CN117230051B - 一种褐藻胶裂解酶突变体Pl7MaM及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学以及蛋白质工程领域，具体涉及一种褐藻胶裂解酶突变体Pl7MaM及其制备方法与应用。本发明以褐藻胶裂解酶Pl7Ma为出发模板，首先通过截短不同蛋白功能模块获得Pl7Ma2，其酶比活是Pl7Ma的1.31倍；然后以Pl7Ma2为模板，通过结合二硫键和温度因子优化两种蛋白质理性设计策略，获得了热稳定性提升的突变体Pl7MaM。本发明获得的突变体P17MaM在45℃、50℃和55℃的水浴处理60分钟后的剩余酶活分别是Pl7Ma的3.14倍、4.83倍和6.52倍，酶活力及热稳定性均显著提升，可进一步用于制备海藻寡糖，为下一步产业化应用奠定了坚实基础。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学以及蛋白质工程领域，具体涉及一种褐藻胶裂解酶突变体Pl7MaM及其制备方法与应用。
背景技术
作为一种海洋酸性多糖，褐藻胶主要来源于海带、昆布、马尾藻等褐藻。褐藻胶是一种线性多糖，由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸通过α/β-1,4 糖苷键随机排列而成。作为一种生物大分子，褐藻胶具有分子量大、水溶性差及生物利用度低等缺点，限制其在许多领域的应用。但是其降解产物褐藻胶寡糖，具有良好的水溶性和生物利用率，此外还展现出更多的生物活性如抗氧化、抑菌等，在许多领域具有很好的应用价值。
迄今，褐藻胶降解方法主要包括物理法、化学法和酶法。相比于物理法和化学法，酶法具有绿色环保、反应条件温和且反应过程可控、产物结构完好等优势，逐渐成为褐藻胶降解的主要方法。褐藻胶裂解酶作为专一性水解褐藻胶的工具，其来源广泛，其中细菌来源的褐藻胶裂解酶具有作用pH广、催化活性高等优势。微泡菌属来源褐藻胶裂解酶作为细菌来源的重要组成部分，其分泌的褐藻胶裂解酶在褐藻胶寡糖制备领域发挥重要作用。
因此，为了扩大褐藻胶裂解酶的应用范围，对褐藻胶裂解酶的进一步研究具有重要的现实意义。
发明内容
基于此，本发明提供了一种褐藻胶裂解酶突变体Pl7MaM及其制备方法与应用，有效提升了酶活力和热稳定性，为下一步应用奠定了基础。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种褐藻胶裂解酶突变体Pl7MaM，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
优选地，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列，所述多聚核苷酸序列如SEQID NO.7所示。
本发明还提供了一种所述褐藻胶裂解酶突变体Pl7MaM的制备方法，制备过程如下：以褐藻胶裂解酶Pl7Ma为出发模板，首先通过截短不同蛋白功能模块获得Pl7Ma2；然后以Pl7Ma2为模板，通过结合二硫键和温度因子优化两种蛋白质理性设计策略，即得Pl7MaM。
优选地，所述褐藻胶裂解酶Pl7Ma的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Pl7Ma2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，编码所述褐藻胶裂解酶Pl7Ma氨基酸序列的多聚核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；编码所述Pl7Ma2氨基酸序列的多聚核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了一种重组表达载体pPICZαA-pl7MaM，包括所述褐藻胶裂解酶突变体Pl7MaM的多聚核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组工程菌，包括所述的重组表达载体pPICZαA-pl7MaM。
优选地，所述的重组工程菌以毕赤酵母工程菌作为宿主。
优选地，所述毕赤酵母工程菌包括毕赤酵母X33。
本发明还提供了一种所述的褐藻胶裂解酶突变体Pl7MaM在制备海藻寡糖中的应用。
因此，本发明的目的通过下述技术方案实现：（1）根据毕赤酵母密码子偏好性，优化合成褐藻胶裂解酶Pl7Ma编码基因Pl7ma，并以毕赤酵母为宿主进行异源表达，获得重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma；（2）通过分析褐藻胶裂解酶Pl7Ma蛋白内部功能元件，分别构建不同长度褐藻胶裂解酶，获得酶活力提升的Pl7Ma2；（3）以Pl7Ma2为出发模板，定向增加其内部二硫键，获得热稳定性提升的二硫键突变体Pl7Ma2-T112C/A261C；（4）以二硫键突变体Pl7Ma2-T112C/A261C为模板，优化其温度因子B-factor，结合单点突变和组合突变，获得热稳定性提升的突变体Pl7MaM；（5）突变体Pl7MaM特性表征及其制备海藻寡糖。
与现有技术相比，本发明的具有以下优势：本发明以来源于Microbulbiferagarilyticus的褐藻胶裂解酶Pl7Ma为研究对象，根据毕赤酵母密码子偏好性，优化合成目标基因pl7ma并在毕赤酵母实现重组表达；并通过截短不同蛋白功能元件获得酶比活提升的Pl7Ma2；最终结合二硫键理性设计和温度因子优化两种方法获得Pl7MaM，其在45℃、50℃和55℃的水浴处理60分钟后的剩余酶活分别是Pl7Ma的3.14倍、4.83倍和6.52倍，酶活力及热稳定性均显著提升，可进一步用于制备海藻寡糖，为下一步产业化应用奠定了坚实基础。
附图说明
图1为褐藻胶裂解酶Pl7Ma温度特性和pH特性图；
图2为褐藻胶裂解酶Pl7Ma及其截短突变体Pl7Ma1和Pl7Ma2三维构象；
图3为Pl7Ma2及其突变体Pl7Ma2-T112C/A261C和Pl7MaM三维构象；
图4为突变体Pl7MaM最适反应温度和热稳定性图；
图5为重组工程菌高密度发酵产酶曲线图和不同发酵时间蛋白电泳图；
图6为突变体Pl7MaM单因素优化制备海藻寡糖图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明涉及到的试验材料和试剂如下：
1、菌株与载体：毕赤酵母X33和表达载体pPICZαA均购自武汉淼灵生物科技有限公司；大肠杆菌感受态细胞Top10购自深圳辉诺生物技术有限公司。
2、酶与试剂盒：高保真Taq酶PrimeSTAR® HS (Premix)、TA克隆扩增Taq酶EmeraldAmp GTPCR Master Mix、限制性内切酶（SacI、EcoRI和NotI）以及TA克隆试剂盒（Code No 6028）均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；细菌基因组提取试剂盒（#DP302）、质粒提取试剂盒（#DP103-03）以及胶纯化试剂盒（#DP209-02）均购自天根生化科技（北京）有限公司；Zeocin购自Invitrogen公司；海藻酸钠（货号：S11053，CAS号：9005-38-3）购自上海源叶生物科技有限公司；其它化学试剂均购自上海麦克林生化科技有限公司。
3、培养基：大肠杆菌培养基为LB，包括（1%（w/v）蛋白胨，0.5%（w/v）酵母提取物（上海源叶生物科技有限公司，MLP0021B），1%（w/v）NaCl， pH7.0）；LBZ为LB培养基加25μg/mLZeocin（博莱霉素）；
酵母培养基为YPD，包括（1%（w/v）酵母提取物，2%（w/v）蛋白胨，2%（w/v）葡萄糖）；
酵母筛选培养基为YPDZ（YPD培养基添加不同浓度的zeocin）；
酵母摇瓶培养基为BMGY培养基，包括 1％（w/v）酵母提取物、2％（w/v）蛋白胨、1.34％（w/v）YNB、0.00004％（w/v）Biotin、1％甘油(V/V)；
酵母摇瓶诱导培养基为BMMY培养基，除以0.5%（v/v）甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同；
注：YNB为酵母氮源基础（Yeast Nitrogen Base）；Biotin为生物素（上海源叶生物科技有限公司，S13004，CAS号58-85-5）；
4. 褐藻胶裂解酶活性测定所用试剂
采用DNS法测定褐藻胶裂解酶活性，主要的试剂包括底物海藻酸钠（浓度为0.5%，m/v）和显色剂DNS试剂（6.3‰（w/v）3,5-二硝基水杨酸；18.2%（w/v）四水酒石酸钾钠；5‰（w/v）苯酚；5‰（w/v）无水亚硫酸钠）。
实施例1 褐藻胶裂解酶Pl7Ma基因合成及重组表达
以美国生物信息学技术数据库NCBI公布的微泡菌Microbulbifer agarilyticus褐藻胶裂解酶基因编码序列（基因登录号：JAHVKG010000003.1：154160-155992）为模板，根据毕赤酵母密码子偏好性优化在线软件（https://www.vectorbuilder.cn/tool/codon-optimization.html）进行序列优化。由于在毕赤酵母进行重组表达，因此优化过程中去掉信号肽序列。通过序列优化获得褐藻胶裂解酶基因pl7Ma序列。褐藻胶裂解酶基因pl7Ma序列长度为1779bp，其序列如SEQ ID NO.1所示。褐藻胶裂解酶基因pl7Ma编码的褐藻胶裂解酶Pl7Ma序列全长593个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示。
将优化获得的褐藻胶裂解酶基因pl7ma序列，提交至通用生物(安徽)股份有限公司进行合成，合成过程中去掉褐藻胶裂解酶基因pl7Ma自身终止密码子，并且在基因两端添加EcoRI和NotI酶切位点，合成后的褐藻胶裂解酶基因pl7Ma直接连接至载体pPICZαA，从而获得表达载体pPICZαA-pl7Ma。基因合成及表达载体pPICZαA-pl7Ma构建均由通用生物（安徽）股份有限公司完成。
将表达载体pPICZαA-pl7Ma通过电转化法转入毕赤酵母X33，构建褐藻胶裂解酶Pl7Ma重组毕赤酵母工程菌，实验过程如下：（1）将表达载体pPICZαA-pl7Ma用限制性内切酶SacI线性化后，纯化回收，并测定其浓度；（2）将毕赤酵母感受态细胞，于冰上放置30分钟，将纯化后的线性化表达载体pPICZαA-pl7Ma转入毕赤酵母感受态细胞并在冰上放置20分钟；（3）将含有线性化表达载体pPICZαA-pl7Ma的酵母感受态细胞，转入电转杯，通过电穿孔仪进行电击转化（转化参数为1500千伏，400欧姆）；（4）将转化后的产物转入2mL离心管并加入0.5mL 1M山梨醇溶液，30℃，静置2小时后，均匀涂布于YPDZ平板；（5）将涂布好的平板在30℃，静置培养3至5天，即得酵母转化子。
对培养获得的酵母转化子进行筛选实验，实验过程大致如下：（1）将单个转化子分别挑入含有10mLYPD培养基的100mL摇瓶，30℃，200rpm培养24小时后，开始进行诱导培养。诱导培养过程中每过24小时按0.75%（体积比，v/v）的比例加入甲醇进行诱导培养，培养48小时后进行褐藻胶裂解酶活性测定。
褐藻胶裂解酶活性测定方法如下：（1）将海藻酸钠和稀释好的酶液（大约为1U/mL至2U/mL）在40℃分别预热5分钟；（2）分别取预热好的酶液50μL加入2mL离心管，然后再加入350μL海藻酸钠溶液（浓度为0.5%，m/v），40℃反应10分钟；（3）然后向其中加入600μL DNS显色剂，在100℃沸水浴10分钟进行显色；（4）待显色后的溶液冷却至室温，20分钟后，离心，取上清在在540nm下测定吸光值，整个测定过程以失活的酶液作为对照。褐藻胶裂解酶活性定义为：每1分钟生成1μmol葡萄糖当量的褐藻胶寡糖，所需要的酶量定义为一个活力单位。
通过筛选96个转化子，获得3个酶活优势菌，分别命名P5、P35和P81，这三个重组工程菌的发酵酶活分别为6.8 U/mL，6.5U/mL和6.1U/mL。
通过500mL摇瓶培养，进一步比较分析酶活优势菌P5、P35和P81。实验过程大致如下：（1）将单个转化子分别挑入含有50mL BMGY培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养至OD600为6.0；（2）将培养好的菌液离心，去掉上清，转入含有100mL BMMY培养基的500mL摇瓶，菌液起始OD600值为1.0，30℃，200rpm培养，培养过程中每隔24小时按0.5%（体积比，v/v）的比例加入甲醇进行诱导培养，同时取样进行褐藻胶裂解酶活性测定。
通过结合100mL摇瓶和500mL摇瓶培养结果，最终发现重组工程菌P81呈现最好的发酵效果，其在500mL摇瓶，诱导培养120小时后，发酵酶活为12.6U/mL。
实施例2 重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma纯化及特性表征
在表达载体构建过程中，在重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma的C端引入了His-Tag标签，因此采取镍柱纯化法纯化回收重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma。纯化实验过程如下：（1）首先将实施例2中500mL摇瓶培养的发酵液离心，收集上清液；（2）用10kDa超滤管将收集的上清发酵液进行浓缩；（3）将浓缩好的重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma参照Ni-IDA蛋白纯化试剂盒（上海生工）进行纯化；（4）测定纯化后重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma酶比活。通过纯化以及活性测定，发现重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma的酶比活为61.5 U/mg。
纯化后重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma的特性表征包括酶反应动力学、pH特性和温度特性测定。
重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma反应动力学参数测定如下：（1）配置不同浓度海藻酸钠（1-10mg/mL）作为底物备用；（2）分别测定重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma酶对不同浓度海藻酸钠的水解反应速度；（3）以不同浓度海藻酸钠为横坐标，以重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma对不同浓度底物的水解反应速度为纵坐标，通过软件Graphpad Prism 8进行拟合分析，获得重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma的米氏常数和最大反应速度。重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma米氏常数Km和最大反应速度Vmax分别为2.06mg/mL和76.5µM/min/mg。
pH特性测定包括最适反应pH和pH稳定性。重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma最适反应pH测定如下：在40℃条件下测定重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma在pH4.0-10.0（pH4.0至6.0为0.05M乙酸乙酸钠缓冲液，pH7.0至8.0为0.05M Tris盐酸缓冲液，pH9.0至10.0为甘氨酸-氢氧化钠溶液）下的酶活，以测定酶活最高pH下的酶活为100%，计算其他pH下的相对酶活，实验结果如图1的A所示。由图1的A可知，重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma最适反应pH为7.0，并且在pH为6至8范围内，相对酶活均大于80%。
重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma的pH稳定性测定如下：用不同pH缓冲液稀释酶液至1U/mL到2U/mL之间（pH4.0至6.0为0.05M乙酸乙酸钠缓冲液，pH7.0至8.0为0.05M Tris盐酸缓冲液，pH9.0至10.0为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），在25℃放置6小时后测定剩余酶活，以没有处理的样品酶活设置为100%，计算不同处理温度下的剩余酶活，实验结果如图1的A所示。由图1的A可知，重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma在pH6.0至8.0范围内具有良好的稳定性，在25℃放置6h后，剩余酶活均大于80%；当处理pH降至4.0时，重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma稳定性较差，剩余酶活仅为20.1%。
纯化后重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma的温度特性测定包括最适反应温度和热稳定性。重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma最适反应温度测定如下：
在pH7.0条件下测定纯化后重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma在30℃-55℃不同温度下的酶活，以测定酶活最高温度下的酶活为100%，计算其他温度下的相对酶活。实验结果如图1的B所示。由图1的B可知，重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma最适反应温度为40℃，在35℃至45℃范围内，相对酶活均大于60%。
重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma热稳定性测定如下：将稀释好的酶液（1U/mL到2U/mL之间）在不同温度（30℃至55℃）下热处理60分钟后测定剩余酶活，以没有热处理的样品酶活设置为100%，计算不同处理温度下的剩余酶活，实验结果如图1的B所示。由图1的B可知，重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma在30℃至40℃范围内具有良好的热稳定性，剩余酶活均大于90%。当热处理温度大于40℃，剩余酶活急剧下降，重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma在45℃和50℃，热处理1h后，剩余酶活分别仅为25.3%和10.2%。
实施例3 重组褐藻胶裂解酶Pl7Ma截短突变体构建及筛选
微生物来源的褐藻胶裂解酶具有不同的功能域，通过在线软件分析褐藻胶裂解酶Pl7Ma发现其主要包括3个功能域，分别是糖结合CBM区域（第1位丝氨酸至102位苯丙氨酸）、linker肽段1区域（第103位甘氨酸至152位缬氨酸）、F5/F8 typeC区域（第153位丙氨酸至271位甲硫氨酸）、linker肽段2区域（第272位天冬氨酸至326位天门冬酰胺）和催化区域（第327位苯丙氨酸至593位天门冬酰胺）。为了能够更直观的展现褐藻胶裂解酶Pl7Ma不同功能区域，通过在线三维结构建模软件SWISS-MODEL获得褐藻胶裂解酶Pl7Ma三维构象，如图2所示。
为了探索不同功能域对褐藻胶裂解酶Pl7Ma活性的影响，分别构建2种截短突变体Pl7Ma1（包括F5/F8 typeC区域，linker肽段2区域和催化区域）和Pl7Ma2（只含有催化区域），截短突变体Pl7Ma1和Pl7Ma2的三维构象如图2所示。截短突变体Pl7Ma1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。截短突变体Pl7Ma2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
截短突变体Pl7Ma1和Pl7Ma2所对应表达载体为pPICZαA-pl7Ma1和pPICZαA-pl7Ma2。构建过程主要包括PCR产物扩增和转化大肠杆菌两部分。表达载体pPICZαA-pl7Ma1和pPICZαA-pl7Ma2构建方法相同，只是扩增引物不同。构建突变体Pl7Ma1和Pl7Ma2所对应表达载体pPICZαA-Pl7Ma1和pPICZαA-Pl7Ma2的扩增引物分别为Pl7Ma1-fw、Pl7Ma1-rev，Pl7Ma2-fw、Pl7Ma2-rev。
以表达载体pPICZαA-pl7Ma1为例，PCR产物扩增过程如下：（1）以表达载体pPICZαA-Pl7Ma为模板，通过引物pl7Ma1-fw和pl7Ma1-rev进行PCR扩增，扩增体系如表1所示，扩增条件大致如下：98℃，预变性10s；98℃变性5s，52℃退火20s，72℃延伸20s，扩增33个循环；（2）将获得的PCR扩增产物，通过琼脂糖电泳进行分析，通过胶纯化试剂盒（#DP209-02，购自天根生化科技有限公司）将目标PCR产物进行纯化；（3）将限制性内切酶DpnI加入纯化后的PCR产物，酶解反应2小时后，纯化回收，用于转化实验。纯化过程参照胶纯化试剂盒（#DP209-02）进行。
表1 基因扩增反应体系
将纯化后的PCR产物转入大肠杆菌Top10，转化实验过程如下：（1）将大肠杆菌感受态细胞Top10（深圳辉诺生物技术有限公司）冰上放置20min后，将连接产物（即纯化回收的酶解反应产物）全部转入至大肠杆菌感受态细胞Top10；（2）将含有连接产物的大肠杆菌感受态细胞Top10在42℃热激90s后，冰上静置5min；（3）将热激完的大肠杆菌感受态细胞Top10接入500μL LB培养基中，37℃，200rpm，培养1h，将培养好的菌液均匀涂布于LBZ平板，静置于37℃培养箱中培养18h。
将37℃静置培养获得的阳性转化子进行筛选实验，实验过程大致如下：（1）分别以单菌落的形式将阳性转化子接入LBZ液体培养基，37℃，200rpm，培养1小时后进行菌液PCR；（2）以培养好的菌液为模板，通过引物AOX-fw和AOX-rev进行PCR扩增实验，PCR反应体系如表2所示，反应条件为：94℃预变性3分钟，94℃变性8秒，56℃退火30秒，72℃延伸90秒，33个循环；（3）将菌液PCR验证正确的重组转化子送至广州艾基生物技术有限公司进行测序，根据测序结果最终获得截短突变体Pl7Ma1所对应的表达载体pPICZαA-pl7Ma1。
采取相同的方法，只是将扩增引物换成Pl7Ma2-fw和Pl7Ma2-rev，通过实验最终获得截短突变体Pl7Ma2所对应的表达载体pPICZαA-Pl7Ma2。
表2 菌液PCR反应体系
将截短突变体Pl7Ma1和Pl7Ma2所对应的表达载体pPICZαA-Pl7Ma1和pPICZαA-Pl7Ma2分别线性化转入毕赤酵母X33，转化过程同实施例1。
采用实施例1相同的方法对转化获得重组毕赤酵母转化子进行筛选。通过筛选实验，截短突变体Pl7Ma1和Pl7Ma2分别获得一个酶活优势菌，分别命名为X33- Ma1-26和X33-Ma2-59。重组菌X33- Ma1-26和X33- Ma2-59在500mL摇瓶，诱导培养120小时后，发酵酶活分别为14.2U/mL和17.1U/mL。
采用实施例2相同的方法，分别纯化截短突变体Pl7Ma1和Pl7Ma2。分别对截短突变体Pl7Ma1和Pl7Ma2进行特性表征，包括酶比活、酶反应动力学参数测定、pH特性测定和温度特性测定，实验过程均参照实施例2进行，整个实验过程均以褐藻胶裂解酶Pl7Ma为对照。
截短突变体Pl7Ma1和Pl7Ma2酶比活和酶反应动力学参数如表3所示。由表3可知，相比于出发模板Pl7Ma，截短突变体Pl7Ma1和Pl7Ma2的酶比活均得到提高，其中截短突变体Pl7Ma2提升效果最明显，其酶比活为80.6 U/mg，是出发模板Pl7Ma酶比活的1.31倍。出发模板Pl7Ma和截短突变体Pl7Ma1和Pl7Ma2的米氏常数Km分别为2.06 mg/mL、1.95 mg/mL和1.65 mg/mL，表明短突变体Pl7Ma1和Pl7Ma2具有更好的底物结合能力。此外截短突变体Pl7Ma1和Pl7Ma2的最大反应速度分别为86.9µM/min/mg和105.3µM/min/mg，分别是出发模板Pl7Ma的1.13倍和1.38倍。
表3 截短突变体酶反应动力学参数
截短突变体Pl7Ma1和Pl7Ma2最适反应pH均为7.0，与出发模板Pl7Ma一致，此外在不同pH下的相对酶活也和褐藻胶裂解酶Pl7Ma相近。
截短突变体Pl7Ma1和Pl7Ma2的pH稳定性与出发模板Pl7Ma一致，在pH6.0至8.0范围内具有良好的稳定性，剩余酶活均大于80%。
截短突变体Pl7Ma1和Pl7Ma2最适反应温度与出发模板Pl7Ma一致，均为40℃。此外截短突变体Pl7Ma1和Pl7Ma2的热稳定性也与出发模板Pl7Ma一致，当处理温度大于40℃，剩余酶活急剧下降。
相比于出发模板Pl7Ma，突变体Pl7Ma2酶比活提升1.31倍，但是其热稳定并未得到改善，因此需要进一步提升其热稳定性，为其后续产业化应用奠定基础。
实施例4 二硫键理性设计提升突变体Pl7Ma2热稳定性
通过在线三维结构建模软件SWISS-MODEL对截短突变体Pl7Ma2进行三维建模，从而获得其三维构象，如图3所示。通过在线软件Disulfide by Design和BRIDGED预测分析突变体Pl7Ma2潜在二硫键成键位点。结合Disulfide by Design和BRIDGED预测结果，最终选择8对二硫键突变体进行实验。这8对二硫键突变体分别命名为Pl7Ma2-G45C/T258C、Pl7Ma2-D53C/G251C、Pl7Ma2-R65C/Y243C、Pl7Ma2-E70C/F238C、Pl7Ma2-N88C/Y235C、Pl7Ma2-T112C /A261C、Pl7Ma2-Q126C/N246C和Pl7Ma2-V130C/V255C。根据不同二硫键设计相应的扩增引物。
不同二硫键表达载体构建过程主要包括PCR产物扩增和转化大肠杆菌两部分，实验方法和过程与实施例3中不同截短突变体表达载体构建过程一致。通过实验分别获得8对二硫键突变体所对应的表达载体，分别为pPICZαA-pl7Ma2-CC1（突变体Pl7Ma2-G45C/T258C，所用引物G45C-fw、G45C- rev、T258C-fw和T258C-rev）、pPICZαA-pl7Ma2-CC2（突变体Pl7Ma2- D53C/G251C，所用引物D53C-fw、D53C-rev、G251C-fw和G251C-rev）、pPICZαA-pl7Ma2-CC3（突变体Pl7Ma2-R65C/Y243C，所用引物R65C-fw、R65C- rev、Y243C-fw和Y243C-rev）、pPICZαA-pl7Ma2-CC4（突变体Pl7Ma2-E70C /F238C所用引物E70C-fw、E70C-rev、F238C-fw和F238C- rev）、pPICZαA -pl7Ma 2-CC5（突变体Pl7Ma2-N88C/Y235C，所用引物N88C-fw、N88C-rev、Y235C-fw和Y235C-rev）、pPICZαA-pl7Ma2-CC6（突变体Pl7Ma2-T112C/A261C，所用引物T112C-fw、T112C-rev、A261C-fw和A261C-rev）、pPICZαA-pl7Ma2-CC7（突变体Pl7Ma2-Q126C/N246C，所用引物Q126C-fw、Q126C-rev、N246C-fw和N246C-rev）和pPICZαA-pl7Ma2-CC8（突变体Pl7Ma2-V130C/V255C，所用引物V130C-fw、V130C-rev、V255C-fw和V255C-rev）。
将获得的表达载pPICZαA-pl7Ma2-CC1、pPICZαA-pl7Ma2-CC2、pPICZαA -pl7Ma2-CC3、pPICZαA-pl7Ma2-CC4、pPICZαA-pl7Ma2-CC5、pPICZαA-pl7Ma2 -CC6、pPICZαA -pl7Ma2-CC7和pPICZαA-pl7Ma2-CC8分别线性化转入毕赤酵母X33，转化过程和实施例2一致。
不同二硫键突变体重组酵母工程菌筛选参照实施例1进行。通过筛选测定，8对二硫键突变体所对应重组工程菌最高酶活如表4所示。由表4可知，相比于Pl7Ma2，二硫键突变体所对应的重组工程菌的发酵酶活均有所下降。在8对二硫键突变体中，突变体Pl7Ma2-G45C/T258C对应重组工程菌发酵酶活最高，其在500mL摇瓶，诱导培养120小时后，发酵酶活为15.6U/mL。其次为Pl7Ma2-T112C/A261C和Pl7Ma2-V130C/V255C所对应重组工程菌，分别为14.5U/mL和13.6U/mL。
根据酶活结果，进一步测定酶热稳定性，热稳定性测试方法如下：将8对二硫键突变体发酵酶液用磷酸缓冲液（pH7.0）稀释10倍后，在45℃水浴保温60分钟后进行剩余酶活测定，以没有热处理的样品作为对照。
8对二硫键突变体热稳定性结果如表4所示，由表4可知，理性设计的8对二硫键中，只有突变体Pl7Ma2-T112C/A261C能够显著提升Pl7Ma2热稳定性，45℃水浴保温60分钟后，剩余酶活为42.6%，是出发模板Pl7Ma2的1.68倍。
表4 不同二硫键突变体发酵酶活和热稳定性
为了进一步精确测定二硫键突变体Pl7Ma2-T112C/A261C的热稳定性，参照实施例2中提供的纯化方法，对二硫键突变体Pl7Ma2-T112C/A261C进行纯化。通过实验，获得纯化后的二硫键突变体Pl7Ma2-T112C/A261C。
纯化后二硫键突变体Pl7Ma2-T112C/A261C的热稳定性测定如下：（1）用磷酸缓冲液（pH7.0）将纯化后二硫键突变体Pl7Ma2-T112C/A261C稀释10倍；（2）将稀释后的二硫键突变体Pl7Ma2-T112C/A261C在40℃，45℃，50℃和55℃分别热处理60分钟；（3）测定和计算不同温度处理条件下二硫键突变体Pl7Ma2-T112C/A261C的剩余酶活，整个实验过程以出发模板Pl7Ma2为对照。实验结果如表5所示。
由表5可知，相比于出发模板Pl7Ma2，二硫键突变体Pl7Ma2-T112C/A261C在40℃，45℃，50℃和55℃具有更好的稳定性，热处理60分钟后，剩余酶活分别为98.6%42.6%31.2%和23.2%分别是出发模板Pl7Ma2的1.10倍，1.68倍，3.06倍和4.14倍。
表5 二硫键突变体Pl7Ma2-T112C/A261C不同温度剩余酶活
实施例5 B-factor温度因子优化提升热稳定性
以二硫键突变体Pl7Ma2-T112C/A261C为出发模板，通过优化其B-factor温度因子进一步提升其热稳定性。通过软件B-FITTER分析二硫键突变体Pl7Ma2-T112C/A261C的温度因子，找到其结构内部温度因子值最高的20个氨基酸，这些氨基酸分别是：第6位的色氨酸（W6）、第7位的酪氨酸（Y7）、第8位的亮氨酸（L8）、第9位的丝氨酸（S9）、第10位的缬氨酸（V10）、第21位的天门冬氨酸（D21）、第23位的异亮氨酸（I23）、第25位的谷氨酸（E25）、第28位的亮氨酸（L28）、第32位的酪氨酸（Y32）、第37位的酪氨酸（Y37）、第38位的苯丙氨酸（F38）、第39位的酪氨酸（Y39）、第40位的苏氨酸（T40）、第45位的甘氨酸（G45）、第46位的甲硫氨酸（M46）、第47位的缬氨酸（V47）、第48位的苯丙氨酸（F48）、第49位的精氨酸（R49）和第50位的半胱氨酸（C50）。
根据软件B-FITTER分析结果，本发明拟通过分别构建单点突变体优化温度因子值，从而提升Pl7Ma2-T112C/A261C三维构象稳定性，从而提升其热稳定性。
以二硫键突变体Pl7Ma2-T112C/A261C为出发模板，分别共构建20个单点突变体，包括W6A、Y7A、L8A、S9A、V10A、D21A、I23A、E25A、L28A、Y32A、Y37A、F38A、Y39A、T40A、G45A、M46A、V47A、F48A、R49和C50A。根据二硫键突变体Pl7Ma2-T112C/A261C序列，设计相应单点突变体PCR扩增引物。
20个单点突变体所对应的表达载体分别为pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/W6A（单点突变体W6A）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/Y7A（单点突变体Y7A）、pPICZαA-Pl7Ma2- CC6/L8A（单点突变体L8A）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/S9A（单点突变体S9A）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/V10A（单点突变体V10A）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/D21A（单点突变体D21A）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/I23A（单点突变体I23A）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/E25A（单点突变体E25A）、pPICZαA- Pl7Ma2-CC6/L28A（单点突变体L28A）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/Y32A（单点突变体Y32A）、pPICZαA-Pl7Ma2 -CC6/Y37A（单点突变体Y37A）、pPICZαA-Pl7Ma2 -CC6/F38A（单点突变体F38A）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/Y39A（单点突变体Y39A）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/T40A（单点突变体T40A）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/G45A（单点突变体G45A）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/M46A（单点突变体M46A）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/V47A（单点突变体V47A）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/F48A（单点突变体F48A）、pPICZαA-Pl7Ma2 -CC6/R49A（单点突变体R49A）和pPICZαA-Pl7Ma2 -CC6/C50A（单点突变体C50A）。
不同单点突变体所对应表达载体构建过程与实施例4中不同截短突变体表达载体构建过程一致。只是将扩增模板换成pPICZαA-Pl7Ma2-CC6，扩增引物换成每个单点突变体所对应的引物。通过实验最终获得20个单点突变体所对应的表达载体，pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/W6A（引物为W6A-fw、W6A-rev）、pPICZαA -Pl7Ma2-CC6/Y7A（引物为Y7A-fw、Y7A-rev）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/L8A（引物为L8A-fw、L8A-rev）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/S9A（引物为S9A-fw、S9A -rev）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/V10A（引物为V10A-fw、V10A-rev）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/D21A（引物为D21A -fw、D21A-rev）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/I23A（引物为I23A -fw、I23A-rev）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/E25A（引物为E25A-fw、E25A-rev）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/L28A（引物为L28A-fw、L28A-rev）、pPICZαA-Pl7Ma2 -CC6/Y32A（引物为Y32A-fw、Y32A-rev）、pPICZαA-Pl7Ma2- CC6/Y37A（引物为Y37A-fw、Y37A-rev）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/F38A（引物为F38A-fw、F38A-rev）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/Y39A（引物为Y39A-fw、Y39A-rev）、pPICZαA-Pl7Ma2 -CC6/T40A（引物为T40A-fw、T40A-rev）、pPICZαA-Pl7Ma2- CC6/G45A（引物为G45A-fw、G45A-rev）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/M46A（引物为M46A-fw、M46A-rev）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/V47A（引物为V47A-fw、V47A-rev）、pPICZαA-Pl7Ma2- CC6/F48A（引物为F48A-fw、F48A-rev）、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/R49A（引物为R49A-fw、R49A-rev）和pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/C50A（引物为C50A-fw、C50A-rev）。
分别用限制性内切酶SacI将20个单点突变体所对应的表达载体线性化后，转入毕赤酵母X33，转化子均匀涂布于YPDZ固体平板，30℃，静置培养3至5天。表达载体线性化以及毕赤酵母转化方法，均参照实施例1进行。
不同单点突变体重组酵母工程菌筛选参照实施例1进行。20个单点突变体热稳定性测定参照实施例4描述的方法进行，实验结果如表6所示，由表6可知， 20个单点突变体中，只有突变体L8A、I23A、F38A和V47A可进一步有效提升热稳定性，45℃水浴保温60分钟后，剩余酶活分别为52.3%，50.6%，51.5%和49.8%，分别是Pl7Ma2-T112C/A261C的1.23倍，1.19倍，1.21倍和1.17倍。
表6 不同单点突变体热稳定性
以Pl7Ma2-T112C/A261C-L8A为出发模板，将有效突变体进行组合，分别构建组合突变体Pl7Ma2-T112C/A261C-L8A-I23A、Pl7Ma2-T112C/A261C-L8A- F38A、Pl7Ma2-T112C/A261C-L8A-V47A、Pl7Ma2-T112C/A261C-L8A-I23A- F38A -V47A。
组合突变体Pl7Ma2-T112C/A261C-L8A-I23A、Pl7Ma2-T112C/A261C-L8A- F38A 、Pl7Ma2-T112C/A261C-L8A-V47A和Pl7Ma2-T112C/A261C-L8A-I23A- F38A-V47A对应的表达载体pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/L8A-I23A、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/L8A-F38A、pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/L8A-V47A和pPICZαA-Pl7Ma2-CC6/L8A-I23A-F38A-V47A的构建过程和单点突变体一致，只是将扩增模板换成pPICZαA- pl7ma2-CC6/L8A。
用限制性内切酶SacI将组合突变体所对应的表达载体分别线性化后，转入毕赤酵母X33，转化子均匀涂布于YPDZ固体平板，30℃，静置培养3至5天。表达载体线性化以及毕赤酵母转化方法，均参照实施例1进行。
不同组合突变体重组酵母工程菌筛选参照实施例1进行。组合突变体热稳定性测定参照实施例4描述的方法进行，实验结果如表7所示，由表7可知，4个组合突变体均能进一步提升热稳定性，其中组合突变体Pl7Ma2-T112C/A261C- L8A-I23A-F38A-V47A效果最明显，45℃水浴保温60分钟后，剩余酶活为79.5%。
为了便于书写，将组合突变体Pl7Ma2-T112C/A261C-L8A-I23A-F38A-V47A简称为突变体Pl7MaM，其对应的表达载体简写为pPICZαA-Pl7MaM。
此外参照实施例3相同的方法获得突变体Pl7MaM三维构象，如图3所示。
表7 不同组合突变体热稳定性
实施例6 突变体Pl7MaM纯化及特性测定
突变体Pl7MaM纯化过程参照实施例2进行，通过实验，获得纯化后的突变体Pl7MaM。突变体Pl7MaM特性测定包括pH特性测定和温度特性测定。
突变体Pl7MaM的pH特性测定包括最适反应pH和pH稳定性，测定方法参照实施例2进行，整个实验过程以Pl7Ma作为对照。
突变体Pl7MaM最适反应pH与Pl7Ma的最适反应pH均为7.0，在pH6.0至8.0范围内相对酶活均大于80%。此外突变体Pl7MaM的pH稳定性也与Pl7Ma一致，在pH6.0至9.0范围内，25℃放置6小时后，剩余酶活均大于80%。
突变体Pl7MaM的温度特性测定包括最适反应温度和热稳定性，测定方法参照实施例2进行，整个实验过程以Pl7Ma作为对照。实验结果如图4所示。
由图4的A可知，突变体Pl7MaM最适反应温度为45℃，相比于Pl7Ma，最适反应温度提升5℃。此外突变体Pl7MaM在高温条件下具有更好的酶活力，在50℃和55℃条件下，相对酶活分别为89.6%和68.5%，而Pl7Ma在在50℃和55℃条件下的相对酶活分别为32.3%和12.2%。
由图4的B可知，相比于Pl7Ma，突变体Pl7MaM具有更好的热稳定性。突变体Pl7MaM在45℃、50℃和55℃，热处理60分钟后，剩余酶活分别为79.5%、49.3%和36.5%。而Pl7Ma在45℃、50℃和55℃，热处理60分钟后，剩余酶活分别仅为25.3%，10.2%和5.6%。
实施例7 突变体Pl7MaM在毕赤酵母高效表达
高效表达突变体Pl7MaM能够有效降低其生产成本，为后期产业化应用奠定基础。本发明以毕赤酵母X33为宿主，实现突变体Pl7MaM高效制备。
将表达载体pPICZαA-Pl7MaM线性化后转入毕赤酵母，转化方法（即电转化法）参照实施例1进行，将电转后的转化子涂布于高浓度YPDZ平板（大于400mg/L zeocin）上；采用24孔板法挑选96个重组转化子进行初步筛选，筛选方法参照实施例1描述的筛选方法进行；将初步筛选获得的高酶活转化子进行摇瓶培养复筛，培养时间为120小时。
通过筛选，从96个重组转化子获得一个酶活优势菌，命名为P28。重组工程菌P28在摇瓶培养条件下，最高发酵酶活为16.8 U/mL。
将摇瓶筛选获得的重组工程菌P28进行高密度发酵。重组工程菌的高密度发酵在7L发酵罐中进行，具体过程大致如下：将单菌落重组酵母工程菌接入含有50mL YPD培养基的250mL三角瓶中，30℃，200 rpm振荡培养16h。再将过夜培养的重组酵母工程菌按1 %（v/v）的接种量接入含有100mL YPD培养基的500mL三角瓶中，30℃，200rpm振荡过夜培养，至OD600大于10。将二次过夜培养的重组酵母工程菌按10 %（v/v）的接种量接入含有3L BSM培养基的7L发酵罐中。重组酵母工程菌在7L发酵罐的培养条件为：温度为30℃、pH值5.0、搅拌速度为500rpm、空气流量为40L/min。培养初期，以甘油作为碳源供菌体生长。当菌体湿重达到一定的量（160g/L至180g/L），停止流加甘油，待甘油被菌体吸收完后（溶氧迅速上升）开始用0.5%的甲醇诱导。发酵过程中每隔24小时测定酶活和总蛋白。
重组工程菌P28发酵过程曲线如图5的A所示，当诱导培养至168小时，发酵酶活达到425.6U/mL。由蛋白电泳分析（图5的B）可知，不同诱导时间发酵上清液中含有很少杂蛋白，基本以重组突变体Pl7MaM为主。此外根据蛋白标品分子量推断，重组突变体Pl7MaM分子量大小约为45kDa，比理论值要大，可能和糖基化修饰有关，前期许多研究表明异源蛋白在毕赤酵母重组表达，在蛋白加工后期容易经过不同的糖基化修饰，从而目标重组蛋白比理论计算值要大。
实施例8 突变体Pl7MaM酶法制备海藻寡糖
采取单因素实验优化突变体Pl7MaM制备海藻寡糖酶法工艺。单因素实验，包括底物含量的优化、酶添加量优化、反应pH优化、反应温度优化、反应时间优化。实验过程大致如下：（1）将不同浓度（1%至3%，w/v）海藻酸钠溶于pH7.0磷酸缓冲液中；（2）取海藻酸钠溶液50mL加入250mL摇瓶，加入突变体Pl7MaM（1U/mL至4U/mL）；（3）在不同温度下（30℃至45℃），转速200rpm，反应不同时间（1小时至3小时）后进行水解率测定。
水解率的测定大致如下：（1）首先取1 mL反应结束后的海藻寡糖溶液至2mL离心管；（2）其次将海藻寡糖溶液分别用水稀释50倍、100倍、150倍、200倍；（3）分别从稀释后的海藻寡糖溶液取400 μL至2mL离心管中，各加入600μL DNS显色剂，在100℃沸水浴10分钟进行显色；（4）待显色后的溶液冷却至室温，20分钟后，离心，取上清在540nm下测定吸光值，根据吸光值计算海藻寡糖浓度；（5）水解率的计算如下：水解率=100-100×（理论海藻酸钠质量-反应后海藻寡糖质量）/理论海藻酸钠质量。
首先进行底物含量的优化，海藻酸钠质量分别设置为1%、2%和3%，酶添加量为1U/mL，反应温度为40℃，反应pH为7.0，200rpm，反应时间为2小时。实验结果如图6的A所示，由图6的A可知，底物含量越高，水解率越低，1%、2%和3%底物含量所对应的水解率分别为65.2%、51.3%和36.1%。综合考虑分析，最终选择底物含量为2%进行下一步的实验。
在底物含量实验结果基础上进行酶添加量的优化，酶添加量分别设置为1U/mL、2U/mL、3U/mL和4U/mL。底物含量2%，反应温度为40℃，反应pH为7.0，200rpm，反应时间为2小时，实验结果如图6的B所示。由图6的B可知，随着酶添加量的增加，水解率逐渐增加，当酶添加量为3U/mL时，水解率最高为75.3%。酶添加量1U/mL、2U/mL和4U/mL的水解率分别为51.3%、69.8%和72.6%。从用酶成本角度考虑，最终选择酶添加量为2U/mL。
在底物含量和用酶量的基础上进行反应温度优化，反应温度分别设置为30℃、35℃、40℃和45℃。底物含量2%，酶添加量2U/mL，反应pH7.0，200rpm，反应时间为2小时，实验结果如图6的C所示。由图6的C可知，反应温度45℃时效果最好，水解率达到78.3%。因此选择45℃进行下一步的实验。
在底物含量、用酶量以及最适反应温度的基础上进行反应时间优化，反应时间设置为1小时、2小时和3小时。底物含量2%，酶添加量2U/mL，反应pH7.0，反应温度45℃，200rpm，实验结果如图6的D所示。由图6的D可知，反应3小时效果最好，多肽生成率为90.5%，其次为2小时，多肽生成率78.4%。
最后，需要说明的是，上述实施例仅例示性说明本发明的原理、性能及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (9)
1. 一种褐藻胶裂解酶突变体Pl7MaM，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶突变体Pl7MaM的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
2. 如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶突变体Pl7MaM，其特征在于，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列，所述多聚核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
3.一种如权利要求1-2任一项所述褐藻胶裂解酶突变体Pl7MaM的制备方法，其特征在于，制备过程如下：以褐藻胶裂解酶Pl7Ma为出发模板，首先通过截短不同蛋白功能模块获得Pl7Ma2；然后以Pl7Ma2为模板，通过结合二硫键和温度因子优化两种蛋白质理性设计策略，即得Pl7MaM。
4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶Pl7Ma的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Pl7Ma2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，编码所述褐藻胶裂解酶Pl7Ma的氨基酸序列的多聚核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述Pl7Ma2的氨基酸序列的多聚核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
6.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求2所述褐藻胶裂解酶突变体Pl7MaM的多聚核苷酸序列。
7.一种重组工程菌，其特征在于，包括权利要求6所述的重组表达载体，所述重组工程菌为毕赤酵母工程菌。
8.如权利要求7所述的重组工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母工程菌包括毕赤酵母X33。
9.一种如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶突变体Pl7MaM在制备海藻寡糖中的应用。
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