CN116949016B - 葡萄糖淀粉酶ga51及其突变体和应用 - Google Patents
葡萄糖淀粉酶ga51及其突变体和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116949016B CN116949016B CN202311225491.5A CN202311225491A CN116949016B CN 116949016 B CN116949016 B CN 116949016B CN 202311225491 A CN202311225491 A CN 202311225491A CN 116949016 B CN116949016 B CN 116949016B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glucoamylase
- mutant
- specific activity
- enzyme
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 title claims abstract description 57
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 21
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 14
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 8
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 7
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 51
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 47
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 47
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 10
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 4
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 4
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CBMPTFJVXNIWHP-UHFFFAOYSA-L disodium;hydrogen phosphate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O CBMPTFJVXNIWHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000001139 pH measurement Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Chemical group 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Chemical group 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/20—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an exo-1,4 alpha-glucosidase, e.g. dextrose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01003—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
Abstract
本发明公开了葡萄糖淀粉酶GA51及其突变体和应用。本发明首先公开了葡萄糖淀粉酶GA51，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。本发明进一步将葡萄糖淀粉酶GA51进行突变获得催化效率显著提升的突变体；具体的，将氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的葡萄糖淀粉酶GA51分别进行A304S、G590S、A557S、L576T、I397V、N207A、A606S、D563N或D571S单位点突变获得了9个单位点突变体。酶活测定结果显示所有突变体的相对酶比活基本均为野生型的2倍以上，其中A557S相对酶比活最高，为葡萄糖淀粉酶GA51的2.88±0.03倍，突变体A557S的催化效率约为葡萄糖淀粉酶GA51的4.13倍。
Description
技术领域
本发明涉及葡萄糖淀粉酶及其突变体酶的突变体，尤其涉及葡萄糖淀粉酶GA51及其突变体和应用，属于葡萄糖淀粉酶及其应用领域。
背景技术
葡萄糖淀粉酶，简称糖化酶，系统命名为α-1,4-葡聚糖-葡萄糖水解酶（α-1,4-Glucan-glucohydrolase，EC.3.2.1.3），催化可溶性淀粉和相关低聚糖的非还原端的β-D-葡萄糖的释放。糖化酶广泛用于淀粉糖化、啤酒酿造、焙烤工业以及无害化处理秸秆等农业废弃物等。在双酶法制糖工艺中，糖化酶主要应用于糖化阶段。
为了配合第二步高温α-淀粉酶使用（95℃），通常需要提高葡萄糖淀粉酶的耐热性和催化效率，以提高效率和节约成本。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种葡萄糖淀粉酶GA51及其编码基因；
本发明的目的之二是将葡萄糖淀粉酶GA51进行突变获得突变体，所得到的突变体的催化效率相比野生型葡萄糖淀粉酶GA51有显著提升；
本发明的目的之三是提供葡萄糖淀粉酶GA51突变体的编码基因；
本发明的目的之四是提供含有葡萄糖淀粉酶GA51或其突变体的编码基因的重组表达载体以及含有该重组表达载体的重组宿主细胞。
本发明的目的之五是将所述的突变体应用于催化可溶性淀粉和相关低聚糖的非还原端的β-D-葡萄糖的释放。
本发明的上述目的主要是通过以下技术方案来实现的：
本发明的一方面是提供了一种葡萄糖淀粉酶GA51，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。
本发明所提供的葡萄糖淀粉酶GA51的酶比活为9.32±0.13U/mg，在55℃时酶比活为最高酶比活的60%，在60℃酶比活为迅速升高为最高酶比活的90%，65℃达到最高酶比活，之后70℃和55℃酶比活相近，80℃时酶比活降为最高酶比活的10%。当pH升为3.5时，酶比活达到最大，pH从3.5到5时，酶比活缓慢下降，pH为4时，酶比活为最高酶比活的50%，在pH为5.5时酶比活几乎降为0。
本发明的再一方面是提供了葡萄糖淀粉酶GA51的编码基因。
本发明的另一方面是将葡萄糖淀粉酶GA51进行突变获得催化效率显著提升的突变体。
具体的，本发明将氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的葡萄糖淀粉酶GA51分别进行A304S、G590S、A557S、L576T、I397V、N207A、A606S、D563N或D571S单位点突变获得了9个单位点突变体；优选的，SEQ ID No.1所示的葡萄糖淀粉酶GA51进行D571S、L576T、 A606S、A304S、G590S或A557S单位点突变所获得的单位点突变体。
酶活测定结果显示所有突变体的相对酶比活基本均为野生型的2倍以上，其中A557S相对酶比活最高，为野生型葡萄糖淀粉酶GA51的2.88±0.03倍。将GA51和突变体A557S纯化后进行动力学参数测定，结果表明突变体A557S的催化效率约为野生型葡萄糖淀粉酶GA51的4.13倍。
本发明所述氨基酸单位点突变“A557S”表示将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第557位氨基酸由丙氨酸（A）突变成丝氨酸（S）；其余的单位点突变的表述依此类推。
本发明中所述的9个单位点突变体的编码基因也属于本发明的保护范畴之内。
本发明的另一方面是提供了含有所述野生型葡萄糖淀粉酶GA51编码基因或其突变体的编码基因的重组表达载体或重组宿主细胞；其中，所述重组表达载体可以为重组原核表达载体或重组真核载体。
本发明的另一方面是提供制备葡萄糖淀粉酶GA51或其突变体的方法，包括：
（1）将葡萄糖淀粉酶GA51编码基因或葡萄糖淀粉酶GA51突变体编码基因可操作的与表达调控元件连接构建得到重组表达载体；
（2）将重组表达载体转化宿主细胞，培养宿主细胞，诱导表达重组蛋白，纯化，即得。
本发明的另一方面是本发明提供了野生型葡萄糖淀粉酶GA51或其突变体在催化可溶性淀粉或相关低聚糖的非还原端的β-D-葡萄糖的释放中的用途。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“突变”和“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
术语“转化”指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。
附图说明
图1 为葡萄糖淀粉酶GA51 SDS-PAGE蛋白电泳分析和酶比活测定结果；其中，A为葡萄糖淀粉酶GA51SDS-PAGE蛋白电泳分析，B为葡萄糖淀粉酶GA51酶比活测定结果。
图2 为葡萄糖淀粉酶GA51的酶学性能检测结果；其中，A为葡萄糖淀粉酶GA51的最适温度检测结果，B为葡萄糖淀粉酶GA51的最适pH测定结果。
图3 为葡萄糖淀粉酶GA51 SDS-PAGE蛋白电泳分析结果；注：M: Marker ；WT:GA51 ；1: A304S ；2:G590S ；3: A557S ；4: L576T ；5: I397V；6:N207A；7: A606S ；8:D563N； 9: D571S。
图4 为葡萄糖淀粉酶GA51突变体的相对酶比活测定结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 葡萄糖淀粉酶GA51基因的挖掘
利用生物信息学方法从UniParc数据库中直接挖掘得到糖化酶GA51，并将其构建到酵母表达载体Ppic9γ上，转化毕赤酵母进行异源表达。初筛实验中挑取100个克隆子，得到的粗酶液进行初步酶活测定，结果显示GA51的阳性率为59%。选取GA51酶活最高的转化子进行酵母复筛。对发酵液上清经过纯化浓缩后进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，如图1所示，GA51蛋白为单一条带，条带大小与理论值相符（图1 A），酶比活为9.32±0.13U/mg（图1 B）。
试验例1葡萄糖淀粉酶GA51的酶学性能检测试验
试验方法
为了更好了解葡萄糖淀粉酶GA51的温度和pH等酶学性质，本试验测定了葡萄糖淀粉酶GA51的最适pH和最适温度。
在55-70℃范围内，对定量后的糖化酶蛋白稀释一定倍数后，每隔5℃进行糖化酶酶活力的测定，以确定其最适反应温度，每个反应三个平行，以最适温度下酶比活定义为100%，其他温度下酶比活与最适温度下酶比活比值为相对酶比活，使用Graphpad Prism8.0对测定结果分析。
在pH3-5.5范围内，每隔0.5使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液进行糖化酶酶活力的测定，以确定其最适pH，每个反应三个平行，以最适pH下酶比活定义为100%，其他pH下酶比活与最适pH下酶比活比值为相对酶比活，使用Graphpad Prism8.0对测定结果分析。
试验结果
葡萄糖淀粉酶GA51的最适温度如图2 A所示，在55℃时酶比活为最高酶比活的60%，在60℃酶比活为迅速升高为最高酶比活的90%，65℃达到最高酶比活，之后70℃和55℃酶比活相近，80℃时酶比活降为最高酶比活的10%。
葡萄糖淀粉酶GA51的最适pH如图2B所示，在pH为3时酶比活几乎为0，当pH升为3.5时，酶比活达到最大，pH从3.5到5时，酶比活缓慢下降，pH为4时，酶比活为最高酶比活的50%，在pH为5.5时酶比活几乎降为0。
试验例2对葡萄糖淀粉酶GA51进行突变提高催化效率试验
利用本发明人实验室已有的提高糖苷水解酶催化效率的突变体设计模型MECE，对GA51进行理性设计。选择排名前9的突变体进行构建和酵母表达（表1）。
表1 基因突变位点
异源表达结果显示葡萄糖淀粉酶GA51及九个突变体蛋白为单一条带，条带大小与理论值相符（图3）。
试验例3 葡萄糖淀粉酶GA51及其突变体的催化效率检测试验
试验方法
对九个葡萄糖淀粉酶突变体蛋白定量后，在最适温度65℃和最适pH3.5条件下进行酶比活测定：
对纯蛋白用3,5-二硝基水杨酸溶液法（DNS法）测酶活。反应体系由2%可溶性淀粉和0.2M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液1:1混合为0.9 mL和0.1 mL 稀释的酶溶液组成。其中，将可溶性淀粉溶于水后煮沸10min进行糊化，0.2M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液由0.2M柠檬酸和0.4M磷酸氢二钠混合成相应的pH。在最适反应温度反应30min，加入1.5mLDNS终止反应，煮沸5min后置于冰水混合物中降温，于OD540nm下读值，每个反应三个平行。
将野生型葡萄糖淀粉酶GA51和突变体A557S纯化后在65℃、pH3.5下进行动力学参数测定：
在最适反应温度和最适pH条件下，将糖化酶稀释相应的倍数，在不同浓度的底物中测定酶活力。底物终浓度分别为0.2 mg/mL，0.3 mg/mL，0.5mg/mL，0.8 mg/mL，1 mg/mL，1.3 mg/mL，1.8mg/mL，2 mg/mL，2.5 mg/mL，3.5 mg/mL，5 mg/mL，7.5 mg/mL。使用双倒数作图法拟合米氏方程并得出K m、k cat和V max的数值。
试验结果
将野生型葡萄糖淀粉酶酶比活定为100%，试验数据显示所有葡萄糖淀粉酶突变体的相对酶比活基本均为野生型葡萄糖淀粉酶的2倍以上，其中突变体A557S相对酶比活最高，为野生型葡萄糖淀粉酶的2.88±0.03倍（图4）。
表2葡萄糖淀粉酶GA51和突变体A557S动力学参数测定
动力学参数测定结果表明突变体A557S的催化效率约为野生型葡萄糖淀粉酶GA51的4.13倍。
Claims (8)
1.葡萄糖淀粉酶GA51的突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列为SEQ IDNo.1所示的葡萄糖淀粉酶GA51分别进行A304S、G590S、A557S、L576T、I397V、N207A、A606S、D563N或D571S单位点突变所获得的单位点突变体。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列为SEQ IDNo.1所示的葡萄糖淀粉酶GA51进行D571S、L576T、 A606S、A304S、G590S或A557S单位点突变所获得的单位点突变体。
3.权利要求1所述的突变体的编码基因。
4.含有权利要求3所述的编码基因的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体是重组原核表达载体或重组真核载体。
6.权利要求3所述的编码基因在制备重组葡萄糖淀粉酶中的用途。
7.一种制备权利要求1所述的突变体的方法，其特征在于，包括：
（1）将权利要求1所述的突变体的编码基因可操作的与表达调控元件连接构建得到重组表达载体；
（2）将重组表达载体转化宿主细胞，培养宿主细胞，诱导表达重组蛋白，纯化，即得。
8.权利要求1所述的突变体在催化可溶性淀粉的非还原端的β-D-葡萄糖的释放中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311225491.5A CN116949016B (zh) | 2023-09-21 | 2023-09-21 | 葡萄糖淀粉酶ga51及其突变体和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311225491.5A CN116949016B (zh) | 2023-09-21 | 2023-09-21 | 葡萄糖淀粉酶ga51及其突变体和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116949016A CN116949016A (zh) | 2023-10-27 |
| CN116949016B true CN116949016B (zh) | 2023-12-12 |
Family
ID=88453335
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311225491.5A Active CN116949016B (zh) | 2023-09-21 | 2023-09-21 | 葡萄糖淀粉酶ga51及其突变体和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116949016B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104388449A (zh) * | 2003-03-06 | 2015-03-04 | 维莱尼姆公司 | 淀粉酶、编码它们的核酸及其制备和应用方法 |
| CN111334489A (zh) * | 2020-02-29 | 2020-06-26 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体ga1、ga2、ga4及其基因和应用 |
| CN111471666A (zh) * | 2020-02-29 | 2020-07-31 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体ga3及其基因和应用 |
| CN113755473A (zh) * | 2021-11-09 | 2021-12-07 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 分泌表达量提高的葡萄糖淀粉酶突变体m5及其基因和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6473339B2 (ja) * | 2015-02-05 | 2019-02-20 | 本田技研工業株式会社 | 麹菌変異株及び形質転換体 |
-
2023
- 2023-09-21 CN CN202311225491.5A patent/CN116949016B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104388449A (zh) * | 2003-03-06 | 2015-03-04 | 维莱尼姆公司 | 淀粉酶、编码它们的核酸及其制备和应用方法 |
| CN111334489A (zh) * | 2020-02-29 | 2020-06-26 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体ga1、ga2、ga4及其基因和应用 |
| CN111471666A (zh) * | 2020-02-29 | 2020-07-31 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体ga3及其基因和应用 |
| CN113755473A (zh) * | 2021-11-09 | 2021-12-07 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 分泌表达量提高的葡萄糖淀粉酶突变体m5及其基因和应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| comparative genomic analysis of the thermophilic biomass-degrading fungi Myceliophthora thermophila and Thielavia terrestris;Randy M Berka等;《nature biotechnology》;第29卷(第10期);第922-929页 * |
| OUUZ01000018.1.GenBank.2019,第1-3页. * |
| SPQ26555.1.GenBank.2019,第1页. * |
| 微生物GH13家族淀粉脱支酶研究进展;段绪果等;《微生物学报》;第53卷(第07期);第648-656页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116949016A (zh) | 2023-10-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11332728B2 (en) | Yeast strains for the expression and secretion of heterologous proteins at high temperatures | |
| RU2007124552A (ru) | Глюкоамилаза trichoderma reesei и ее гомологи | |
| CN109385413B (zh) | 葡萄糖淀粉酶TlGA1931及其基因和应用 | |
| CN111676210B (zh) | 一种提高纤维素酶活性的方法及纤维素酶突变体5i77-m和应用 | |
| CN111471666A (zh) | 比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体ga3及其基因和应用 | |
| CN113684198B (zh) | 一种提高纤维素酶催化效率的方法及突变体5i77-m2 | |
| CN113846074A (zh) | 一种疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体g91c及其应用 | |
| CN114107262A (zh) | 一种高比活木聚糖酶突变体及其应用 | |
| CN112301012B (zh) | 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其构建方法 | |
| CN116949016B (zh) | 葡萄糖淀粉酶ga51及其突变体和应用 | |
| CN111676209A (zh) | 一种提高双功能纤维素酶的甘露聚糖酶活的方法及纤维素酶突变体rmx-m和应用 | |
| CN113755473B (zh) | 分泌表达量提高的葡萄糖淀粉酶突变体m5及其基因和应用 | |
| CN114381448B (zh) | 一种葡聚糖酶突变体及其应用 | |
| Wong et al. | Chromosomal integration of both an α-amylase and a glucoamylase gene in Saccharomyces cerevisiae for starch conversion | |
| CN103667212B (zh) | 一种糖化酶及其应用 | |
| CN113774045B (zh) | 分泌表达量提高的葡萄糖淀粉酶突变体m3及其基因和应用 | |
| CN102676476B (zh) | 酶活性及热稳定性被提高的葡聚糖酶 | |
| CN105907737B (zh) | 一种高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体及其编码基因和应用 | |
| CN113528491B (zh) | 一种n-糖基化修饰提高黑曲霉木聚糖酶热稳定性的方法 | |
| CN114517191B (zh) | 热稳定性提升的酸性葡聚糖酶突变体及其应用 | |
| CN102719463B (zh) | 一种生产重组混合l-阿拉伯糖异构酶的方法 | |
| CN112210544B (zh) | 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用 | |
| CN114854724B (zh) | 一组gh10家族木聚糖酶的n-糖基化突变体及其应用 | |
| CN111621486B (zh) | 一种低温下高酶活的耐热木聚糖酶xynb及其突变体基因、应用和基因序列制备方法 | |
| CN113528487B (zh) | 一种通过迭代饱和突变提高木聚糖酶热稳定性的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |