CN116676296A - 酶活提高的β-1,3-葡聚糖酶突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了酶活提高的β‑1,3‑葡聚糖酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明利用定点突变技术对野生型β‑1,3‑葡聚糖酶Bc16编码基因进行分子改造，得到了一系列突变体酶Bc16Q71K、Bc16G128M、Bc16N198Q、Bc16R106K、Bc16M120L、Bc16K87R、Bc16A151T。本发明所述的定点突变改造的β‑1,3‑葡聚糖酶正向突变体与野生酶相比其酶活力提高了1.38～1.62倍，优化改良了野生型的β‑1,3‑葡聚糖酶的酶活，为该酶在实际应用中创造更好的使用条件。
Description
技术领域
本发明涉及酶活提高的β-1,3-葡聚糖酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,EC3.2.1.39)简称β-1,3-GA，是一类能特异作用于β-葡聚糖中β-1,3-糖苷键的酶系，可用于β-1,3-葡寡糖的生产。β-1,3-葡聚糖酶广泛存在于细菌、真菌、植物和无脊椎动物中。不同来源的β-1,3-GA分子量范围，最适pH、最适温度等酶学性质具有明显的差异。
目前，β-1,3-GA主要被研究用于β-1,3-葡寡糖的生产，具有转化率高、过程控制简单、反应条件温和、原材料丰富等优势。然而，目前已从真菌、细菌以及放线菌等中分离得到的产β-1,3-葡聚糖酶的大多数菌株内切酶活性和比例依然较低。因此，寻找催化效率更高、安全稳定的β-1,3-葡聚糖酶成为通过酶高效制备β-1,3-葡寡糖从而提高其应用价值的关键策略。
发明内容
为了解决上述问题，本发明通过对Alkalihalobacillus clausii来源的登录号为WP_095336276.1的β-1,3-葡聚糖酶基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)进行分子改造，运用定点突变技术获得比酶活显著提高的β-1,3-葡聚糖酶突变体。
本发明提供了一种β-1,3-葡聚糖酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的β-1,3-葡聚糖酶的第71位，第128位，第198位，第106位，第120位，第87位，第151位的氨基酸中的一个或多个进行突变得到的。
在一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-1,3-葡聚糖酶的第71位谷氨酰胺，第128位甘氨酸，第198位天冬氨酸，第106位精氨酸，第120位甲硫氨酸，第87位赖氨酸或第151位丙氨酸进行突变得到的。
在一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-1,3-葡聚糖酶的第71位谷氨酰胺突变为赖氨酸，获得突变体Q71K，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-1,3-葡聚糖酶的第128位甘氨酸突变为甲硫氨酸，获得突变体G128M，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-1,3-葡聚糖酶的第198位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，获得突变体N198Q，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-1,3-葡聚糖酶的第106位精氨酸突变为赖氨酸，获得突变体R106K，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-1,3-葡聚糖酶的第120位甲硫氨酸突变为亮氨酸，获得突变体M120L，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-1,3-葡聚糖酶的第87位赖氨酸突变为精氨酸，获得突变体K87R，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-1,3-葡聚糖酶的第151位丙氨酸突变为苏氨酸，获得突变体A151T，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明还提供了编码所述突变体的基因。
在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10～16所示。
本发明还提供了携带所述基因的重组质粒。
在一种实施方式中，所述重组质粒包括但不限于pET系列质粒。
在一种实施方式中，所述pET系列质粒包括pET-28a或pET-22b。
本发明还提供了表达所述突变体的重组微生物细胞。
在一种实施方式中，所述重组微生物细胞包括但不限于细菌或真菌。
在一种实施方式中，所述微生物为大肠杆菌。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET-28a为载体。
本发明还提供一种提高β-1,3-葡聚糖酶酶活的方法，所述方法是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-1,3-葡聚糖酶基因的第71位谷氨酰胺，第128位甘氨酸，第198位天冬氨酸，第106位精氨酸，第120位甲硫氨酸，第87位赖氨酸，或第151位丙氨酸进行突变。
在一种实施方式中，所述方法是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-1,3-葡聚糖酶的第71位谷氨酰胺突变为赖氨酸，或将第128位甘氨酸突变为甲硫氨酸，或将第198位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，或将第106位精氨酸突变为赖氨酸，或将第120位甲硫氨酸突变为亮氨酸，或将第87位赖氨酸突变为精氨酸，或将第151位丙氨酸突变为苏氨酸。
本发明还提供了一种制备β-1,3葡寡糖的方法，所述方法为以β-葡聚糖为底物，利用上述β-1,3-葡聚糖酶突变体催化生成β-1,3-葡寡糖。
本发明还提供所述β-1,3-葡聚糖酶突变体或上述基因或上述重组质粒或上述重组微生物或上述方法在β-1,3-葡寡糖生产方面的应用。
有益效果：
本发明以Alkalihalobacillus clausii来源的β-1,3-葡聚糖酶为亲本酶进行分子改造，对第71位，第128位，第198位，第106位，第120位，第87位或第151位的氨基酸进行了突变，获得了一系列酶活提高的突变体。本发明提供的一系列β-1,3-葡聚糖酶突变体酶活相比于野生酶均有了明显的提高，突变后的酶仍保持着适中的pH，且酶活可达1411.05U/mg,1438.09U/mg,1467.15U/mg,1500.72U/mg,1559.21U/mg,1614.46U/mg,1653.71U/mg，相比于野生型酶活提高了1.38～1.62倍。本发明优化改良了野生型的β-1,3-葡聚糖酶的酶活，为该酶在实际应用中创造更好的使用条件。
附图说明
图1为重组质粒的构建图谱。
图2为野生酶BC16和突变酶的相对酶活。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过已知方法制备。
(一)培养基
培养基均使用ddH2O配制，配制完成后121℃灭菌15～20min。
LB液体培养基：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L。
LB固体培养基：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L、琼脂粉15g/L。
(二)β-1,3-葡聚糖酶酶活检测方法
酶活测定条件：反应体系包括50μL稀释200倍纯化的发酵液或破碎的上清液，950μL浓度为10mg/mL的可得然多糖溶液(pH＝7.0)，于70℃条件下反应10min，煮沸20min灭酶。离心后用DNS法测定产物浓度。
酶活定义：在上述反应条件下：每分钟生成1μmol的葡萄糖所需要的量。
其中，β-1,3葡聚糖酶的酶活计算公式如下：
(三)缓冲液
磷酸盐缓冲液(PB)：50mmol/L，pH 7.0；
Binding Buffer：50mmol/L PB，500mmol/LNaCl，pH 7.0；
Washing Buffer：50mmol/L PB，500mmol/LNaCl，pH 7.0，20mmol/L咪唑；
Elution Buffer：50mmol/LPB，500mmol/LNaCl，pH 7.0，500mmol/L咪唑；
透析缓冲液：50mmol/L PB，pH 7.0，10mmol/LEDTA。
材料与试剂：所用的限制性内切酶、Dpn I酶PCR试剂等均购于TaKaRa生物公司；引物购自安生达生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒、琼脂糖纯化试剂盒、E.coil DH5α、E.coil BL21(DE3)菌株均购于生工生物工程(上海)有限公司；其他试剂均为国内或国外购买的分析纯试剂。
实施例1：β-1,3-葡聚糖酶突变位点的设计
多序列比对结合在线服务器HotSpot Vizard(https://loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard/)选择突变位点；利用SWISS-MODEL软件对β-1,3-葡聚糖酶蛋白结构进行模拟，获得β-1,3-葡聚糖酶的三级结构模型。确定要突变的氨基酸位点为第71位谷氨酰胺，第128位甘氨酸，第198位天冬氨酸，第106位精氨酸，第120位甲硫氨酸，第87位赖氨酸，第151位丙氨酸，第149位甘氨酸，第181位谷氨酸。
实施例2：β-1,3-葡聚糖酶的定点突变及重组质粒、重组大肠杆菌的构建
(1)构建野生型质粒
微生物Alkalihalobacillus clausii来源的β-1,3-葡聚糖酶基因登录号：WP_095336276.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-1,3-葡聚糖酶编码基因构建至质粒载体pET-28a的NdeI和BamHI酶切位点之间，构建得到重组质粒，并命名为pET-28a-Bc16。
(2)构建突变体质粒
根据SEQ ID NO.1所示的Alkalihalobacillus clausii来源的编码Bc16的基因进行引物设计，以步骤(1)中构建的pET-28a-Bc16为模板进行定点突变构建突变质粒：
Q71K-F:GCACAAGGAGACAGTTAGCGACC；
Q71K-R:GTCTCCTTGTGCGCCTCGATGATCAG；
G128M-F:ATCGCTACGGCATGTGGGCAGCGAGCGGCGAG；
G128M-R:CCACATGCCGTAGCGATCGTGCTGCGGCATCA；
N198Q-F:GTGGACGGCCAATTATATTTGACCCTGAATGATTGGTAC；
N198Q-R:TATAATTGGCCGTCCACATACCATCTGATCTC；
R106K-F:AGCGCGTATGAAGTTGCCGGCGGGCCAGGGTT；
R106K-R:GCAACTTCATACGCGCTTCAAAGCGGCCATAG；
M120L-F:TTTGGATGCTGCCGCAGCACGATCGCT；
M120L-R:GGCAGCATCCAAAACGCTGGCCAAA；
K87R-F:GGTAGAGTTCTGACCGACGGTC；
K87R-R:GTCAGAACTCTACCAGAGGTGTAACCGTAC；
A151T-F:TGGGACCATTCATTATGGTGGCCC；
A151T-R:AATGAATGGTCCCACCCACCTTGTGC；
其中下划线部分代表突变体基因编码的第71位谷氨酰胺，第128位甘氨酸，第198位天冬氨酸，第106位精氨酸，第120位甲硫氨酸，第87位赖氨酸，第151位丙氨酸，所对应的密码子。
表1PCR扩增体系
PCR扩增后，向反应液中加入2μL DpnⅠ限制性内切酶(10U/μL)，在37℃下保温2h消除模板。将PCR产物转化至E.coil DH5α细胞中，涂布LB平板，挑取单菌落到LB液体培养基，提取质粒，经测序得到正确突变质粒pET-28a-Bc16Q71K、pET-28a-Bc16G128M、pET-28a-Bc16N198Q、pET-28a-Bc16R106K、pET-28a-Bc16M120L、pET-28a-Bc16K87R、pET-28a-Bc16A151T。将构建成功的突变质粒和步骤(1)的野生型质粒分别转化入E.coil BL21(DE3)中，得到突变株BL21(DE3)/pET-28a-Bc16Q71K、BL21(DE3)/pET-28a-Bc16G128M、BL21(DE3)/pET-28a-Bc16N198Q、BL21(DE3)/pET-28a-Bc16R106K、BL21(DE3)/pET-28a-Bc16M120L、BL21(DE3)/pET-28a-Bc16K87R、BL21(DE3)/pET-28a-Bc16A151T和表达野生型酶的菌株BL21(DE3)/pET-28a-Bc16。
实施例3：野生酶和突变酶的表达纯化
挑取实施例2中制备的BL21(DE3)/pET-28a-Bc16和各突变株单菌落于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min培养12h后，转接至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在37℃、200r/min培养至OD600在0.5～0.7范围内，加入1mmol/L的IPTG在16℃、200r/min条件下诱导24h，收集发酵液。
直接测定发酵液的酶活，结果显示，野生酶的发酵酶活为82.08U/mL，Q71K发酵酶活为71.51U/ml，G128M发酵酶活为93.20U/mL，N198Q发酵酶活为66.08U/mL，R106K发酵酶活为77.36U/mL，M120L发酵酶活为84.49U/mL，K87R发酵酶活为112.11U/mL，A151T发酵酶活为85.70U/mL。
将收集的发酵液在6000r/min、4℃下离心10min后，弃上清，用磷酸盐缓冲液洗涤两次，加入15mL磷酸盐缓冲液使菌体悬浮，超声破碎15min(功率30％，破碎1s，间歇2s)。在4℃、8000r/min条件下离心10min，收集上清液，即为粗酶液，用孔径0.22μm水系膜过滤。用Binding Buffer对Ni2+螯合琼脂糖树脂柱进行预平衡；加入粗酶液，分别用Binding Buffer和Washing Buffer平衡；用Elution Buffer将酶洗脱下来，回收；将回收的酶液在透析缓冲液中透析后于4℃冰箱中保存。
在此条件下，将原始酶酶活定义为100％，并以相对酶活的百分比对突变体种类作图，评价酶活性得到的结果如图2，相比野生酶Bc16的比酶活1020.01U/mg，突变体的比酶活分别为：Q71K为1411.05U/mg、G128M为1438.09U/mg、N198Q为1467.15U/mg、R106K为1500.72U/mg、M120L为1559.21U/mg，K87R为1614.46U/mg，A151T为1653.71U/mg。
对比例1：
按照实施例1～3相同的策略，筛选得到保守位点G149和E181，并分别构建突变体G149L、E181T，质粒pET-28a-ADIG149L、pET-28a-ADIE181T，并构建重组菌BL21(DE3)/pET-28a-ADIG149L、BL21(DE3)/pE T-28a-ADIE181T；按照实施例3相同的方法培养重组菌，并分别检测粗酶液和纯化后的比酶活，结果显示，几乎检测不到G149L和E181T的粗酶活和比酶活，表明突变体G149L和E181T丧失了酶活，G149和E181是该酶具有催化能力的重要残基，经过突变后酶活没有得到提高反而丧失了酶活。
G149L-F:TGCTTGGGGCCATTCATTATGGTGGCCCTTGGC；
G149L-R:AATGAATGGCCCCAAGCACCTTGTGCGGGGTCGC；
E181T-F:GCCACCGATTACCATACATATGCAGTTGAATGGGAGCCG；
E181T-R:TGTATGGTAATCGGTGGCGTTCGTACCAGACGG。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.β-1,3-葡聚糖酶突变体，其特征在于，在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-1,3-葡聚糖酶的基础上，进行了如下至少一种突变：
(1)将第151位丙氨酸突变为苏氨酸；
(2)将第87位赖氨酸突变为精氨酸；
(3)将第120位甲硫氨酸突变为亮氨酸；
(4)将第106位精氨酸突变为赖氨酸；
(5)将第198位天冬氨酸突变为谷氨酰胺；
(6)将第128位甘氨酸突变为甲硫氨酸；
(7)将第71位谷氨酰胺突变为赖氨酸。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。
4.表达权利要求1所述突变体或携带权利要求3所述重组质粒的重组微生物细胞。
5.根据权利要求4所述的重组微生物细胞，其特征在于，重组微生物细胞为细菌或真菌。
6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物细胞为大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET-28a为载体。
8.一种提高β-1,3-葡聚糖酶酶活的方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-1,3-葡聚糖酶的第151位丙氨酸突变为苏氨酸，第128位甘氨酸突变为甲硫氨酸，第198位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，第106位精氨酸突变为赖氨酸，第120位甲硫氨酸突变为亮氨酸，第87位赖氨酸突变为精氨酸，或第71位谷氨酰胺突变为赖氨酸。
9.一种制备β-1,3葡寡糖的方法，其特征在于，所述方法为以β-葡聚糖为底物，利用权利要求1所述的β-1,3-葡聚糖酶突变体催化生成β-1,3-葡寡糖。
10.权利要求1所述的β-1,3-葡聚糖酶突变体或权利要求2所述基因或权利要求3所述重组质粒或权利要求4～7任一所述重组微生物或权利要求9所述方法在β-1,3-葡寡糖生产方面中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN117511918A (zh) * | 2023-11-16 | 2024-02-06 | 山东弥美生物科技股份有限公司 | 一种β-1,3-葡聚糖酶突变体及其应用 |
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2023
- 2023-06-08 CN CN202310673793.2A patent/CN116676296A/zh active Pending
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