CN111334489A - 比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体ga1、ga2、ga4及其基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明为比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体GA1、GA2、GA4及其基因和应用，涉及基因工程领域，具体涉及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体及其基因和应用。将葡萄糖淀粉酶TlGA1931的氨基酸序列的第132位氨基酸由Ser突变为Cys、第492位氨基酸由Tyr突变为Cys、第548位氨基酸由Leu突变为Cys、第562位氨基酸由Ala突变为Cys得到。本发明的突变体具有催化效率高、热稳定性好的优良性质，能够完全满足工业应用需求，可以很好的应用于食品、医药、纺织及饲料行业中，有着广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体GA1、GA2、GA4及其基因和应用。
背景技术
淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。淀粉酶家族包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。α-淀粉酶为内切酶，作用于淀粉分子内部的α-1，4糖苷键，生成糊精和低聚糖。β-淀粉酶为外切酶，它从淀粉非还原性顺次切下麦芽糖。而葡萄糖淀粉酶是一种作用于α-1，4糖苷键的外切酶，其系统名称为α-1,4-葡聚糖葡萄糖苷水解酶(α-1,4-glucan glucohydrolase,EC.3.2.1.3)或γ-淀粉酶(γ-amylase),简称糖化酶。糖化酶从非还原糖末端切下葡萄糖分子。葡萄糖淀粉酶底物专一性较低，即能够切断α-1,4-糖苷键，对α-1,6-糖苷键和α-1,3-糖苷键也有轻微的水解能力。葡萄糖淀粉酶是工业上用量最大的生物酶制剂之一，被广泛地应用于食品、医药和发酵等工业，是我国产量和用量最大的生物酶产品之一，具有很高的商业价值。
目前,能源短缺和环境污染极大限制了社会的发展进步，乙醇作为替代能源已逐步被人们所认识，被认为是解决上述问题的有效途径之一。目前通过淀粉生产乙醇的方法包括构建分泌葡萄糖淀粉酶的工程菌株。虽然国内外也有使用混合培养糖化和发酵菌株生产乙醇的发酵生产方式，但此工艺缺点在于菌株自身生长需要消耗大部分的淀粉底物，实际淀粉利用率和乙醇产率依然相当低。葡萄糖淀粉酶能够高效降解α-1,4、α-1,3、α-1,6-糖苷键，从淀粉非还原性末端释放葡萄糖,因此具有很高的商业价值。
糖化酶在工业生产中的应用非常广泛，在酒精工业中，糖化酶制剂可代替自制麸曲，简化生产工艺，提高生产效率，糖化酶在轻工、食品、医药、发酵等行业中具有广泛的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供葡萄糖淀粉酶突变体。
本发明的再一目的是提供上述葡萄糖淀粉酶突变体的编码基因。
本发明的再一目的是提供包含上述葡萄糖淀粉酶突变体基因的重组载体。
本发明的再一目的是提供包含上述葡萄糖淀粉酶突变体的重组菌株。
本发明的再一目的是提供一种制备葡萄糖淀粉酶突变体的方法。
本发明的再一目的是提供上述葡萄糖淀粉酶突变体的应用。
根据本发明的具体实施方式，本发明对氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示糖化酶TlGA1931进行定点突变获得一系列热稳定和比活提高的突变体。
SEQ IDNO:1所示：
根据本发明的具体实施方式，将葡萄糖淀粉酶TlGA1931的氨基酸序列的第132位氨基酸由Ser突变为Cys、第492位氨基酸由Tyr突变为Cys、第548位氨基酸由Leu突变为Cys、第562位氨基酸由Ala突变为Cys得到葡萄糖淀粉酶突变体GA1，将葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA1的氨基酸序列的第108位氨基酸由Gln突变为Glu得到葡萄糖淀粉酶突变体GA2，将葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA2的氨基酸序列的第468、469、470位氨基酸由Ala、Tyr、Ser突变为Asp和Pro得到葡萄糖淀粉酶突变体GA4。
根据本发明的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA1的氨基酸序列SEQ ID NO:2所示：
根据本发明的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示：
根据本发明的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA4的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示：
根据本发明的具体实施方式，野生型葡萄糖淀粉酶TlGA193的基因序列如SEQ IDNO.5所示：
根据本发明的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA1的基因序列如SEQ ID NO:6所示：
根据本发明的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA2的基因序列如SEQ ID NO:7所示：
根据本发明的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA4的基因序列如SEQ ID NO:8所示：
本发明提供了包含上述化葡萄糖淀粉酶TlGA1931突变体基因的重组载体。
本发明还提供了包含上述葡萄糖淀粉酶TlGA1931突变体基因的重组菌株，优选的菌株为毕赤酵母GS115，含葡萄糖淀粉酶突变体基因的重组菌株分别为重组赤酵母GS115/GA1，GS115/GA2，GS115/GA4。
根据本发明的具体实施方式，制备葡萄糖淀粉酶TlGA1931突变体的方法如下所述：
(1)用含有葡萄糖淀粉酶TlGA1931突变体基因的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
(2)培养重组菌株，诱导重组葡萄糖淀粉酶TlGA1931突变体表达；
(3)回收并纯化所表达的葡萄糖淀粉酶TlGA1931突变体。
本发明的有益效果：
葡萄糖淀粉酶突变体GA1的比活力为806U/mg、葡萄糖淀粉酶突变体GA2的比活力为1054U/mg、葡萄糖淀粉酶GA4突变体的比活力为1489U/mg，分别较野生型葡萄糖淀粉酶TlGA1931的比活力496U/mg分别提高62.5％、112％和200％，表明本发明的葡萄糖淀粉酶突变体在比活方面有较大幅度的提高。
70℃处理10min后野生型相对剩余酶活为14％，葡萄糖淀粉酶突变体GA1、GA2、GA4的剩余酶活分别为70％、90％、80％。75℃处理2min后野生型相对剩余酶活为13％，突变体GA1、GA2、GA4的剩余酶活分别为80％、95％、94％。且最适温度分别较野生型提高5℃、10℃、10℃。因此，本发明的葡萄糖淀粉酶突变体的热稳定获得明显提高。
从GA1到GA4，其比活力和热稳定性都有明显提升。本发明提供了多个葡萄糖淀粉酶突变体，具有催化效率高、热稳定性好的优良性质，能够完全满足工业应用需求，可以很好的应用于食品、医药、纺织及饲料行业中，有着广阔的应用前景。
附图说明
图1葡萄糖淀粉酶GA1至GA4的70℃热稳定性分析结果；
图2葡萄糖淀粉酶GA1至GA4的75℃热稳定性分析结果；
图3葡萄糖淀粉酶GA1至GA4的最适温度的分析结果。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)、毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115。
2、酶类及其它生化试剂：连接酶购自Invitrogen公司，定点突变试剂盒购自全式金公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
(1)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％NaCl，pH7.O)。
(2)BMGY培养基；1％酵母粉，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.000049<Biotin，1％甘油(v/v)。
(3)BMMY培养基：以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1葡萄糖淀粉酶的定点突变
以葡萄糖淀粉酶TlGA1931的质粒pPIC9-Tlga1931序列为模板，将葡萄糖淀粉酶TlGA1931的氨基酸序列的第132位碱基由Ser突变为Cys、第492位碱基由Tyr突变为Cys、第548位碱基由Leu突变为Cys、第562位碱基由Ala突变为Cys得到葡萄糖淀粉酶突变体GA1，将葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA1的氨基酸序列的第108位碱基由Gln突变为Glu得到葡萄糖淀粉酶突变体GA2，将葡萄糖淀粉酶TlGA1931的突变体GA2的氨基酸序列的第475位碱基由Ser突变为Ala得到葡萄糖淀粉酶突变体GA4。每轮定点突变的引物如下表所示：
表1本实验所需的引物
实施例2葡萄糖淀粉酶工程菌株的构建
(1)表达载体的构建及在酵母的表达
以葡萄糖淀粉酶重组质粒pPIC9-Tlga1931为模板，利用定点突变试剂扩增突变体。经核酸胶验证后，将PCR产物中加入1μL DMT酶，混匀后于37℃孵育1h。取2-5μL DMT酶消化的PCR产物，热击转化至感受态细胞DMT。挑取阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶Bgl II进行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母GS115感受态细胞，30℃培养2-3天，挑取在MD平板上生长的转化子进行进一步的表达实验，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。然后通过MM平板的显色反应筛选葡萄糖淀粉酶阳性克隆子菌株，依次为：GS115/GA1、GA2、GA4。
实施例3重组葡萄糖淀粉酶的制备
(1)葡萄糖淀粉酶在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达
筛选出酶活较高的转化子，接种于300mL BMGY液体培养基的1L三角瓶中，30℃，220rpm摇床振荡培养48h；4500rpm离心5min，弃上清，再向菌体加入200mL含有0.5％甲醇的BMMY液体培养基，30℃，220rpm诱导培养48h。诱导培养期间，间隔24h补加一次甲醇溶液以补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0.5％左右；12,000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。
(2)重组葡萄糖淀粉酶的纯化
收集摇瓶发酵培养的重组葡萄糖淀粉酶上清液，利用10kDa膜包进行发酵液的浓缩，同时用pH 6.3 10mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液置换其中的培养基，然后通过阴离子交换柱来进行纯化。
实施例4测定纯化的葡萄糖淀粉酶突变体的酶学性质
采用DNS法对本发明的葡萄糖淀粉酶进行活性分析。具体方法如下：在各突变体最适pH和温度的条件下(最适pH均为4.5，最适温度分别为GA1-70℃、GA2、GA4-75℃)，1mL的反应体系包括l00μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应30min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。葡萄糖淀粉酶活性单位定义：在对应最适温度、最适pH条件下，每分钟内催化水解底物释放出1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位(U)。
测定葡萄糖淀粉酶GA1、GA2、GA4三个突变体及本发明的各个突变体的酶活性和热稳定性：
1、测定葡萄糖淀粉酶GA1、GA2、GA4三个突变体的酶活性。将本发明的纯化的葡萄糖淀粉酶各个突变体在pH 4.5、70℃、75℃下进行酶促反应以测定其酶活性。
葡萄糖淀粉酶GA1的比活力为806U/mg、葡萄糖淀粉酶GA2的比活力为1054U/mg、葡萄糖淀粉酶GA4的比活力为1489U/mg，分别较野生型葡萄糖淀粉酶TlGA1931的比活力496U/mg分别提高：62.5％、112％和200％。
2、测定葡萄糖淀粉酶GA1、GA2、GA4三个突变体在70℃及75℃下的稳定性：
在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.3)缓冲液体系中，葡萄糖淀粉酶GA1、GA2、GA4分别于70℃下处理0、2、5、10、20、30、60min，75℃下处理0、2、5、10、20、30、60min，再在分别对应的最适温度测定相对剩余酶活。
如图1所示，70℃处理10min后野生型相对剩余酶活为14％，接近失活，改造后葡萄糖淀粉酶突变体GA1、GA2、GA4的剩余酶活分别为70％、90％、80％。
如图2所示，75℃处理2min后野生型相对剩余酶活为13％，接近失活，4改造后葡萄糖淀粉酶突变体GA1、GA2、GA4的剩余酶活分别为：80％、95％、94％。
3.测定的最适温度：
葡萄糖淀粉酶GA1、GA2、GA4三个突变体分别在20、30、40、50、55、60、65、70、80、85、90℃，pH 4.5的条件下测定其酶活性性。如图3所示，葡萄糖淀粉酶GA1、GA2、GA4的最适温度分别为70℃、75℃、75℃。
经测定葡萄糖淀粉酶GA1、GA2、GA4三个突变体的最适pH与pH稳定性与野生型基本一致。
序列表
<110> 山东隆科特酶制剂有限公司
<120> 比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体GA1、GA2 、GA4及其基因和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 613
<212> PRT
<213> 真菌(Talaromyces leycettanus JCM 12802)
<400> 1
Met Gln Tyr Leu Leu Lys Thr Thr Leu Gly Ala Leu Ser Val Ala Gln
1 5 10 15
Leu Val Ile Ala Ala Pro His Pro Thr Glu Leu Leu Pro Arg Ala Ser
20 25 30
Gly Ser Leu Asp Ser Trp Leu Ser Thr Glu Val Pro Tyr Ala Leu Asp
35 40 45
Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Lys Ala Gln Gly Ala
50 55 60
Ser Ser Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asn Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Phe Tyr Ser Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ile Lys Cys Leu Ile
85 90 95
Asp Glu Phe Ile Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Gln Ser Val Ile Gln
100 105 110
Asn Tyr Ile Ser Ser Gln Ala Phe Leu Gln Thr Val Ser Asn Pro Ser
115 120 125
Gly Gly Leu Ser Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Glu Val Asn
130 135 140
Glu Ala Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro
145 150 155 160
Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile Asn Tyr Ala Asn Trp Leu Ile Ala
165 170 175
Asn Gly Gln Ala Ser Leu Ala Asn Ser Ile Val Trp Pro Ile Val Gln
180 185 190
Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ser Gln Tyr Trp Asn Gln Ser Thr Phe Asp
195 200 205
Leu Trp Glu Glu Ile Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val Gln
210 215 220
His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser Ala Leu Ala Lys Lys Leu Gly His
225 230 235 240
Thr Cys Ser Asn Cys Asp Ser Gln Ala Pro Leu Val Leu Cys Phe Leu
245 250 255
Gln Ser Tyr Trp Thr Gly Ser Tyr Ile Leu Ser Asn Thr Gly Gly Gly
260 265 270
Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Ser Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe
275 280 285
Asp Pro Ala Ala Ala Gly Cys Asp Asp Thr Thr Phe Gln Pro Cys Ser
290 295 300
Ala Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg Ser
305 310 315 320
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325 330 335
Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Ala Trp Tyr Leu
340 345 350
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355 360 365
Asn Arg Ile Gly Ser Leu Thr Ile Thr Asp Val Ser Leu Ala Phe Phe
370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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Ser Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ala Ser Gly Pro Tyr Ala Thr Ala Thr
485 490 495
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500 505 510
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530 535 540
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545 550 555 560
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<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 613
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Gln Tyr Leu Leu Lys Thr Thr Leu Gly Ala Leu Ser Val Ala Gln
1 5 10 15
Leu Val Ile Ala Ala Pro His Pro Thr Glu Leu Leu Pro Arg Ala Ser
20 25 30
Gly Ser Leu Asp Ser Trp Leu Ser Thr Glu Val Pro Tyr Ala Leu Asp
35 40 45
Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Lys Ala Gln Gly Ala
50 55 60
Ser Ser Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asn Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Phe Tyr Ser Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ile Lys Cys Leu Ile
85 90 95
Asp Glu Phe Ile Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Glu Ser Val Ile Gln
100 105 110
Asn Tyr Ile Ser Ser Gln Ala Phe Leu Gln Thr Val Ser Asn Pro Ser
115 120 125
Gly Gly Leu Cys Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Glu Val Asn
130 135 140
Glu Ala Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro
145 150 155 160
Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile Asn Tyr Ala Asn Trp Leu Ile Ala
165 170 175
Asn Gly Gln Ala Ser Leu Ala Asn Ser Ile Val Trp Pro Ile Val Gln
180 185 190
Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ser Gln Tyr Trp Asn Gln Ser Thr Phe Asp
195 200 205
Leu Trp Glu Glu Ile Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val Gln
210 215 220
His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser Ala Leu Ala Lys Lys Leu Gly His
225 230 235 240
Thr Cys Ser Asn Cys Asp Ser Gln Ala Pro Leu Val Leu Cys Phe Leu
245 250 255
Gln Ser Tyr Trp Thr Gly Ser Tyr Ile Leu Ser Asn Thr Gly Gly Gly
260 265 270
Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Ser Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe
275 280 285
Asp Pro Ala Ala Ala Gly Cys Asp Asp Thr Thr Phe Gln Pro Cys Ser
290 295 300
Ala Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg Ser
305 310 315 320
Ile Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Pro Gln Gly Gln Ala Val Ala Val
325 330 335
Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Ala Trp Tyr Leu
340 345 350
Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp
355 360 365
Asn Arg Ile Gly Ser Leu Thr Ile Thr Asp Val Ser Leu Ala Phe Phe
370 375 380
Gln Asp Leu Tyr Pro Ser Ala Ala Thr Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser
385 390 395 400
Ser Thr Tyr Gln Ser Ile Val Ala Ala Val Lys Thr Tyr Ala Asp Gly
405 410 415
Tyr Met Ser Ile Val Gln Lys Tyr Thr Pro Ser Asn Gly Ala Leu Ala
420 425 430
Glu Gln Phe Ser Arg Asn Asp Gly Ser Pro Leu Ser Ala Val Asp Leu
435 440 445
Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ala Ala Arg Arg Asn Phe
450 455 460
Ser Val Pro Ala Tyr Ser Trp Gly Glu Ala Ser Ala Asn Thr Val Pro
465 470 475 480
Ser Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ala Ser Gly Pro Cys Ala Thr Ala Thr
485 490 495
Asn Thr Asn Trp Pro Ala Pro Thr Cys Thr Ser Pro Pro Ala Asn Val
500 505 510
Ala Val Arg Phe Asn Glu Met Val Thr Thr Asn Phe Gly Glu Asn Val
515 520 525
Phe Val Val Gly Ser Ile Ala Ala Leu Gly Ser Trp Ser Pro Ser Ser
530 535 540
Ala Ile Pro Cys Ser Ala Ala Glu Tyr Asn Ser Gln Thr Pro Leu Trp
545 550 555 560
Tyr Cys Ile Val Thr Leu Pro Ala Gly Thr Ser Phe Gln Tyr Lys Tyr
565 570 575
Ile Lys Lys Glu Pro Asp Gly Ser Val Val Trp Glu Ser Asp Pro Asn
580 585 590
Arg Ser Tyr Thr Val Pro Gln Gly Cys Gly Val Thr Thr Ala Thr Val
595 600 605
Asn Asp Ser Trp Arg
610
<210> 4
<211> 613
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Gln Tyr Leu Leu Lys Thr Thr Leu Gly Ala Leu Ser Val Ala Gln
1 5 10 15
Leu Val Ile Ala Ala Pro His Pro Thr Glu Leu Leu Pro Arg Ala Ser
20 25 30
Gly Ser Leu Asp Ser Trp Leu Ser Thr Glu Val Pro Tyr Ala Leu Asp
35 40 45
Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Lys Ala Gln Gly Ala
50 55 60
Ser Ser Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asn Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Phe Tyr Ser Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ile Lys Cys Leu Ile
85 90 95
Asp Glu Phe Ile Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Glu Ser Val Ile Gln
100 105 110
Asn Tyr Ile Ser Ser Gln Ala Phe Leu Gln Thr Val Ser Asn Pro Ser
115 120 125
Gly Gly Leu Cys Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Glu Val Asn
130 135 140
Glu Ala Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro
145 150 155 160
Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile Asn Tyr Ala Asn Trp Leu Ile Ala
165 170 175
Asn Gly Gln Ala Ser Leu Ala Asn Ser Ile Val Trp Pro Ile Val Gln
180 185 190
Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ser Gln Tyr Trp Asn Gln Ser Thr Phe Asp
195 200 205
Leu Trp Glu Glu Ile Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val Gln
210 215 220
His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser Ala Leu Ala Lys Lys Leu Gly His
225 230 235 240
Thr Cys Ser Asn Cys Asp Ser Gln Ala Pro Leu Val Leu Cys Phe Leu
245 250 255
Gln Ser Tyr Trp Thr Gly Ser Tyr Ile Leu Ser Asn Thr Gly Gly Gly
260 265 270
Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Ser Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe
275 280 285
Asp Pro Ala Ala Ala Gly Cys Asp Asp Thr Thr Phe Gln Pro Cys Ser
290 295 300
Ala Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg Ser
305 310 315 320
Ile Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Pro Gln Gly Gln Ala Val Ala Val
325 330 335
Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Ala Trp Tyr Leu
340 345 350
Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp
355 360 365
Asn Arg Ile Gly Ser Leu Thr Ile Thr Asp Val Ser Leu Ala Phe Phe
370 375 380
Gln Asp Leu Tyr Pro Ser Ala Ala Thr Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser
385 390 395 400
Ser Thr Tyr Gln Ser Ile Val Ala Ala Val Lys Thr Tyr Ala Asp Gly
405 410 415
Tyr Met Ser Ile Val Gln Lys Tyr Thr Pro Ser Asn Gly Ala Leu Ala
420 425 430
Glu Gln Phe Ser Arg Asn Asp Gly Ser Pro Leu Ser Ala Val Asp Leu
435 440 445
Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ala Ala Arg Arg Asn Phe
450 455 460
Ser Val Pro Ala Tyr Ser Trp Gly Glu Ala Ala Ala Asn Thr Val Pro
465 470 475 480
Ser Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ala Ser Gly Pro Cys Ala Thr Ala Thr
485 490 495
Asn Thr Asn Trp Pro Ala Pro Thr Cys Thr Ser Pro Pro Ala Asn Val
500 505 510
Ala Val Arg Phe Asn Glu Met Val Thr Thr Asn Phe Gly Glu Asn Val
515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Tyr Cys Ile Val Thr Leu Pro Ala Gly Thr Ser Phe Gln Tyr Lys Tyr
565 570 575
Ile Lys Lys Glu Pro Asp Gly Ser Val Val Trp Glu Ser Asp Pro Asn
580 585 590
Arg Ser Tyr Thr Val Pro Gln Gly Cys Gly Val Thr Thr Ala Thr Val
595 600 605
Asn Asp Ser Trp Arg
610
<210> 5
<211> 1842
<212> DNA
<213> 真菌(Talaromyces leycettanus JCM 12802)
<400> 5
atgcagtacc ttcttaaaac taccctcggc gctctgagcg ttgctcagct tgtcatcgcg 60
gcaccacatc ccacggaact tctccctcgg gcatcagggt ccctggattc atggctttcc 120
accgaagttc cttacgctct cgatggtgta ttgaacaaca tcggacccaa tggtgcaaag 180
gcccaggggg ccagctccgg cattgtggtt gcaagcccca gcacaagtaa tcctgactac 240
ttctactctt ggactcggga cgctgcgctc accatcaaat gcctgatcga tgagttcatc 300
tcgactgggg atgcgaacct gcagtcggtg attcagaact atatcagctc ccaggccttc 360
ttgcaaacag tgtccaaccc ctctggcggc ctgtcaactg gaggtctcgg cgagcccaag 420
tttgaggtca atgaggcggc atttactggt gcttggggcc ggccacaaag agatgggccg 480
gccttgagag cgactgccat gatcaattac gccaactggc ttattgcaaa tggacaggct 540
tcactcgcca attcgatcgt ctggccgatc gtccagaatg atctctccta cgtcagccag 600
tactggaatc agagtacctt tgacctttgg gaggaaatcg acagctcctc cttcttcacg 660
acggctgtgc agcaccgtgc tcttgttgag ggctctgctc tggcaaaaaa gcttggccat 720
acctgctcaa actgcgactc tcaagcaccg cttgtcttgt gtttcctgca atcctactgg 780
accggttcct atattctttc caacaccgga ggcggacgtt ccggaaagga cgccaactcc 840
ctacttggaa gtattcatac ttttgaccca gcagcggcgg gatgcgacga caccactttc 900
cagccttgct ctgcccgagc cctagcgaac cacaaggtcg tcaccgactc gttccgttca 960
atctactcaa tcaactcggg catcccacag ggccaagcag tcgccgtggg tcgctaccct 1020
gaagatgtat atcagggcgg aaacgcatgg tatctctgca ccctcgctgc tgcagagcag 1080
ctgtacgacg cactctatca gtggaacagg atcggatctc tcacgatcac ggacgtcagc 1140
ttggcattct tccaggatct ctacccatcg gcggcaacag gcacttattc ctcatcctcg 1200
tcgacctacc aatccatcgt tgccgctgtc aagacgtacg cggacggata catgagcatt 1260
gttcaaaaat acaccccttc caacggcgcc ctcgccgagc agttctcccg caacgatggc 1320
tcccccctct cagccgtcga cctaacctgg tcctacgcct ccctgctcac tgccgccgcg 1380
cgcagaaatt tctccgtccc cgcctactcc tggggcgaag ccagcgccaa caccgtccca 1440
tcgtcttgct cggcctcgtc tgcctcaggc ccctatgcca ccgcgaccaa cacgaactgg 1500
cccgcaccca catgcacctc gccaccggca aacgtggccg tccgattcaa cgagatggtc 1560
actaccaact ttggagagaa cgtctttgtc gtgggctcga tcgccgcgtt gggatcttgg 1620
agtcctagtt ccgctatccc gctgagcgcg gccgaataca actcacagac gccgttgtgg 1680
tatgcaatcg tgacgttgcc ggcgggcacg agcttccagt ataagtatat caagaaagag 1740
ccggatggca gtgtggtctg ggagagtgat ccgaacaggt cctatacggt gcctcaaggg 1800
tgtggcgtga cgactgcgac ggtgaatgat agttggaggt ag 1842
<210> 6
<211> 1842
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgcagtacc ttcttaaaac taccctcggc gctctgagcg ttgctcagct tgtcatcgcg 60
gcaccacatc ccacggaact tctccctcgg gcatcagggt ccctggattc atggctttcc 120
accgaagttc cttacgctct cgatggtgta ttgaacaaca tcggacccaa tggtgcaaag 180
gcccaggggg ccagctccgg cattgtggtt gcaagcccca gcacaagtaa tcctgactac 240
ttctactctt ggactcggga cgctgcgctc accatcaaat gcctgatcga tgagttcatc 300
tcgactgggg atgcgaacct gcagtcggtg attcagaact atatcagctc ccaggccttc 360
ttgcaaacag tgtccaaccc ctctggcggc ctgtgtactg gaggtctcgg cgagcccaag 420
tttgaggtca atgaggcggc atttactggt gcttggggcc ggccacaaag agatgggccg 480
gccttgagag cgactgccat gatcaattac gccaactggc ttattgcaaa tggacaggct 540
tcactcgcca attcgatcgt ctggccgatc gtccagaatg atctctccta cgtcagccag 600
tactggaatc agagtacctt tgacctttgg gaggaaatcg acagctcctc cttcttcacg 660
acggctgtgc agcaccgtgc tcttgttgag ggctctgctc tggcaaaaaa gcttggccat 720
acctgctcaa actgcgactc tcaagcaccg cttgtcttgt gtttcctgca atcctactgg 780
accggttcct atattctttc caacaccgga ggcggacgtt ccggaaagga cgccaactcc 840
ctacttggaa gtattcatac ttttgaccca gcagcggcgg gatgcgacga caccactttc 900
cagccttgct ctgcccgagc cctagcgaac cacaaggtcg tcaccgactc gttccgttca 960
atctactcaa tcaactcggg catcccacag ggccaagcag tcgccgtggg tcgctaccct 1020
gaagatgtat atcagggcgg aaacgcatgg tatctctgca ccctcgctgc tgcagagcag 1080
ctgtacgacg cactctatca gtggaacagg atcggatctc tcacgatcac ggacgtcagc 1140
ttggcattct tccaggatct ctacccatcg gcggcaacag gcacttattc ctcatcctcg 1200
tcgacctacc aatccatcgt tgccgctgtc aagacgtacg cggacggata catgagcatt 1260
gttcaaaaat acaccccttc caacggcgcc ctcgccgagc agttctcccg caacgatggc 1320
tcccccctct cagccgtcga cctaacctgg tcctacgcct ccctgctcac tgccgccgcg 1380
cgcagaaatt tctccgtccc cgcctactcc tggggcgaag ccagcgccaa caccgtccca 1440
tcgtcttgct cggcctcgtc tgcctcaggc ccctgtgcca ccgcgaccaa cacgaactgg 1500
cccgcaccca catgcacctc gccaccggca aacgtggccg tccgattcaa cgagatggtc 1560
actaccaact ttggagagaa cgtctttgtc gtgggctcga tcgccgcgtt gggatcttgg 1620
agtcctagtt ccgctatccc gtgtagcgcg gccgaataca actcacagac gccgttgtgg 1680
tattgtatcg tgacgttgcc ggcgggcacg agcttccagt ataagtatat caagaaagag 1740
ccggatggca gtgtggtctg ggagagtgat ccgaacaggt cctatacggt gcctcaaggg 1800
tgtggcgtga cgactgcgac ggtgaatgat agttggaggt ag 1842
<210> 7
<211> 1842
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgcagtacc ttcttaaaac taccctcggc gctctgagcg ttgctcagct tgtcatcgcg 60
gcaccacatc ccacggaact tctccctcgg gcatcagggt ccctggattc atggctttcc 120
accgaagttc cttacgctct cgatggtgta ttgaacaaca tcggacccaa tggtgcaaag 180
gcccaggggg ccagctccgg cattgtggtt gcaagcccca gcacaagtaa tcctgactac 240
ttctactctt ggactcggga cgctgcgctc accatcaaat gcctgatcga tgagttcatc 300
tcgactgggg atgcgaacct ggagtcggtg attcagaact atatcagctc ccaggccttc 360
ttgcaaacag tgtccaaccc ctctggcggc ctgtgtactg gaggtctcgg cgagcccaag 420
tttgaggtca atgaggcggc atttactggt gcttggggcc ggccacaaag agatgggccg 480
gccttgagag cgactgccat gatcaattac gccaactggc ttattgcaaa tggacaggct 540
tcactcgcca attcgatcgt ctggccgatc gtccagaatg atctctccta cgtcagccag 600
tactggaatc agagtacctt tgacctttgg gaggaaatcg acagctcctc cttcttcacg 660
acggctgtgc agcaccgtgc tcttgttgag ggctctgctc tggcaaaaaa gcttggccat 720
acctgctcaa actgcgactc tcaagcaccg cttgtcttgt gtttcctgca atcctactgg 780
accggttcct atattctttc caacaccgga ggcggacgtt ccggaaagga cgccaactcc 840
ctacttggaa gtattcatac ttttgaccca gcagcggcgg gatgcgacga caccactttc 900
cagccttgct ctgcccgagc cctagcgaac cacaaggtcg tcaccgactc gttccgttca 960
atctactcaa tcaactcggg catcccacag ggccaagcag tcgccgtggg tcgctaccct 1020
gaagatgtat atcagggcgg aaacgcatgg tatctctgca ccctcgctgc tgcagagcag 1080
ctgtacgacg cactctatca gtggaacagg atcggatctc tcacgatcac ggacgtcagc 1140
ttggcattct tccaggatct ctacccatcg gcggcaacag gcacttattc ctcatcctcg 1200
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tcccccctct cagccgtcga cctaacctgg tcctacgcct ccctgctcac tgccgccgcg 1380
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tcgtcttgct cggcctcgtc tgcctcaggc ccctgtgcca ccgcgaccaa cacgaactgg 1500
cccgcaccca catgcacctc gccaccggca aacgtggccg tccgattcaa cgagatggtc 1560
actaccaact ttggagagaa cgtctttgtc gtgggctcga tcgccgcgtt gggatcttgg 1620
agtcctagtt ccgctatccc gtgtagcgcg gccgaataca actcacagac gccgttgtgg 1680
tattgtatcg tgacgttgcc ggcgggcacg agcttccagt ataagtatat caagaaagag 1740
ccggatggca gtgtggtctg ggagagtgat ccgaacaggt cctatacggt gcctcaaggg 1800
tgtggcgtga cgactgcgac ggtgaatgat agttggaggt ag 1842
<210> 8
<211> 1842
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgcagtacc ttcttaaaac taccctcggc gctctgagcg ttgctcagct tgtcatcgcg 60
gcaccacatc ccacggaact tctccctcgg gcatcagggt ccctggattc atggctttcc 120
accgaagttc cttacgctct cgatggtgta ttgaacaaca tcggacccaa tggtgcaaag 180
gcccaggggg ccagctccgg cattgtggtt gcaagcccca gcacaagtaa tcctgactac 240
ttctactctt ggactcggga cgctgcgctc accatcaaat gcctgatcga tgagttcatc 300
tcgactgggg atgcgaacct ggagtcggtg attcagaact atatcagctc ccaggccttc 360
ttgcaaacag tgtccaaccc ctctggcggc ctgtgtactg gaggtctcgg cgagcccaag 420
tttgaggtca atgaggcggc atttactggt gcttggggcc ggccacaaag agatgggccg 480
gccttgagag cgactgccat gatcaattac gccaactggc ttattgcaaa tggacaggct 540
tcactcgcca attcgatcgt ctggccgatc gtccagaatg atctctccta cgtcagccag 600
tactggaatc agagtacctt tgacctttgg gaggaaatcg acagctcctc cttcttcacg 660
acggctgtgc agcaccgtgc tcttgttgag ggctctgctc tggcaaaaaa gcttggccat 720
acctgctcaa actgcgactc tcaagcaccg cttgtcttgt gtttcctgca atcctactgg 780
accggttcct atattctttc caacaccgga ggcggacgtt ccggaaagga cgccaactcc 840
ctacttggaa gtattcatac ttttgaccca gcagcggcgg gatgcgacga caccactttc 900
cagccttgct ctgcccgagc cctagcgaac cacaaggtcg tcaccgactc gttccgttca 960
atctactcaa tcaactcggg catcccacag ggccaagcag tcgccgtggg tcgctaccct 1020
gaagatgtat atcagggcgg aaacgcatgg tatctctgca ccctcgctgc tgcagagcag 1080
ctgtacgacg cactctatca gtggaacagg atcggatctc tcacgatcac ggacgtcagc 1140
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tcccccctct cagccgtcga cctaacctgg tcctacgcct ccctgctcac tgccgccgcg 1380
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cccgcaccca catgcacctc gccaccggca aacgtggccg tccgattcaa cgagatggtc 1560
actaccaact ttggagagaa cgtctttgtc gtgggctcga tcgccgcgtt gggatcttgg 1620
agtcctagtt ccgctatccc gtgtagcgcg gccgaataca actcacagac gccgttgtgg 1680
tattgtatcg tgacgttgcc ggcgggcacg agcttccagt ataagtatat caagaaagag 1740
ccggatggca gtgtggtctg ggagagtgat ccgaacaggt cctatacggt gcctcaaggg 1800
tgtggcgtga cgactgcgac ggtgaatgat agttggaggt ag 1842
Claims (9)
1.比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体GA1，其特征在于，其为将葡萄糖淀粉酶TlGA1931的氨基酸序列的第132位氨基酸由Ser突变为Cys、第492位氨基酸由Tyr突变为Cys、第548位氨基酸由Leu突变为Cys、第562位氨基酸由Ala突变为Cys得到，其中，所述葡萄糖淀粉酶TlGA1931的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体GA2，其特征在于，其为将权利要求1所述的比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体的氨基酸序列的第108位氨基酸由Gln突变为Glu得到。
3.比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体GA4，其特征在于，其为将权利要求2所述的比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体的氨基酸序列的第475位碱基由Ser突变为Ala得到。
4.葡萄糖淀粉酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1～3任一项所述的葡萄糖淀粉酶突变体。
5.根据权利要求4所述的葡萄糖淀粉酶突变体基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。
6.包含权利要求4所述的葡萄糖淀粉酶突变体基因的重组载体。
7.包含权利要求4所述的葡萄糖淀粉酶突变体基因的重组菌株。
8.制备比活及热稳定性提高的的葡萄糖淀粉酶突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用包含编码权利要求1～3任一项所述的比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体的基因的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
(2)培养重组菌株，诱导表达葡萄糖淀粉酶突变体；
(3)回收并纯化所表达的葡萄糖淀粉酶突变体。
9.权利要求1～3任一项所述的比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体的应用。
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|---|---|---|---|
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