CN113699137A - 一种黄芪甲苷木糖苷酶突变体及其应用 - Google Patents

一种黄芪甲苷木糖苷酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域。本发明提供了一种黄芪甲苷木糖苷酶突变体及其应用，所述突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列突变得到；所述突变的位点包括第202位、第322位、第372和第548位中的一种或多种。本发明中的黄芪甲苷木糖苷酶突变体通过4个位点的单点突变或组合突变，能够显著提高酶水解黄芪甲苷C3位置木糖苷键的水解活性，相较于野生型黄芪甲苷木糖苷酶，对底物黄芪甲苷的催化活性提高了1～20倍，大幅降低环黄芪醇工业生产的成本，使酶催化黄芪甲苷制备环黄芪醇的生产效率显著提高。

Description

一种黄芪甲苷木糖苷酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种黄芪甲苷木糖苷酶突变体及其应用。
背景技术
环黄芪醇是一种四环三萜类化合物，其分子式为C30H50O5(490.71)，是一种无色针状结晶。研究表明，环黄芪醇是一种有效的端粒酶激活剂，能够通过激活端粒酶来延长端粒，从而达到抵抗衰老，提高细胞增殖能力的效果。随着全球老龄化问题的日益严重，现代农业发展、生产力供给以及卫生医疗保障体系都遭受了重大冲击和影响。因此，环黄芪醇的高效制备成为研究热点。
环黄芪醇在天然植物中主要以黄芪甲苷形式存在，而游离的环黄芪醇含量极少。通过水解去掉黄芪甲苷C3位置的木糖和C6位置的葡萄糖即可实现环黄芪醇的生产。
传统酸法水解黄芪甲苷制备环黄芪醇会产生大量高污染性的废水，不仅如此，在强酸和高温的条件下会产生副产物黄芪醇，后者与产物环黄芪醇难以分离，且资源利用率低。虽然，通过增加氧化还原步骤可有效避免黄芪醇的产生，然而步骤复杂，工业应用前景不足。酶催化法水解黄芪甲苷制备环黄芪醇具有催化效率高、特异性高、反应条件温和、环境友好等优势，然而现有的黄芪甲苷木糖苷键水解酶活性有限。如何提高酶的性能，从而提高环黄芪醇的生产效率，成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄芪甲苷木糖苷酶突变体及其应用，降低环黄芪醇工业生产的成本，使酶催化黄芪甲苷制备环黄芪醇的生产效率显著提高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种黄芪甲苷木糖苷酶突变体，所述突变体的氨基酸序列是由SEQID NO：1所示的氨基酸序列突变得到；所述突变的位点包括第202位、第322位、第372和第548位中的一种或多种。
作为优选，所述第202位的突变为：由色氨酸突变为甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸或丝氨酸。
作为优选，所述第322位的突变为：由组氨酸突变为甘氨酸或丙氨酸。
作为优选，所述第372位的突变为：由酪氨酸突变为甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。
作为优选，所述第548位的突变为：由酪氨酸突变为甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。
本发明还提供了一种含有黄芪甲苷木糖苷酶突变体核苷酸序列的重组质粒。
本发明还提供了一种含有重组质粒的宿主细胞。
本发明还提供了所述突变体在催化黄芪甲苷生产环黄芪醇中的应用。
作为优选，所述突变体对黄芪甲苷进行催化时水解其C3位置的木糖苷键。
本发明提供了一种黄芪甲苷木糖苷酶突变体及其应用，所述突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列突变得到；所述突变的位点包括第202位、第322位、第372和第548位中的一种或多种。本发明中的黄芪甲苷木糖苷酶突变体通过4个位点的单点突变或组合突变，能够显著提高酶水解黄芪甲苷C3位置木糖苷键的水解活性，相较于野生型黄芪甲苷木糖苷酶，对底物黄芪甲苷的催化活性提高了1～20倍，大幅降低环黄芪醇工业生产的成本，使酶催化黄芪甲苷制备环黄芪醇的生产效率显著提高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1突变位点的确定
使用WebLogo 3在线软件对黄芪甲苷木糖苷酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)进行保守分析，其中用于保守分析的同源序列数据集由Consensus Finder软件输出。黄芪甲苷木糖苷酶的三维模型由SWISS-MODEL在线服务器(https://swissmodel.expasy.org/interactive)建立，所用模板为PDB ID：6Q7I。使用ProSA、PROCHECK等软件评估构建的模型质量。使用Pymol软件将构建的黄芪甲苷木糖苷酶三维结构与模板(6Q7I)进行结构叠加，并进行可视化。结果显示，黄芪甲苷木糖苷酶中的Asp407和Glu611与模板催化残基Asp307(亲核试剂)和Glu509(酸碱试剂)具有相似的位置和方向。此外，序列保守分析显示，Asp407和Glu611在进化中高度保守。因此，Asp407(亲核试剂)和Glu611(酸碱试剂)被预测为黄芪甲苷木糖苷酶的催化残基。进一步，将黄芪甲苷木糖苷酶模型与底物黄芪甲苷进行分子对接计算。从PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)库中获取黄芪甲苷的三维结构，并于MMFF94力场中进行能量最小化。将黄芪甲苷木糖苷酶中的Asp407和Glu611定义对接口袋，并在Yinfo云平台(http://cloud.yinfotek.com/)上运行DOCK 6.9程序进行底物和酶的半柔性对接计算，并使用网格评分函数对输出的对接构象的进行能量打分。结果显示，黄芪甲苷木糖苷酶中的Asn131、Trp202、H322、Arg336、Try372、Asn547和Tyr548与黄芪甲苷具有相互作用，主要为氢键或疏水相互作用，因此确定以上7个位点为突变的热点残基。
实施例2引物设计
以SEQ ID NO：2为模板，设计用于定点突变的引物序列(N131A、N131G、N131S、W202G、W202A、W202D、W202E、W202T、W202S、H322A、H322G、R336G、R336A、Y372G、Y372A、Y372D、Y372E、N547A、N547G、Y548G、Y548A、Y548D、Y548E、Y548V、Y548T)，具体引物序列如表1所示：
表1
Figure BDA0003246252860000031
Figure BDA0003246252860000041
Figure BDA0003246252860000051
实施例3黄芪甲苷木糖苷酶突变体DNA序列的获得
利用定点突变技术获得突变体核苷酸序列，通过PCR扩增的方式在黄芪甲苷木糖苷酶上引入突变位点。以野生型黄芪甲苷木糖苷酶核苷酸序列SEQ ID NO：2为模板，先使用F-EcoRI和突变位点的下游引物扩增部分DNA片段，使用R-NotI和突变位点的上游引物扩增部分DNA片段，完成第一轮PCR扩增。然后将两次扩增后得到的DNA片段混合再进行第二轮PCR反应，从而得到完整的突变后DNA序列。PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性2min，58℃退火，72℃延伸180s，共30个循环，然后72℃终延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。第一轮PCR扩增体系如表2所示，第二轮PCR扩增体系如表3所示。
表2
Figure BDA0003246252860000061
表3
Figure BDA0003246252860000062
实施例4质粒构建
PCR反应结束后，使用OMEGA胶回收试剂盒对PCR产物进行分离纯化回收。使用EcoRI和NotI两种限制性内切酶对回收的DNA片段和pPIC9k载体分别进行双酶切，反应条件如表4所示。
表4
Figure BDA0003246252860000071
然后将酶切后的产物进行回收纯化，并通过使用T4连接酶将酶切后的基因序列分别和酶切后的pPIC9k载体进行连接，获得重组载体(pPIC9k-N131A、pPIC9k-N131G、pPIC9k-N131S、pPIC9k-W202G、pPIC9k-W202A、pPIC9k-W202D、pPIC9k-W202E、pPIC9k-W202T、pPIC9k-W202S、pPIC9k-H322A、pPIC9k-H322G、pPIC9k-R336G、pPIC9k-R336A、pPIC9k-Y372G、pPIC9k-Y372A、pPIC9k-Y372D、pPIC9k-Y372E、pPIC9k-N547A、pPIC9k-N547G、pPIC9k-Y548G、pPIC9k-Y548A、pPIC9k-Y548D、pPIC9k-Y548E、pPIC9k-Y548V、pPIC9k-Y548T)。连接体系如表5所示。
表5
Figure BDA0003246252860000072
实施例5构建毕赤酵母重组宿主
使用SalI限制性内切酶对上述获得的重组载体(pPIC9k-N131A、pPIC9k-N131G、pPIC9k-N131S、pPIC9k-W202G、pPIC9k-W202A、pPIC9k-W202D、pPIC9k-W202E、pPIC9k-W202T、pPIC9k-W202S、pPIC9k-H322A、pPIC9k-H322G、pPIC9k-R336G、pPIC9k-R336A、pPIC9k-Y372G、pPIC9k-Y372A、pPIC9k-Y372D、pPIC9k-Y372E、pPIC9k-N547A、pPIC9k-N547G、pPIC9k-Y548G、pPIC9k-Y548A、pPIC9k-Y548D、pPIC9k-Y548E、pPIC9k-Y548V、pPIC9k-Y548T)进行单酶切线性化；然后将线性化的重组载体分别电转化到活化的毕赤酵母GS115中得到产酶宿主细胞(GS115-N131A、GS115-N131G、GS115-N131S、GS115-W202G、GS115-W202A、GS115-W202D、GS115-W202E、GS115-W202T、GS115-W202S、GS115-H322A、GS115-H322G、GS115-R336G、GS115-R336A、GS115-Y372G、GS115-Y372A、GS115-Y372D、GS115-Y372E、GS115-N547A、GS115-N547G、GS115-Y548G、GS115-Y548A、GS115-Y548D、GS115-Y548E、GS115-Y548V、GS115-Y548T)。
实施例6黄芪甲苷木糖苷酶突变体的表达和纯化
将上述得到的产酶宿主细胞接入BMMG培养基中于220rpm、30℃条件下培养12h；然后收集菌体并用无菌水清洗2遍，并接入BMMY培养基中在220rpm、30℃条件下培养，每隔24h添加1％甲醇诱导。培养4天后，通过离心和过滤去除菌体得到发酵液，再使用镍柱对上述发酵液进行纯化，最终获得纯化的黄芪甲苷木糖苷酶突变体(N131A、N131G、N131S、W202G、W202A、W202D、W202E、W202T、W202S、H322A、H322G、R336G、R336A、Y372G、Y372A、Y372D、Y372E、N547A、N547G、Y548G、Y548A、Y548D、Y548E、Y548V、Y548T)。
实施例7黄芪甲苷木糖苷酶突变体酶活研究
酶活的测定：底物为5mM黄芪甲苷，加入黄芪甲苷木糖苷酶突变体，在pH 5.5和温度45℃条件下反应1h，反应结束后加入适量甲醇溶解，高效液相色谱检测底物黄芪甲苷的含量，并计算酶活，结果如表6所示。其中黄芪甲苷木糖苷酶突变体酶活定义(U)为每分钟反应掉1μmol黄芪甲苷所需的酶量，比酶活为单位mg的蛋白所具有的酶活。
表6
Figure BDA0003246252860000081
Figure BDA0003246252860000091
+代表酶活相对野生型提高1～5倍，++代表酶活相对野生型提高5～10倍，+++代表酶活相对野生型提高10～20倍，-代表酶活相对野生型没有明显变化或降低。
将酶活提高明显的单突变体进行组合，结果如表7所示。
表7
酶 比酶活
WT -
W202G/H322G +++
W202A/H322A +++
W202D/Y372G ++
W202E/Y548G ++
H322G/Y372A +++
Y372G/Y548G +++
Y372A/Y548G ++
+代表酶活相对野生型提高1～5倍，++代表酶活相对野生型提高5～10倍，+++代表酶活相对野生型提高10～20倍，-代表酶活相对野生型没有明显变化或降低。
实施例8黄芪甲苷木糖苷酶突变体W202G在转化黄芪甲苷制备环黄芪醇中的应用
向10mL100 mM(pH 6.0)的磷酸缓冲液中加入100mg质量含量为10％的黄芪甲苷粉末，然后在分别加入0.1mg黄芪甲苷木糖苷酶突变体W202G以及0.1mg葡萄糖苷酶，后在200r/min、45℃条件下充分反应3h。反应结束后液相检测，结果显示环黄芪醇得率高达98.2％。
实施例9黄芪甲苷木糖苷酶突变体H322G在转化黄芪甲苷制备环黄芪醇中的应用
向10mL100 mM(pH 6.0)的磷酸缓冲液中加入100mg质量含量为10％的黄芪甲苷粉末，然后在分别加入0.2mg黄芪甲苷木糖苷酶突变体H322G以及0.1mg葡萄糖苷酶，后在200r/min、45℃条件下充分反应3h。反应结束后液相检测，结果显示环黄芪醇得率高达98.6％。
实施例10黄芪甲苷木糖苷酶突变体Y372E在转化黄芪甲苷制备环黄芪醇中的应用
向10mL100 mM(pH 6.0)的磷酸缓冲液中加入100mg质量含量为10％的黄芪甲苷粉末，然后在分别加入0.2mg黄芪甲苷木糖苷酶突变体Y372E以及0.1mg葡萄糖苷酶，后在200r/min、45℃条件下充分反应3h。反应结束后液相检测，结果显示环黄芪醇得率高达98.7％。
实施例11黄芪甲苷木糖苷酶突变体Y548G在转化黄芪甲苷制备环黄芪醇中的应用
向10mL100 mM(pH 6.0)的磷酸缓冲液中加入100mg质量含量为10％的黄芪甲苷粉末，然后在分别加入0.2mg黄芪甲苷木糖苷酶突变体Y548G以及0.1mg葡萄糖苷酶，后在200r/min、45℃条件下充分反应3h。反应结束后液相检测，结果显示环黄芪醇得率高达98.1％。
实施例12黄芪甲苷木糖苷酶突变体H322G/Y372A在转化黄芪甲苷制备环黄芪醇中的应用
向10mL100 mM(pH 6.0)的磷酸缓冲液中加入100mg质量含量为10％的黄芪甲苷粉末，然后在分别加入0.1mg黄芪甲苷木糖苷酶突变体H322G/Y372A以及0.1mg葡萄糖苷酶，后在200r/min、45℃条件下充分反应3h。反应结束后液相检测，结果显示环黄芪醇得率高达98.3％。
由以上实施例可知，本发明提供了一种黄芪甲苷木糖苷酶突变体及其应用，所述突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列突变得到；所述突变的位点包括第202位、第322位、第372和第548位中的一种或多种。本发明中的黄芪甲苷木糖苷酶突变体通过4个位点的单点突变或组合突变，能够显著提高酶水解黄芪甲苷C3位置木糖苷键的水解活性，相较于野生型黄芪甲苷木糖苷酶，对底物黄芪甲苷的催化活性提高了1～20倍，大幅降低环黄芪醇工业生产的成本，使酶催化黄芪甲苷制备环黄芪醇的生产效率显著提高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 威海百合生物技术股份有限公司
北京化工大学
<120> 一种黄芪甲苷木糖苷酶突变体及其应用
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 884
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ser Lys Phe Leu Ser Trp Ser Val Leu Leu Gln Gly Val Ser Tyr
1 5 10 15
Thr Leu Ala Ala Pro Gln Gln Gly Lys Cys Leu Pro Ala Val Asn Val
20 25 30
Gly Tyr Ala Ala Asn Ile Thr Phe Val Gly Cys Tyr Thr Asp Asn Ser
35 40 45
Thr Arg Ile Leu Gln Gly Gly Ser Thr Val Pro Pro Asn Gly Asn Asp
50 55 60
Pro Gln Ser Cys Ala Asp Ser Cys Gly Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Ala
65 70 75 80
Gly Val Glu Tyr Gly Ser Gln Cys Tyr Cys Gly Ser Thr Ile Leu Ser
85 90 95
Gly Ala Gln Gln Gln Ala Asp Ser Ala Cys Thr Met Thr Cys Ser Gly
100 105 110
Asn Ser Ser Glu Ile Cys Gly Gly Thr Trp Leu Val Asp Ile Tyr Gln
115 120 125
Ile Ser Asn Pro Ser Ser Thr Pro Val Pro Leu Ser Gly Ala Val Lys
130 135 140
Pro Asn Cys Thr Ala Asp Pro Leu Cys Ser Asn Pro Val Cys Asn Ala
145 150 155 160
Ala Leu Asp Pro Leu Thr Arg Ala Lys Gly Leu Val Asp Ala Leu Thr
165 170 175
Phe Asp Glu Lys Ile Gln Asn Thr Gln Asn Gly Ser Pro Gly Ser Ala
180 185 190
Arg Leu Gly Leu Pro Gly Tyr Gln Trp Trp Ser Glu Ala Leu His Gly
195 200 205
Val Ala Ser Ser Pro Gly Val Thr Phe Gln Thr Gly Asn Phe Ser Tyr
210 215 220
Ala Thr Ser Phe Pro Gln Pro Ile Leu Met Ser Ala Ala Phe Asp Asp
225 230 235 240
Ala Leu Ile Gln Gln Val Gly Thr Val Val Ser Ile Glu Gly Arg Ala
245 250 255
Phe Ser Asn Tyr Gly Asn Ala Gly Leu Asp Phe Trp Thr Pro Asn Ile
260 265 270
Asn Pro Phe Arg Asp Pro Arg Trp Gly Arg Gly Gln Glu Thr Pro Gly
275 280 285
Glu Asp Pro Phe His Ile Ala Arg Tyr Val Tyr Asn Leu Val Asp Gly
290 295 300
Leu Gln Asn Gly Ile Gly Pro Thr Asn Pro Arg Val Val Ala Thr Cys
305 310 315 320
Lys His Phe Ala Gly Tyr Asp Ile Glu Asp Trp Glu Gly Asn Ala Arg
325 330 335
Tyr Gly Phe Asn Ala Ile Ile Ser Thr Gln Asp Leu Ser Glu Tyr Tyr
340 345 350
Leu Pro Pro Phe Lys Ser Cys Ala Arg Asp Ala Lys Val Asp Ala Ile
355 360 365
Met Cys Ser Tyr Asn Ala Val Asn Gly Ile Pro Thr Cys Ala Asp Ser
370 375 380
Tyr Leu Leu Asp Thr Ile Leu Arg Asp His Trp Asn Trp Asn Gln Thr
385 390 395 400
Gly Arg Trp Val Thr Ser Asp Cys Asp Ala Ile Gly Asn Ile Phe Thr
405 410 415
Asp His His Tyr Thr Ser Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu
420 425 430
Asn Ala Gly Thr Asn Leu Asp Cys Gly Thr Thr Met Ser Asn Asn Leu
435 440 445
Ala Ala Ala Ser Ala Gln Asp Leu Phe Gln Asn Ala Thr Leu Asp Thr
450 455 460
Ala Leu Thr Tyr Leu Tyr Ser Ser Leu Val Arg Leu Gly Trp Phe Asp
465 470 475 480
Glu Glu Thr Ser Pro Tyr Arg Ser Leu Asp Trp Ser Asp Val Gly Thr
485 490 495
Pro Ala Ser Gln Gln Leu Ala Ile Arg Ala Ala Val Glu Gly Ile Val
500 505 510
Leu Leu Lys Asn Asp Lys Thr Lys Val Leu Pro Leu Ser Ser His Arg
515 520 525
Gln Thr Ile Ala Leu Ile Gly Pro Tyr Ala Asn Ala Thr Thr Gln Leu
530 535 540
Gln Gly Asn Tyr Ala Gly Val Ala Glu Tyr Ile Arg Thr Leu Val Trp
545 550 555 560
Gly Ala Glu Gln Ala Gly Tyr Asn Val Glu Tyr Ala Leu Gly Thr Asp
565 570 575
Ile Asn Ser Thr Asp Thr Ser Gly Phe Ser Ala Ala Val Ala Ala Ala
580 585 590
Asn Ala Ser Asp Ile Ile Ile Tyr Ala Gly Gly Ile Asp Asn Ser Ile
595 600 605
Glu Ala Glu Ala Met Asp Arg Asp Thr Ile Ser Trp Pro Gly Asn Gln
610 615 620
Leu Gln Leu Val Asp Glu Leu Ser Gln Val Gly Lys Pro Leu Ile Val
625 630 635 640
Leu Gln Phe Gly Gly Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ala Leu Leu Glu Asn
645 650 655
Glu Lys Val Asn Ala Ile Leu Trp Ala Gly Tyr Pro Ser Gln Ala Gly
660 665 670
Gly Gln Ala Val Phe Asp Ile Leu Thr Gly Lys Ser Ala Pro Ala Gly
675 680 685
Arg Leu Pro Ile Thr Gln Tyr Pro Ala Asn Tyr Thr Asn Glu Ile Pro
690 695 700
Met Thr Asp Met Ala Leu Arg Pro Asn Gly Thr Asn Pro Gly Arg Thr
705 710 715 720
Tyr Arg Trp Tyr Asp Asp Ala Val Ile Pro Phe Gly Tyr Gly Leu His
725 730 735
Tyr Thr Ser Phe Asp Val Ser Trp Ala Ser Lys Lys Leu Gly Pro Tyr
740 745 750
Asn Thr Ala Ser Leu Gly His Val Ser Lys Ser Gln Tyr Pro Asp Thr
755 760 765
Ala Ala Phe Asp Thr Phe His Ile Asp Val Lys Asn Thr Gly Lys Val
770 775 780
Thr Ser Asp Tyr Val Ala Leu Leu Phe Ala Ser Thr Lys Asn Ala Gly
785 790 795 800
Pro Ala Pro Tyr Pro Ile Lys Thr Leu Val Gly Tyr Ala Arg Ala Pro
805 810 815
Ser Ile Lys Pro Gly Glu Thr Arg Ser Val Ser Leu Asp Val Thr Leu
820 825 830
Gly Ala Ile Ala Arg Thr Ala Glu Asn Gly Asp Leu Val Leu Tyr Pro
835 840 845
Gly Thr Tyr Thr Leu Glu Val Asp Val Gly Gln His Tyr Pro Thr Ala
850 855 860
Glu Phe Gln Val Asn Gly Pro Asp Lys Val Leu Asp Ser Phe Pro Gln
865 870 875 880
Pro Pro Ser Ser
<210> 2
<211> 2652
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtctaaat ttttgtcttg gtctgttttg ttgcaaggtg tttcttatac tttggctgcc 60
ccacaacaag gtaaatgttt gcctgctgtt aacgttggat acgctgctaa cattactttt 120
gttggttgtt acactgacaa ctccactcgt attttgcaag gtggttccac tgttccacca 180
aacggtaacg acccacaatc ttgtgctgac tcctgtggtg cttctggttt cacctacgcc 240
ggtgttgagt acggttccca atgttactgt ggttctacca ttctgtcagg tgctcagcaa 300
caagccgatt ctgcttgtac catgacttgt tccggtaatt cttctgagat ttgtggtggt 360
acttggttgg ttgatatcta ccagatctct aacccttctt ctactccagt tccattgtct 420
ggtgctgtta agcctaattg tactgctgat cctttgtgtt ctaaccccgt ttgtaacgct 480
gcactggatc cattgactag agctaaggga ttagttgacg ctttgacttt tgacgaaaag 540
attcaaaaca cccagaacgg aagtcctggt tccgctcgtt tgggtttgcc aggttatcag 600
tggtggtctg aagctttgca cggagttgct tcttctccag gtgttacttt ccaaaccggt 660
aacttttcct acgctacttc tttcccacaa ccaattctta tgtccgctgc ttttgatgat 720
gctctgattc aacaagttgg tactgttgtt tcaattgaag gtagagcttt ctccaactac 780
ggtaacgccg gactggattt ttggactcct aacattaacc ctttccgtga tcctagatgg 840
ggtagaggtc aagaaactcc tggtgaggac cctttccaca ttgctcgtta cgtttacaat 900
ctggttgatg gtctgcaaaa cggtatcggt cctactaacc ctagagttgt tgctacctgt 960
aagcactttg ctggttacga cattgaggat tgggaaggta acgctagata cggttttaac 1020
gctattattt caactcaaga tttgtccgag tactacctgc ctccttttaa atcttgtgct 1080
agagacgcta aggttgacgc tattatgtgt tcttataatg ctgttaacgg tattcctacc 1140
tgtgctgact cctacttgtt ggacaccatt ttgagagatc attggaactg gaaccaaacc 1200
ggtagatggg tgacctctga ttgtgacgct attggtaata tcttcactga tcaccactac 1260
acttccactg ctgctgctgc tgccgcagat gctttgaatg ccggtaccaa cttggactgt 1320
ggtaccacca tgtctaacaa tcttgctgct gcttctgccc aggatctgtt ccaaaacgcc 1380
actctagaca ccgccttgac ttatttgtac tcgtctttgg ttcgtttggg ttggtttgac 1440
gaagaaacct ctccataccg atctttggat tggtctgacg tcggtactcc agcttcccag 1500
caactggcca tcagagccgc tgttgaaggt atcgttttgt tgaagaacga caaaactaag 1560
gttttgcctt tgtcatctca ccgtcaaacc atcgctctta ttggaccata cgctaacgct 1620
accactcaat tgcaaggtaa ctacgctggt gtcgctgaat acatcagaac tttggtttgg 1680
ggtgctgagc aagctggtta taacgttgaa tatgctttgg gtactgatat taattcaact 1740
gatacttctg gtttctctgc cgctgtcgca gctgctaacg cttctgatat catcatctac 1800
gctggtggta ttgataactc aatcgaggca gaggctatgg acagagatac tatctcttgg 1860
ccaggtaatc aattgcaatt ggttgatgaa ctttctcaag tcggtaaacc tttaattgtt 1920
cttcaattcg gaggtggaca acttgatgac tctgccttgt tggaaaatga gaaggttaac 1980
gctattcttt gggctggtta cccatcccaa gctggtggtc aagccgtttt tgatatcttg 2040
actggtaaat ccgctcctgc tggtagactg cctattaccc aataccctgc taactacacc 2100
aacgaaatcc caatgactga catggctttg agaccaaatg gtactaaccc aggtagaacc 2160
tatagatggt acgatgatgc tgtgattcct ttcggttacg gtttgcatta cactagtttc 2220
gacgtttctt gggcttccaa gaagttgggt ccatacaaca ccgcctcact gggtcacgtt 2280
tctaagtctc aataccctga taccgctgcc tttgacactt ttcatatcga cgtcaagaac 2340
actggtaaag ttactagtga ttacgtcgct ctgctgttcg cttctactaa gaacgctggt 2400
ccagcccctt accctatcaa gaccttggtc ggttatgcta gagccccatc aatcaagcca 2460
ggtgaaacta gatccgtctc cttggatgtt actttgggtg ctattgctag aactgctgaa 2520
aacggtgacc tggtcttgta cccaggaact tacaccttgg aggttgacgt cggtcaacac 2580
tacccaactg ctgagttcca ggtcaacggt cctgataagg tcttggattc tttcccacaa 2640
cctccatctt ct 2652
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggaaagaat tcgccccaca acaagg 26
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggaaagcgg ccgcgtgatg gtggtggtga tg 32
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccagatctct gctccttctt c 21
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtctagaga cgaggaagaa g 21
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccagatctct ggcccttctt c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtctagaga ccgggaagaa g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccagatctct agcccttctt c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggtctagaga tcgggaagaa g 21
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atcagtgggg ctctgaagc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tagtcacccc gagacttcg 19
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atcagtgggc ttctgaagc 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tagtcacccg aagacttcg 19
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atcagtggga ctctgaagc 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tagtcaccct gagacttcg 19
<210> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atcagtggga gtctgaagc 19
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tagtcaccct cagacttcg 19
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atcagtggac gtctgaagc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tagtcacctg cagacttcg 19
<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atcagtggag ctctgaagc 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tagtcacctc gagacttcg 19
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acctgtaagg cttttgctg 19
<210> 24
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tggacattcc gaaaacgac 19
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
acctgtaagg gctttgctg 19
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tggacattcc cgaaacgac 19
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ggtaacgctg gctacggttt 20
<210> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ccattgcgac cgatgccaaa 20
<210> 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ggtaacgctg cttacggttt 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccattgcgac gaatgccaaa 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gtgttctggc aatgctgtta acgg 24
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cacaagaccg ttcgacaatt gcc 23
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gtgttctgct aatgctgtta acgg 24
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cacaagacga ttcgacaatt gcc 23
<210> 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gtgttctgac aatgctgtta acgg 24
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cacaagactg ttcgacaatt gcc 23
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gtgttctgag aatgctgtta acgg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cacaagactc ttcgacaatt gcc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcaaggtgct tacgctggt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gcaaggtggc tacgctggt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cgttccaccg atgcgacca 19
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caaggtaacg gcgctggtgt c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gttccattgc cgcgaccaca g 21
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
caaggtaacg ctgctggtgt c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gttccattgt gacgaccaca g 21

Claims (9)

1.一种黄芪甲苷木糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是由SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列突变得到；所述突变的位点包括第202位、第322位、第372和第548位中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的一种黄芪甲苷木糖苷酶突变体，其特征在于，所述第202位的突变为：由色氨酸突变为甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸或丝氨酸。
3.根据权利要求2所述的一种黄芪甲苷木糖苷酶突变体，其特征在于，所述第322位的突变为：由组氨酸突变为甘氨酸或丙氨酸。
4.根据权利要求3所述的一种黄芪甲苷木糖苷酶突变体，其特征在于，所述第372位的突变为：由酪氨酸突变为甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的一种黄芪甲苷木糖苷酶突变体，其特征在于，所述第548位的突变为：由酪氨酸突变为甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。
6.一种含有权利要求1～5任意一项所述突变体核苷酸序列的重组质粒。
7.一种含有权利要求6所述重组质粒的宿主细胞。
8.权利要求1～5任意一项所述突变体在催化黄芪甲苷生产环黄芪醇中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述突变体对黄芪甲苷进行催化时水解其C3位置的木糖苷键。
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Citations (1)

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Patent Citations (1)

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