CN113684198B

CN113684198B - 一种提高纤维素酶催化效率的方法及突变体5i77-m2

Info

Publication number: CN113684198B
Application number: CN202111251317.9A
Authority: CN
Inventors: 罗会颖; 郑洁; 秦星; 黄火清; 王亚茹; 王晓璐; 王苑; 苏小运; 柏映国; 涂涛; 张�杰; 张红莲; 于会民; 姚斌
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2021-10-27
Filing date: 2021-10-27
Publication date: 2022-02-25
Anticipated expiration: 2041-10-27
Also published as: CN113684198A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种提高纤维素酶催化效率的方法及突变体5I77‑M2。所述方法包括将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型纤维素酶的第300位的氨基酸Thr突变为氨基酸Pro和将第307位点的氨基酸Asp突变为氨基酸Pro、以及第193位的氨基酸Asn突变为Ala的步骤。酶促反应的最适pH值、最适温度并未发生变化；以羧甲基纤维素钠为底物时，本发明的突变体5i77‑M2的比活力比突变体5I77‑M提高了50%。

Description

一种提高纤维素酶催化效率的方法及突变体5I77-M2

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种提高纤维素酶催化效率的方法及突变体5I77-M2。

背景技术

纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，是地球上最丰富的有机物，也是现今最大量的可再生性生物质资源。纤维素可以转化成葡萄糖或者其他可发酵糖，进而转化成生物燃料或其他产品，近年来受到极大的关注。在现有的纤维素转化技术中，纤维素酶被认为是关键因素，也逐渐成为研究的热点之一。

纤维素酶是一类可以将纤维素降解成纤维寡糖或葡萄糖的水解酶，可以水解β-1,4-葡萄糖苷键，即纤维素分子中连接葡萄糖单位的化学键。根据现有研究，自然界中绝大部分纤维素的降解转化是由真菌和细菌完成的，这些微生物通过产生一系列的纤维素酶系统发展出了多种在胞外高效降解天然结晶纤维素的机制。

催化活性作为衡量酶工业化应用价值的重要指标，一直以来被广泛关注。虽然目前已经公开以下酶突变策略，但是由于对于酶的氨基酸序列与功能之间的研究还很有限，依据酶突变策略设计的突变方案难以获得预期的技术效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高纤维素酶催化效率的方法。

本发明的再一目的是提供催化效率提高的纤维素酶突变体5i77-M2。

本申请的再一目的是提供上述催化效率提高的纤维素酶突变体5i77-M2的编码基因。

本申请的再一目的是提供上述催化效率提高的纤维素酶突变体5i77-M2的应用。

根据本发明的提高纤维素酶催化效率的方法包括将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型纤维素酶进行定点突变的步骤，其中，将野生型纤维素酶的第300位的氨基酸Thr突变为氨基酸Pro、将第307位点的氨基酸Asp突变为氨基酸Pro，将第193位的氨基酸Asn突变为Ala。

根据本申请之前的研究，已经将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型纤维素酶进行定点，将野生型纤维素酶的第300位的氨基酸Thr突变为氨基酸Pro、将第307位点的氨基酸Asp突变为氨基酸Pro得到突变体5I77-M。结果表明，与野生型纤维素酶相比，突变体5I77-M的最适pH值、最适温度并未发生变化，而以羧甲基纤维素钠为底物时，突变体5I77-M的比活力比野生型提高了约50%。

在此基础上，本申请进一步第193位的氨基酸Asn突变为Ala。

根据本发明的催化效率提高的纤维素酶突变体5i77-M2，其氨基酸序列SEQ IDNO：2所示。

本发明提供了编码上述催化效率提高的纤维素酶突变体5i77-M2的基因。具体地，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供了包含上述编码催化效率提高的纤维素酶突变体5i77-M2的基因的重组载体。

本发明还提供了包含上述编码催化效率提高的纤维素酶突变体5i77-M2的基因的重组菌株。

本发明还是提供一种制备催化效率提高的纤维素酶突变体的方法，包括以下步骤：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；

3）回收并纯化所表达的催化效率提高的纤维素酶突变体。

根据本发明的具体实施方式，将含有突变体基因的重组载体转化毕赤酵母GS115，通过对小管水平的发酵液进行酶活测定初步筛选阳性转化子。对酶活最高的转化子进行大瓶诱导，并对粗酶液进行蛋白浓缩及纯化。利用SDS-PAGE电泳检测纯化后突变体和野生型的纯度。以纯化后的蛋白为对象，利用DNS法测定野生型与突变体的基本酶学性质。结果表明，酶促反应的最适pH值、最适温度并未发生变化；以羧甲基纤维素钠为底物时，本发明的突变体5i77-M2的比活力比突变体5I77-M提高了50%。

附图说明

图1显示纤维素酶突变体5I77-M与5I77-M2的最适pH；

图2显示纤维素酶突变体5I77-M与5I77-M2的最适温度。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：表达宿主Pichiapastoris GS115，表达质粒载体pPIC9r。

2、生化试剂：限制性内切酶购自NEB公司，连接酶购自Promaga公司，点突变试剂盒购自全式金公司，羧甲基纤维素钠购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

LB培养基：0.5% 酵母提取物，1% 蛋白胨，1% NaCl， pH 7.0

YPD培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖

MD固体培养基：2% 葡萄糖，1.5% 琼脂糖，1.34% YNB，0.00004% Biotin

BMGY培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，1% 甘油(V/V)，1.34% YNB，0.00004%Biotin。

BMMY培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，1.34%YNB，0.00004% Biotin，0.5%甲醇(V/V)。

4、本实施例中未做详细具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1催化活性提高的纤维素酶突变体重组载体pPIC9r-5I77-M的制备5i77-M2

将纤维素酶野生型（突变前）序列片段（去除信号肽）克隆到表达载体pPIC-9r上，重组载体命名pPIC9r-5I77；以重组载体pPIC9r-5I77为模板，通过携带突变位点的引物对其进行扩增，获得携带突变体序列的重组载体，命名为pPIC9r-5I77-M2。

表1. 催化活性提高的纤维素酶突变体5I77-M2特异性引物

实施例2纤维素酶突变体的制备。

（1）纤维素酶突变体5I77-M2在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达。

将获得的含有突变体基因5I77-M2的重组质粒pPIC9r-5I77-M2转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115/5I77-M2。取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300 mLBMGY培养基的1 L三角瓶中，置于30 ℃，220 rpm摇床培养48 h；培养液4000 g离心5 min，弃上清，沉淀用200 mL含有0.5%甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30 ℃，220 rpm条件下诱导培养。每隔12 h补加1 mL甲醇，同时取上清用于酶活性检测。

（2）重组蛋白酶的纯化

收集摇瓶表达的重组纤维素酶上清液，通过10 kDa膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，最后剩余约20 ml蛋白浓缩液。浓缩到一定倍数的重组纤维素酶5I77-M2，利用离子交换层析法进行纯化。具体地，取纤维素酶5I77及突变体5I77-M2浓缩液10.0 mL经预先用10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)平衡过的HiTrap Q HP阴离子柱，然后用含有1 mol/L NaCl的10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)进行线性梯度洗脱，利用DNS法对梯度洗脱的蛋白液进行酶活性检测，同时利用SDS-PAGE凝胶电泳对梯度洗脱的蛋白液进行纯度的检测。

实施例3 重组催化活性提高的纤维素酶突变体的活性分析

采用二硝基水杨酸(DNS) 法测定重组内切纤维素酶的基本酶学性质。具体方法如下：在pH 4.0，75 ℃条件下，1 mL的反应体系包括100 µL适当的稀释酶液，900 µL底物，反应10 min，加入1.5 mL DNS终止反应；沸水浴煮5 min后冷却至室温，在540 nm波长下测定OD值。内切纤维素酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解底物生成1 μmoL 葡萄糖所需要的酶量为1个活性单位(U)。酶学性质研究所用酶液均需达到电泳纯。

（1）最适pH分析比较

经纯化的(实施例2)表达的纤维素酶5I77及突变体5I77-M2在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH2.0-7.0的柠檬酸一磷酸氢二钠系列缓冲体系。纯化的纤维素酶5I77及突变体5I77-M2在不同pH的缓冲体系、75 ℃下测定的最适pH结果（图1）表明：5I77和5I77-M2的最适pH均为4.0。

（2）最适温度分析比较

纯化的内切纤维素酶在pH 4.0（以羧甲基纤维素钠为底物）条件下，测定不同温度（30-80℃）下的酶活性，以确定重组酶最适温度。实验结果表明，野生纤维素酶5I77和突变体5I77-M2的最适反应温度为75℃，在80℃时依然具有50%以上的酶活力（图2）。

（3）催化效率分析比较

纯化后（实施例2）的纤维素酶突变体5I77-M2，与野生型纤维素酶另一突变体5I77-M在pH4.0，75℃件下进行酶促反应以测定其酶活性及动力学参数，其中，将本发明的野生型纤维素酶的第300位的氨基酸Thr突变为氨基酸Pro、将第307位点的氨基酸Asp突变为氨基酸Pro得到突变体5I77-M。

比活测定结果如表2所示，突变体5I77-M的比活为2313±39 U/mg，突变体5I77-M2的比活为3472±42 U/mg。相较于5I77-M，5I77-M2的Km值变化不大，5I77-M的K _m值为6.51±0.4 mg/ml，突变体5I77-M2的Km值为6.56±0.4 mg/ml。但是V _max值变化明显，V _max5I77-M为3029±103 μmol/min/mg，突变体5I77-M2提高至5084±156μmol/min/mg。转换数由1766±76 S^-1提高至2965±81 S^-1，最终k _cat/K _m由271±36提高至451±43 ml/s/mg。由上述数据可知，V _max的提高导致了突变体5I77-M2催化效率的进一步提高。

表2

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种提高纤维素酶催化效率的方法及突变体5I77-M2

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 313

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Pro His Gly Ser Gly His Lys Lys Arg Ala Ser Val Phe Glu Trp

1 5 10 15

Phe Gly Ser Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Thr Asn Ile Pro Gly

20 25 30

Val Trp Gly Thr Asp Tyr Ile Phe Pro Asp Pro Ser Thr Ile Ser Thr

35 40 45

Leu Ile Gly Lys Gly Met Asn Phe Phe Arg Val Gln Phe Met Met Glu

50 55 60

Arg Leu Leu Pro Asp Ser Met Thr Gly Ser Tyr Asp Glu Glu Tyr Leu

65 70 75 80

Ala Asn Leu Thr Thr Val Val Lys Ala Val Thr Asp Gly Gly Ala His

85 90 95

Ala Leu Ile Asp Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr Asn Gly Glu Ile Ile

100 105 110

Ser Ser Thr Ser Asp Phe Gln Thr Phe Trp Gln Asn Leu Ala Gly Gln

115 120 125

Tyr Lys Asp Asn Asp Leu Val Met Phe Asp Thr Asn Asn Glu Tyr Tyr

130 135 140

Asp Met Asp Gln Asp Leu Val Leu Asn Leu Asn Gln Ala Ala Ile Asn

145 150 155 160

Gly Ile Arg Ala Ala Gly Ala Ser Gln Tyr Ile Phe Val Glu Gly Asn

165 170 175

Ser Trp Thr Gly Ala Trp Thr Trp Val Asp Val Asn Asp Asn Met Lys

180 185 190

Asn Leu Thr Asp Pro Glu Asp Lys Ile Val Tyr Glu Met His Gln Tyr

195 200 205

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr Ser Glu Thr Cys Val Ser Gly Thr

210 215 220

Ile Gly Lys Glu Arg Ile Thr Asp Ala Thr Gln Trp Leu Lys Asp Asn

225 230 235 240

Lys Lys Val Gly Phe Ile Gly Glu Tyr Ala Gly Gly Ser Asn Asp Val

245 250 255

Cys Arg Ser Ala Val Ser Gly Met Leu Glu Tyr Met Ala Asn Asn Thr

260 265 270

Asp Val Trp Lys Gly Ala Ser Trp Trp Ala Ala Gly Pro Trp Trp Gly

275 280 285

Asp Tyr Ile Phe Ser Leu Glu Pro Pro Asp Gly Thr Ala Tyr Thr Gly

290 295 300

Met Leu Asp Ile Leu Glu Thr Tyr Leu

305 310

<210> 2

<211> 313

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Val Pro His Gly Ser Gly His Lys Lys Arg Ala Ser Val Phe Glu Trp

1 5 10 15

Phe Gly Ser Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Thr Asn Ile Pro Gly

20 25 30

Val Trp Gly Thr Asp Tyr Ile Phe Pro Asp Pro Ser Thr Ile Ser Thr

35 40 45

Leu Ile Gly Lys Gly Met Asn Phe Phe Arg Val Gln Phe Met Met Glu

50 55 60

Arg Leu Leu Pro Asp Ser Met Thr Gly Ser Tyr Asp Glu Glu Tyr Leu

65 70 75 80

Ala Asn Leu Thr Thr Val Val Lys Ala Val Thr Asp Gly Gly Ala His

85 90 95

Ala Leu Ile Asp Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr Asn Gly Glu Ile Ile

100 105 110

Ser Ser Thr Ser Asp Phe Gln Thr Phe Trp Gln Asn Leu Ala Gly Gln

115 120 125

Tyr Lys Asp Asn Asp Leu Val Met Phe Asp Thr Asn Asn Glu Tyr Tyr

130 135 140

Asp Met Asp Gln Asp Leu Val Leu Asn Leu Asn Gln Ala Ala Ile Asn

145 150 155 160

Gly Ile Arg Ala Ala Gly Ala Ser Gln Tyr Ile Phe Val Glu Gly Asn

165 170 175

Ser Trp Thr Gly Ala Trp Thr Trp Val Asp Val Asn Asp Asn Met Lys

180 185 190

Ala Leu Thr Asp Pro Glu Asp Lys Ile Val Tyr Glu Met His Gln Tyr

195 200 205

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr Ser Glu Thr Cys Val Ser Gly Thr

210 215 220

Ile Gly Lys Glu Arg Ile Thr Asp Ala Thr Gln Trp Leu Lys Asp Asn

225 230 235 240

Lys Lys Val Gly Phe Ile Gly Glu Tyr Ala Gly Gly Ser Asn Asp Val

245 250 255

Cys Arg Ser Ala Val Ser Gly Met Leu Glu Tyr Met Ala Asn Asn Thr

260 265 270

Asp Val Trp Lys Gly Ala Ser Trp Trp Ala Ala Gly Pro Trp Trp Gly

275 280 285

Asp Tyr Ile Phe Ser Leu Glu Pro Pro Asp Gly Pro Ala Tyr Thr Gly

290 295 300

Met Leu Pro Ile Leu Glu Thr Tyr Leu

305 310

<210> 3

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gttccacatg gttccggtca taagaagagg gcttccgttt ttgaatggtt cggttctaac 60

gaatccggtg ccgagttcgg aactaacatt ccaggtgttt ggggtactga ctacatcttc 120

ccagatccat ccactatctc caccttgatc ggtaagggta tgaacttctt cagggtccag 180

ttcatgatgg aaagattgct gccagactcc atgactggtt cttacgacga agagtacttg 240

gccaacttga ccactgttgt taaggctgtt actgacggtg gtgctcacgc tttgattgat 300

ccacataact acggtagata caacggcgag attatctcct ccacttccga cttccaaacc 360

ttctggcaaa acttggctgg tcagtacaag gacaacgact tggttatgtt cgacaccaac 420

aacgagtact acgacatgga ccaggacttg gtcttgaact tgaaccaggc tgctatcaac 480

ggtatcagag ctgctggtgc ttcccagtac attttcgttg aaggtaactc ctggactggt 540

gcttggactt gggttgatgt taacgacaac atgaaggccc tgactgaccc agaggacaag 600

atcgtttacg agatgcacca atacttggac tctgacggtt ctggtacttc cgagacttgt 660

gtttccggta ctatcggtaa agagagaatc actgacgcta cccagtggct gaaggacaac 720

aagaaagttg gtttcatcgg tgagtacgcc ggtggatcta acgatgtctg tagatccgct 780

gtctctggta tgttggagta catggctaac aacaccgacg tttggaaggg tgcttcttgg 840

tgggctgctg gtccttggtg gggtgattac attttctcat tggaaccacc agacggtcca 900

gcctacactg gtatgctgcc aattttggag acttacctt 939

Claims

1.一种提高纤维素酶的催化效率的方法，其特征在于，所述方法包括将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型纤维素酶的第300位的氨基酸Thr突变为氨基酸Pro、将第307位点的氨基酸Asp突变为氨基酸Pro、以及第193位的氨基酸Asn突变为Ala的步骤。

2.一种催化效率提高的纤维素酶突变体5I77-M2，其特征在于，所述纤维素酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.编码权利要求2所述催化效率提高的纤维素酶突变体5I77-M2的基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

5.包含权利要求3所述基因的重组表达载体。

6.包含权利要求3所述基因的重组菌株。

7.一种制备催化效率提高的纤维素酶突变体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

以包含权利要求3所述基因的重组表达载体转化宿主菌株；

诱导重组菌株表达纤维素酶突变体；

分离纯化获得所述催化效率提高的纤维素酶突变体。

8.权利要求2所述催化效率提高的纤维素酶突变体5I77-M2用于水解纤维素的应用。