 120

ccgcattaca cccgaacatc actccagatg agggctttct gagtgtgggg tcaaatagtt 180

tcatgttccc caaatggccc aaaactgaca gtttaaacgc tgtcttggaa cctaatatga 240

caaaagcgtg atctcatcca agatgaacta agtttggttc gttgaaatgc taacggccag 300

ttggtcaaaa agaaacttcc aaaagtcgcc ataccgtttg tcttgtttgg tattgattga 360

cgaatgctca aaaataatct cattaatgct tagcgcagtc tctctatcgc ttctgaaccc 420

cggtgcacct gtgccgaaac gcaaatgggg aaacacccgc tttttggatg attatgcatt 480

gtctccacat tgtatgcttc caagattctg gtgggaatac tgctgatagc ctaacgttca 540

tgatcaaaat ttaactgttc taacccctac ttgacagcaa tatataaaca gaaggaagct 600

gccctgtctt aaaccttttt ttttatcatc attattagct tactttcata attgcgactg 660

gttccaattg acaagctttt gattttaacg acttttaacg acaacttgag aagatcaaaa 720

aacaactaat tattcgaaat tggagctcgc tcattccaat tccttctatt aggctactaa 780

caccatgact ttattagcct gtctatcctg gcccccctgg cgaggttcat gtttgtttat 840

ttccgaatgc aacaagctcc gcattacacc cgaacatcac tccagatgag ggctttctga 900

gtgtggggtc aaatagtttc atgttcccca aatggcccaa aactgacagt ttaaacgctg 960

tcttggaacc taatatgaca aaagcgtgat ctcatccaag atgaactaag tttggttcgt 1020

tgaaatgcta acggccagtt ggtcaaaaag aaacttccaa aagtcgccat accgtttgtc 1080

ttgtttggta ttgattgacg aatgctcaaa aataatctca ttaatgctta gcgcagtctc 1140

tctatcgctt ctgaaccccg gtgcacctgt gccgaaacgc aaatggggaa acacccgctt 1200

tttggatgat tatgcattgt ctccacattg tatgcttcca agattctggt gggaatactg 1260

ctgatagcct aacgttcatg atcaaaattt aactgttcta acccctactt gacagcaata 1320

tataaacaga aggaagctgc cctgtcttaa accttttttt ttatcatcat tattagctta 1380

ctttcataat tgcgactggt tccaattgac aagcttttga ttttaacgac ttttaacgac 1440

aacttgagaa gatcaaaaaa caactaatta ttcgaa 1476

<210> 5

<211> 247

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

tcaagaggat gtcagaatgc catttgcctg agagatgcag gcttcatttt tgatactttt 60

ttatttgtaa cctatatagt ataggatttt ttttgtcatt ttgtttcttc tcgtacgagc 120

ttgctcctga tcagcctatc tcgcagctga tgaatatctt gtggtagggg tttgggaaaa 180

tcattcgagt ttgatgtttt tcttggtatt tcccactcct cttcagagta cagaagatta 240

agtgaga 247

Claims

1.一种生产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的方法，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，所述来源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶为如下任一所示蛋白质：

a1)SEQ ID No.1自N末端第17至239位氨基酸残基组成的蛋白质；

a2)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，所述来源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的编码基因是通过重组载体的形式导入所述受体酵母中的。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体1或重组表达载体2；

所述重组表达载体1为将表达盒1按照顺式-反式-顺式依次串联然后克隆到pPIC9K载体的多克隆位点后得到的重组质粒；所述表达盒1由2×AOX1启动子、α-factor信号肽的编码基因、所述来源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的编码基因和AOX1终止子顺次连接而成；

进一步地，所述α-factor信号肽的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述2×AOX1启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述AOX1终止子的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示；

所述重组表达载体2为将所述来源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的编码基因插入到pPIC9K载体的多克隆位点后得到的重组质粒。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述酵母为毕赤酵母；

进一步地，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，所述来源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的编码基因为如下任一所述的DNA分子：

b1)SEQ ID No.2的自5′末端第49-720位所示的DNA分子；

b2)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：步骤B1)中，接种于所述BSM培养基中的所述重组酵母为所述重组酵母的种子液；

进一步地，所述种子液为将步骤(A)所得的重组酵母接种于BMGY培养基或YPD培养基，在30℃、200rpm振荡培养24-30h所得；

和/或

步骤B1)中，将所述种子液接种于所述BSM培养基为接种于装有所述BSM培养基的发酵罐中，所述BSM培养基在所述发酵罐中的装液量为所述发酵罐容积的1.5/5；

和/或

步骤B1)中，所述培养的温度为30℃、pH为5.0、控制溶氧大于20％；

和/或

步骤B2)中，所述甘油是溶于水中而形成的500g/L的甘油水溶液；所述甘油补料发酵阶段的培养温度为30℃、pH为5.0、控制溶氧大于20％；

和/或

步骤B3)中，所述甲醇补料诱导表达阶段的培养温度为30℃、pH为6.0、控制溶氧大于20％；

和/或

步骤B4)中，所述甘油是溶于水中而形成的500g/L的甘油水溶液；所述混合补料诱导表达阶段的培养温度为30℃、pH为6.0、控制溶氧大于20％。

8.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：步骤(B)中，对所述重组酵母进行发酵培养后还包括如下步骤：将发酵液的上清液进行透析除盐，然后进行阴离子交换层析，用含0-500mM NaCl的20mM Tris-HCl pH 8.0缓冲液进行线性洗脱，收集得到纯化后β-1,3-1,4-葡聚糖酶；

进一步地，所述阴离子交换层析为Q-琼脂糖凝胶FF离子交换层析；和/或

所述用含0-500mM NaCl的20mM Tris-HCl pH 8.0缓冲液进行线性洗脱的洗脱程序为：50min内NaCl的浓度从0线性升至500mM。

9.利用权利要求1-8中任一所述方法制备得到的β-1,3-1,4-葡聚糖酶。

10.如下任一所示应用：

(C1)权利要求8所述的β-1,3-1,4-葡聚糖酶在麦芽糖化中的应用；

(C2)权利要求8所述的β-1,3-1,4-葡聚糖酶在燕麦麸皮水解中的应用；

进一步地，步骤(C1)中，所述β-1,3-1,4-葡聚糖酶在麦芽糖化过程中的添加量为60-100U/g麦芽；

更进一步地，步骤(C1)中，所述β-1,3-1,4-葡聚糖酶在麦芽糖化过程中的添加量为70U/g麦芽；