CN108165540B

CN108165540B - 一种米黑根毛霉α-淀粉酶及其编码基因与应用

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Publication number: CN108165540B
Application number: CN201810139908.9A
Authority: CN
Inventors: 闫巧娟; 胡慧芳; 江正强; 易萍; 赵宁; 王玉川
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-02-11
Filing date: 2018-02-11
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2038-02-11
Also published as: CN108165540A

Abstract

本发明涉及一种米黑根毛霉α‑淀粉酶及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质具有α‑淀粉酶活力，该蛋白质的基因在毕赤酵母中高效表达，经毕赤酵母高密度发酵后的最高酶活为29794.2U/mL，纯化后的比酶活为3502.1U/mg，最适反应pH为6.0，在pH 4.5‑8.0保持稳定；最适反应温度为75℃，在65℃以下保持较高酶活力，具有较好的耐热性。所述酶应用于馒头中，能使馒头比容增大7.7％，同时能延缓馒头老化；应用于麦芽糖生产中，麦芽糖含量能够达到54.1％。所述酶在食品行业中具有良好的应用潜力。

Description

一种米黑根毛霉α-淀粉酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及食品生物技术领域，具体说是一种米黑根毛霉α-淀粉酶及其编码基因与应用。

背景技术

α-淀粉酶[EC.3.2.1.1]属于糖苷水解酶类第13家族，是作用于淀粉分子内部切开α-1,4-糖苷键生成糊精和还原糖的一种淀粉酶，其产物的末端残基碳原子为α构型，故称为α-淀粉酶。α-淀粉酶的来源广泛，存在于动物、植物和微生物中。微生物易培养和大规模发酵，能够大量生产淀粉酶，部分微生物菌株已经被用作工业生产菌株。

由于α-淀粉酶的需求量日益增大，分子生物学和生物化学的发展使基因工程技术在酶制剂方面的应用越来越多。已有多种α-淀粉酶在大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌和黑曲霉等表达系统中成功表达。如来源于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的α-淀粉酶BlAmy-opt在毕赤酵母中表达后，在5L发酵罐中经高密度发酵，酶活和蛋白含量分别达到8100U/mL和8.3g/L；在50L发酵罐中经高密度发酵，酶活和蛋白含量分别达到11000U/mL和12.2g/L(Wang J,Li Y,Liu N,et al.Codon optimizationsignificantly improves the expression level ofα-amylase gene from Bacilluslicheniformis in Pichia pastoris.2015,2015:1～9)。

α-淀粉酶广泛应用于食品工业中。如Rhizopus oryzae FSIS4来源的α-淀粉酶添加到面包中，比容和高径比分别比对照增加了0.72mL/g和0.20(Ait A,Gagaoua M,Bourekoua H,et al.Improving bread quality with the application of a newlypurified thermostableα-amylase from Rhizopus oryzae FSIS4.Foods,2017,6(1):1)。来源于埃默森篮状菌和棒曲霉的α-淀粉酶的最适pH分别为3.5和4.5，且在30-70℃范围酶活力较高，在淀粉糖化过程中，这两种酶可以与葡糖淀粉酶组合用于糖化反应，以消除在糖化过程中因必须对pH和温度重新调整而实施分批过程的需求(丹尼斯科美国公司.使用来自埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)的α-淀粉酶进行糖化的方法.中国专利，201380052438.8；丹尼斯科美国公司.使用来自棒曲霉(Aspergillus clavatus)的α-淀粉酶进行糖化.中国专利，201380024428.3)。来源于Streptomyces badius DB-1的α-淀粉酶可以水解生淀粉，将淀粉可以不用预糊化而直接水解，从而降低淀粉加工过程中的生产能耗，在淀粉加工业中具有一定的应用潜力(Shivlata L,SatyanarayanaT.Characteristics of raw starch-digesting alpha-amylase of Streptomycesbadius DB-1with transglycosylation activity and its applications.AppliedBiochemistry and Biotechnology,2017,181(4):1283-1303)。

α-淀粉酶除应用在食品工业中，在饲料、医药、造纸、纺织和洗涤剂等工业上有广泛的应用。目前，虽然已有几百种α-淀粉酶被发掘，但在各个行业中应用的α-淀粉酶的性质需求不同，因此开发一些新型、表达量高和具有特殊特性的α-淀粉酶仍具有重要的研究意义和实际应用价值。

米黑根毛霉是一种嗜热真菌，最早应用于工业生产凝乳酶和脂肪酶，这两种酶在国标GB2760-2014中被允许用作食品添加剂(中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 2760-2014.食品安全国家标准食品添加剂使用标准.北京:中国标准出版社,2015-05-24)。目前，关于米黑根毛霉来源的α-淀粉酶还没有报道，因此可以从中提取α-淀粉酶基因，将其进行外源表达，研究α-淀粉酶的性质和在食品中的应用。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种米黑根毛霉α-淀粉酶及其编码基因与应用。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

本发明提供的α-淀粉酶，GenBank编号为MG552704，英文名称为RmAmyA，来源于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432，该菌已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。保藏日期：2011年6月21日。保藏编号为CGMCC No.4967。

是以下1)或2)或3)的蛋白质：

1)序列表序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)序列表序列2自氨基酸末端第20至465位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3)将1)或2)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

为了使1)或2)或3)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagⅡ	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明保护编码上述蛋白质的核酸分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA分子，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA分子，如mRNA或hnRNA等。

所述DNA分子为以下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表序列1所示的DNA分子；

2)序列表序列1的第58至1395位所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

本发明保护含有以上任一所述编码基因的重组载体(即重组质粒)、表达盒、转基因细胞或重组菌。

所述重组载体为在载体pPIC9K的多克隆位点插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重组质粒pPIC9K-RmAmyA。

所述重组载体具体可为用序列表中序列1所示的核苷酸序列替换载体pPIC9K的EcoRI和NotI识别序列间的片段(载体pPIC9K被限制性核酸内切酶EcoRI和NotI切成一个大片段和一个小片段，替换该小片段)，得到的重组质粒pPIC9K-RmAmyA。

所述重组菌可通过将所述重组载体导入宿主微生物中得到。

所述宿主微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。所述酵母为巴斯德毕赤酵母GS115。

将所述的重组载体导入巴斯德毕赤酵母中，得到重组巴斯德毕赤酵母。

本发明的另一目的在于提供一种生产所述α-淀粉酶的方法。

所述方法是将所述重组菌进行发酵培养，得到所述的α-淀粉酶。

所述发酵培养依次经过如下步骤：

1)种子液培养：将重组菌接种到150mL BMGY培养基中，在30℃，200rpm条件下振荡过夜培养至OD₆₀₀为2-6，得到种子液；

2)基础培养：将步骤1)的种子液接种于含有1.5L基本培养基BSM的5L发酵罐中培养，所述培养温度为30℃，pH为4.0，转速600rpm，待甘油消耗完全，进行甘油流加培养；

3)甘油流加培养：流加质量浓度为50％(w/v)的甘油，温度为30℃，pH为5.0，通过调整流加速度保持溶氧在20％-70％，流加时间4-6h；待菌体湿重达到180-220g/L，停止流加甘油；

4)甲醇诱导培养：停止流加甘油后，饥饿半小时，流加100％甲醇诱导，转速800rpm，培养温度为30℃，pH为6.0，溶氧20％-70％。

本发明保护上述方法生产α-淀粉酶的纯化方法。

所述纯化方法是发酵液经透析除盐后，经DE52弱阴离子柱层析，用含有200mMNaCl的20mM PB(pH 6.0)缓冲液洗脱收集得到纯的蛋白。

本发明保护所述α-淀粉酶的应用。

上述α-淀粉酶在面制品和麦芽糖生产中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种来源于米黑根毛霉的α-淀粉酶及其编码基因。该蛋白氨基酸序列与Rhizomucor pusillus来源的α-淀粉酶的氨基酸序列相似度最高，为70％。米黑根毛霉α-淀粉酶基因在毕赤酵母中成功表达，毕赤酵母在5L发酵罐中高密度发酵，酶活力可达29794.2U/mL，蛋白含量可达8.92mg/mL，实现了高效表达。所述α-淀粉酶的分子量为51.0kDa；最适反应pH为6.0，在pH 4.5-8.0保温30min，残余酶活力在80％以上；最适反应温度为75℃，在65℃下保持较好的稳定性。本发明提供的α-淀粉酶添加到馒头中能够使馒头比容增大7.7％，并能延缓馒头老化；可水解淀粉液化液生产麦芽糖浆，麦芽糖含量可达到54.1％。本发明提供的α-淀粉酶在食品工业上具有很大应用潜力。

附图说明

本发明有如下附图：

图1为α-淀粉酶在5L发酵罐中高密度发酵的产酶历程图(A)和SDS-PAGE电泳图(B)(■：酶活；●：蛋白浓度；▼：菌体湿重；M：标准蛋白；0-6：发酵时间(d))。

图2为α-淀粉酶的纯化电泳图(M：标准蛋白；1：粗酶液；2：纯酶液；3：Endo H处理后的蛋白)。

图3为SDS-PAGE法(A)和凝胶过滤法(B)测α-淀粉酶分子量(标准蛋白：●；重组蛋白：▲)。

图4为α-淀粉酶的最适pH(A)和pH稳定性(B)测定曲线图(▲：sodium citrate；■：sodium acetate；◆：sodium phosphate；●：MPOS；○：Tris-HCl；△：glycinate)。

图5为α-淀粉酶的最适反应温度(A)、温度稳定性(B)和半衰期(C)测定曲线图(◆：60℃；▲：65℃；■：70℃)。

图6为α-淀粉酶水解淀粉的历程图。

图7位α-淀粉酶水解麦芽寡糖的历程图。

图8为α-淀粉酶对馒头比容和高径比的影响曲线图。

图9为α-淀粉酶对馒头储藏期间硬度的影响曲线图。

图10为α-淀粉酶加酶量对麦芽糖含量的影响曲线图。

图11为糖化温度对麦芽糖含量的影响曲线图。

图12为糖化时间对麦芽糖含量的影响曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂如分子试剂、克隆表达载体、菌株以及发酵用原料等，如无特殊说明均可从商业途径获得。

以下实施例中α-淀粉酶酶活力的测定方法及定义如下：

在试管中加900μL 1％(w/v)的可溶性淀粉，在75℃水浴中保温2min，加100μL用50mM pH 6.0的磷酸盐缓冲液稀释适当倍数的酶液反应10min，加1mL DNS试剂终止反应，将试管移至沸水中煮10min，用自来水冷却至室温，在540nm下测吸光值。淀粉酶酶活力定义：在以上条件下，每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量，以U表示。

实施例1.米黑根毛霉α-淀粉酶在重组巴斯德毕赤酵母中的表达

一、重组菌的构建

设计上游引物RmAmyAEcoRIF：

5’-CCGGAATTCAAGCCATTGCCACTCGCTAAG-3’(下划线示EcoRⅠ酶切位点，下划线后序列与序列表序列1中的第58-78位相匹配)；

设计下游引物RmAmyANotIR：

5’-GAATGCGGCCGCTTAAGCTCTCTGGAAAATAGCGGG-3’(下划线示NotⅠ酶切位点，下划线后序列与序列表序列1中的第1375-1398位相匹配)；

以米黑根毛霉α-淀粉酶的cDNA为模板，PCR扩增所述蛋白的氨基酸的编码基因序列。PCR扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，循环34次，72℃后延伸10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。对PCR扩增产物回收，以EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，将该双酶切后的产物与经相同双酶切过的酵母表达载体pPIC9K的载体骨架片段以T4DNA连接酶进行连接，连接后的质粒转入DH5α感受态中，涂于LB Amp⁺板上，挑取单菌落进行菌落PCR，将条带正确的菌落进行测序，比对后得到阳性克隆。将得到的重组载体命名为pPIC9K-RmAmyA。将得到的重组载体pPIC9K-RmAmyA以限制性内切酶SalⅠ线性化后得到电转化巴斯德毕赤酵母GS115，构成重组菌。

二、高拷贝筛选

将步骤一中得到的重组菌涂布MD平板(1.34％YNB，4×10^-5％生物素，2％葡萄糖)，从MD平板得到的His⁺转化子经灭菌水刮取后取100μL涂布于不同浓度的YPD-G418平板(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖，G418浓度分别为1、2和4mg/mL)。30℃下培养3-5d后，挑取转化子于BMGY培养基(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，100mM pH 6.0的PB缓冲液，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，1％甘油)摇瓶培养16-18h，3000rpm离心5min，收集菌体，用BMMY培养基(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，100mM pH 6.0的PB缓冲液，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，0.5％甲醇)重悬菌体至OD₆₀₀为1.0左右，诱导目标蛋白表达。以上培养条件为100mL三角瓶装量10mL培养基，温度30℃，转速200rpm。

三、重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵

将步骤二获得产酶水平高的重组巴斯德毕赤酵母菌株在5L发酵罐中进行高密度发酵。发酵方法及培养基(种子培养基BMGY、发酵基本培养基BSM、甘油分批补料培养基和100％甲醇诱导培养基)的配制参照Pichia Fermentation Process Guidelines(VersionB，053002，Invitrogen)。整个发酵过程采用种子液培养、基础培养、甘油流加培养和100％甲醇诱导培养四个阶段。

1)种子液培养：选择摇瓶发酵中产酶水平较高的重组菌株，接种到150mL BMGY培养基中，在30℃，200rpm条件下振荡过夜培养至OD₆₀₀为2-6，得到种子液。

2)基础培养：将步骤1)的种子液接种到5L发酵罐中(装有1.5L发酵基本培养基BSM)，发酵罐灭菌，28％浓氨水调pH 4.0，加入PTM₁ 4.35mL/L起始发酵液，接种量10％，转速600rpm，温度30℃。待甘油消耗完全(溶氧值迅速上升)，开始甘油流加培养阶段。

3)甘油流加培养：流加质量浓度为50％(w/v)的甘油，控制温度为30℃，pH 5.0，始终监视溶氧，通过调整流加速度保持溶氧大于20％。流加时间4-6h，菌体湿重达到180-220g/L，停止流加甘油。

4)100％甲醇诱导培养：停止流加甘油后，饥饿30min左右，流加100％甲醇诱导，转速800rpm，监控溶氧大于20％，控制温度30℃，pH 6.0。

发酵过程中取样测菌体湿重、蛋白质含量和酶活力。发酵过程中菌体湿重、蛋白含量和酶活力变化如图1A所示，发酵过程中蛋白的SDS-PAGE电泳图如图1B所示。高密度发酵120h时酶活达到最高，发酵上清液酶活为29794.2U/mL，蛋白浓度为8.92mg/mL。

实施例2.α-淀粉酶的纯化和酶学性质

一、α-淀粉酶的纯化

将发酵液于4℃、10000rpm离心10min，取上清置于20mM PB(pH 6.0)缓冲液中在4℃下透析过夜，透析后的酶液于4℃、10000rpm离心10min。处理后的酶液进行DE52弱阴离子柱纯化。层析柱预先用20mM PB(pH 6.0)缓冲液平衡，流速为0.5mL/min；将酶液以0.5mL/min流速上样；用20mM PB(pH 6.0)缓冲液冲洗柱子至OD₂₈₀小于0.1，流速为1.0mL/min；用含有100mM NaCl的20mM PB(pH 6.0)缓冲液冲洗柱子至OD₂₈₀小于0.1，流速为1.0mL/min；用含有200mM NaCl的20mM PB(pH 6.0)缓冲液冲洗柱子至OD₂₈₀小于0.1，流速为1.0mL/min，收集洗脱后的溶液，并用SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，结果如图2所示。α-淀粉酶的纯化结果见表2。用SDS-PAGE法和凝胶S-100层析法测α-淀粉酶的分子量，结果如图3所示。

表2 α-淀粉酶的纯化表

由SDS-PAGE(图3A)和凝胶S-100(图3B)分析，变性状态下去糖基化后的蛋白分子量为49.6kDa，活性状态下的蛋白分子量为51.0kDa，与预测分子量50.2kDa接近。

二、α-淀粉酶的酶学性质

1)最适反应pH及pH稳定性

最适反应pH在50℃条件下测定，选择的pH范围及体系如下(50mM)：柠檬酸钠缓冲液(3.0-6.0)，乙酸钠缓冲液(4.0-5.5)，MES缓冲液(5.5-7.0)，PB缓冲液(6.0-8.0)，MOPS缓冲液(6.5-8.0)，Tris-HCl缓冲液(7.0-9.0)，甘氨酸-NaOH缓冲液(8.5-10.5)。用以上缓冲液代替常规测酶活用的缓冲液，比较这些缓冲体系中酶活力差异，以最高酶活为100％。

用上述缓冲液将纯酶稀释适当倍数，在50℃保温30min，冰水浴冷却30min后，在最适pH条件下测酶活，以未作处理的酶液做对照，计算残余酶活。

结果表明，α-淀粉酶的最适反应pH为6.0(图4A)，在pH 4.5-8.0处理30min，残余酶活力在80％以上(图4B)。

2)最适反应温度、温度稳定性和半衰期

用50mM PB 6.0缓冲液将酶液稀释到适当倍数，分别测α-淀粉酶在30-85℃的不同温度下的酶活，以最高酶活为100％。

用50mM PB 6.0缓冲液将酶液稀释到适当倍数，放入30-85℃的不同温度下保温30min，放入冰水浴中冷却30min，以未做处理的酶液做对照，计算酶的残余酶活力。

纯酶用50mM PB 6.0缓冲液稀释到适当倍数，分别置于60℃、65℃、70℃不同温度下处理0-4h，不同时间间隔取样，以未经上述处理的稀释后的酶液作为对照，测定α-淀粉酶酶活，计算残余酶活力占对照酶活力的百分比，得到α-淀粉酶在不同温度下的衰减至50％的时间。

结果表明，α-淀粉酶的最适反应温度为75℃(图5A)，在65℃以下保持较好的稳定性(图5B)，α-淀粉酶在60℃、65℃、70℃时半衰期分别为309.2min、57.3min、12.9min(图5C)。

3)底物特异性

分别以可溶性淀粉、支链淀粉、直链淀粉、普鲁兰糖、α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精为底物测其底物特异性，底物浓度均为10mg/mL，反应条件中缓冲液为50mM PB(pH6.0)、75℃、反应10min。以可溶性淀粉为底物时的酶活为100％，不同底物条件下的相对酶活力结果如表3所示。

表3 RmAmyA的底物特异性

结果表明，以直链淀粉为底物时，该酶表现出相对较高的酶活力，对支链淀粉和γ-环糊精表现的酶活力明显降低，对普鲁兰糖和β-环糊精表现出较低的水解能力，该酶不能水解α-环糊精。

4)水解特性

对可溶性淀粉、支链淀粉、直链淀粉、普鲁兰糖、麦芽糊精、β-环糊精、γ-环糊精、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖和麦芽六糖进行水解。水解条件：底物浓度均为10mg/mL，溶于50mM PB(pH 6.0)缓冲液中，酶添加量为2.5U/mL，55℃水浴反应12h，定时取样。TLC条件：硅胶板(60F 254，E.Merk，德国)在正丁醇-乙酸-水(2:1:1)展层剂中展层2次，在其表面均匀喷洒5％硫酸甲醇溶液，吹干后在130℃显色。以麦芽寡糖的混合物为标准品。该酶水解淀粉类底物的历程结果如图6所示，水解麦芽寡糖的历程结果如图7所示。

该酶水解可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉、麦芽糊精、β-环糊精和γ-环糊精时，水解产物主要为麦芽糖，有少量葡萄糖产生。该酶能水解普鲁兰糖，但酶活较低，水解速度较为缓慢，水解产物主要是麦芽糖和葡萄糖，无潘糖产生。该酶水解麦芽寡糖过程中有大于水解物本身的麦芽寡糖产生，说明该酶具有一定的转糖苷活性。

实施例3.α-淀粉酶在馒头中的应用

一、馒头的制作方法

称取500g面粉放入和面机中，将4g酵母溶于235g水中，将水倒入面粉中，低速搅拌使面粉成团，高速搅拌3min。将面团分割成100g/个，将面团搓圆，放入38℃、80％相对湿度的醒发箱中醒发45min，醒发完后放入蒸锅中蒸15min。RmAmyA添加量为0.25-1.25ppm(mg/Kg面粉)。

二、馒头高径比和比容测定

比容：将蒸好的馒头放在室温下冷却1h后，用天平称量馒头的质量，用菜籽排体积法测量馒头的体积，馒头的比容为体积与质量的比值。

高径比：用游标卡尺测量馒头的直径和高度，馒头的高径比为馒头的高度与直径的比值。

该酶对馒头比容和高径比的影响如图8所示。该酶添加量为1.0ppm时，馒头的比容最大，比对照增大7.7％。该酶添加量为0.5ppm时，馒头的高径比最大。

三、馒头老化测定

将馒头放在4℃条件下储藏，在储藏的不同时间点测馒头的硬度。

硬度测量：将馒头切成20mm的馒头片，采用FTC质构仪的圆柱形探头，采用二次咀嚼模式测量馒头的质构，探头下降速度和上升速度为1mm/s，形变量为30％。

该酶对馒头储藏期间硬度的影响如图9所示。随着储藏时间延长，所有的馒头硬度都增加，在2d内硬度增加速度最快；同一储藏时间，随该酶添加量增加，馒头的硬度逐渐减小，说明该酶对抑制馒头老化有效果。

实施例4.α-淀粉酶在制备麦芽糖浆中的应用

一、α-淀粉酶加酶量对麦芽糖含量的影响

在温度60℃、自然pH(pH 5.9)条件下，按照液化液质量分别添加α-淀粉酶80、85、90、95、100、105和110U/g，水解8h，HPLC检测麦芽糖的含量。HPLC检测条件为：氨基键合柱，柱温45℃；流动相：乙腈:水＝60:40，流速1mL/min，进样体积10μL，糖化液过0.22μm滤膜。液化液水解后的糖化液中的麦芽糖含量计算方法如下：

干物质质量测定：阿贝折光仪直接测定。

α-淀粉酶加酶量对麦芽糖含量的影响如图10所示。加酶量为95U/g时，麦芽糖含量达到最大，为52.3％，此时的水解率为63.1％。

二、糖化温度对麦芽糖含量的影响

在自然pH(pH 5.9)，加酶量为95U/g时，分别在温度55℃、60℃、65℃、70℃和75℃条件下水解8h，HPLC检测麦芽糖含量，检测和计算方法同步骤一。糖化温度对麦芽糖含量的影响如图11所示。糖化温度为70℃时，糖化液中麦芽糖含量最高，为53.7％，此时的水解率为67.6％。

三、糖化时间对麦芽糖含量的影响

在糖化温度70℃、自然pH(pH 5.9)、加酶量95U/g条件下，分别糖化水解4h、6h、8h、10h、12h、16h、20h和24h，HPLC检测麦芽糖含量，检测和计算条件同步骤一。糖化时间对麦芽糖含量的影响如图12所示。糖化水解时间为16h时，麦芽糖含量达到最大，为54.1％，此时的水解率为73.3％。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

<110> 中国农业大学

<120> 一种米黑根毛霉α-淀粉酶及其编码基因与应用

<160> 2

<210> 1

<211> 1398

<212> DNA

<213> 米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）

<400> 1

1 atgaaattat cgatcgctct ttctgttgcc ttggtgtctg ctgctcttgc aagtgccaag

61 ccattgccac tcgctaagcg tgcaagtgcc gatgattgga aggacagagc tatctaccaa

121 ctccttaccg accgattcgc cagacccgat ggaagcactg atggttgttc caacctttca

181 agctactgcg gtggtggtta ccagggtatt atagacaaac tcgactacat taccggcatg

241 ggctttgatg ctatctggat ctctcctatc ccggccaact ctgctaatgg ttatcacggc

301 tactgggcta ccaactttga ggctctcaac gagaactttg gcagtgagga cgatctcaag

361 gcattgatct ctgctgcaca tgataaggga gtctatgtca tgctcgatgt cgttgccaac

421 catgctggtc ccaccgagaa tggagactac tctggataca cttttggcag cgctgacctc

481 taccatcctc aatgtactat tgactatggt agtcagacat ccatcgaaca gtgctgggtc

541 gctgatgtct tgcctgatat cgatactgag aatcaagaca acattgacaa gctcaacagc

601 attgtcagca actggatctc tacttatggc tttgacggta tccgtattga taccttcaag

661 catgtgcgca aggacttttg gcctggctat gtctctgcta gcggcgtctt tgcaaccggc

721 gaagtatttg acggcgatcc gagctacgtc ggaccttacc aagaagttgt agattcactc

781 atcaactacc ctctatacta tggcatcaac gacgtgtttg cttctggctc aggcttcagc

841 cgcatcagtg aactcttggc ttctaacaag gttgcattct ctgacgtctc ggtgctcact

901 aactttgtcg acaaccacga caaccctcga tttctgaaca aacagaatga tgtcgcacag

961 ttcaagaacg cgctcacatt tgtcctcttg gccgaaggta tccccatcgt gtactatggc

1021 tctgaacaag gcttcagcgg cggtgccgat cctgccaacc gtgaggtcct ctggacaact

1081 ggctttgata ccagcagcga cctttaccag ttcattgcca acgtcaacaa gaatgttcgt

1141 gtcaagagcg gcaagaatat taccatggat gttgccgtca atgataacac ttatgccttt

1201 atccatggct ccgcccttgt tgtcctcaac aattatggca gcggtgctag caactttgtc

1261 accatcagcg caggcggctt attctcggat ggagatactg tcatagatgt tatcagtaac

1321 attactgcaa ctgtttctgg tggaaacatt aatttcaaca tcaacaacgg tctccccgct

1381 attttccaga gagcttaa

<210> 2

<211> 465

<212> PRT

<213> 米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）

<400> 2

Met Lys Leu Ser Ile Ala Leu Ser Val Ala Leu Val Ser Ala Ala Leu

1 5 10 15

Ala Ser Ala Lys Pro Leu Pro Leu Ala Lys Arg Ala Ser Ala Asp Asp

20 25 30

Trp Lys Asp Arg Ala Ile Tyr Gln Leu Leu Thr Asp Arg Phe Ala Arg

35 40 45

Pro Asp Gly Ser Thr Asp Gly Cys Ser Asn Leu Ser Ser Tyr Cys Gly

50 55 60

Gly Gly Tyr Gln Gly Ile Ile Asp Lys Leu Asp Tyr Ile Thr Gly Met

65 70 75 80

Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile Pro Ala Asn Ser Ala Asn

85 90 95

Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asn Phe Glu Ala Leu Asn Glu Asn

100 105 110

Phe Gly Ser Glu Asp Asp Leu Lys Ala Leu Ile Ser Ala Ala His Asp

115 120 125

Lys Gly Val Tyr Val Met Leu Asp Val Val Ala Asn His Ala Gly Pro

130 135 140

Thr Glu Asn Gly Asp Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Ala Asp Leu

145 150 155 160

Tyr His Pro Gln Cys Thr Ile Asp Tyr Gly Ser Gln Thr Ser Ile Glu

165 170 175

Gln Cys Trp Val Ala Asp Val Leu Pro Asp Ile Asp Thr Glu Asn Gln

180 185 190

Asp Asn Ile Asp Lys Leu Asn Ser Ile Val Ser Asn Trp Ile Ser Thr

195 200 205

Tyr Gly Phe Asp Gly Ile Arg Ile Asp Thr Phe Lys His Val Arg Lys

210 215 220

Asp Phe Trp Pro Gly Tyr Val Ser Ala Ser Gly Val Phe Ala Thr Gly

225 230 235 240

Glu Val Phe Asp Gly Asp Pro Ser Tyr Val Gly Pro Tyr Gln Glu Val

245 250 255

Val Asp Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Leu Tyr Tyr Gly Ile Asn Asp Val

260 265 270

Phe Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser Arg Ile Ser Glu Leu Leu Ala Ser

275 280 285

Asn Lys Val Ala Phe Ser Asp Val Ser Val Leu Thr Asn Phe Val Asp

290 295 300

Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Asn Lys Gln Asn Asp Val Ala Gln

305 310 315 320

Phe Lys Asn Ala Leu Thr Phe Val Leu Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ile

325 330 335

Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Gly Phe Ser Gly Gly Ala Asp Pro Ala

340 345 350

Asn Arg Glu Val Leu Trp Thr Thr Gly Phe Asp Thr Ser Ser Asp Leu

355 360 365

Tyr Gln Phe Ile Ala Asn Val Asn Lys Asn Val Arg Val Lys Ser Gly

370 375 380

Lys Asn Ile Thr Met Asp Val Ala Val Asn Asp Asn Thr Tyr Ala Phe

385 390 395 400

Ile His Gly Ser Ala Leu Val Val Leu Asn Asn Tyr Gly Ser Gly Ala

405 410 415

Ser Asn Phe Val Thr Ile Ser Ala Gly Gly Leu Phe Ser Asp Gly Asp

420 425 430

Thr Val Ile Asp Val Ile Ser Asn Ile Thr Ala Thr Val Ser Gly Gly

435 440 445

Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asn Asn Gly Leu Pro Ala Ile Phe Gln Arg

450 455 460

Ala

465

Claims

1.一种α-淀粉酶，来源于米黑根毛霉CAU432，是以下1)或2)的蛋白质：

1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)序列表中序列2自氨基酸末端第20至465位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为DNA分子或RNA分子；所述DNA为cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述RNA为mRNA或hnRNA；

所述DNA分子为以下1)或2)的DNA分子：

1)序列表序列1所示的DNA分子；

2)序列表序列1的第58至1395位所示的DNA分子。

3.含有权利要求2所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。

4.如权利要求3所述的重组载体、表达盒或重组菌，其特征在于：所述重组载体为在载体pPIC9K的多克隆位点插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重组质粒pPIC9K-RmAmyA；

所述重组菌通过将所述重组载体导入宿主微生物中得到；

所述宿主微生物为巴斯德毕赤酵母GS115、细菌或藻类。

5.如权利要求1所述α-淀粉酶的生产方法，其特征在于：所述方法是将权利要求4所述重组菌进行发酵培养，得到所述的α-淀粉酶。

6.如权利要求1所述α-淀粉酶的应用，其特征在于：α-淀粉酶在面制品和麦芽糖生产中的应用。