CN110938616A

CN110938616A - 一种温泉热碱芽孢杆菌来源的腈水合酶的突变体

Info

Publication number: CN110938616A
Application number: CN201911050011.XA
Authority: CN
Inventors: 周哲敏; 刘中美; 李婷; 陈德智; 张赛兰; 周丽; 崔文璟; 程中一; 郭军玲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-10-31
Filing date: 2019-10-31
Publication date: 2020-03-31
Anticipated expiration: 2039-10-31
Also published as: CN110938616B

Abstract

本发明公开了一种温泉热碱芽孢杆菌来源的腈水合酶的突变体，属于酶工程技术领域。本发明提供的腈水合酶突变体Cal.t Nhase‑A20V在70℃的半衰期大约是10min，相比野生酶热稳定性并未有太大变化，突变体Cal.t Nhase‑A20V的比酶活是野生酶的128％。同时该突变体也具备了更好的底物耐受性和产物耐受性，全细胞催化生成烟酰胺最终产量达到598g/L；因此，本发明提供的腈水合酶突变体Cal.t Nhase‑A20V，具有很好的酶学性质，有利于以后的工业生产。

Description

一种温泉热碱芽孢杆菌来源的腈水合酶的突变体

技术领域

本发明涉及一种温泉热碱芽孢杆菌来源的腈水合酶的突变体，属于酶工程技术领域。

背景技术

腈水合酶(NHase)可用于催化3-氰基吡啶为药用价值更高的烟酰胺，烟酰胺是一种维生素，已经被广泛地用于饲料、食品、制药等行业。烟酰胺市场需求量很大，但目前我国烟酰胺的生产水平不高，规模不大。因此，将NHase用于烟酰胺的生产有很大潜力。但是，该反应是一个放热的过程，所以生产过程中高温会影响酶活的发挥，主要是温度高，影响酶的结构，导致酶活下降，进而导致了大量的能耗，提高了生产成本。同时腈水合酶的底物和产物都是有机物，高浓度的有机物对酶的结构会产生较大的破坏作用，使酶活急速降低，催化活性下降，所以，在生产催化过程中，提高腈水合酶底物产物耐受性尤为重要。

目前工业生产中主要用玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J1催化生成烟酰胺，采用的是底物分批补料的方式，但是红球菌生长周期较长，需要100h，并且生产效率不高，烟酰胺产量最高为162g/L，而丙烯酰胺产量最高为300g/L。目前也有通过重组菌生产烟酰胺的报道，但终产物浓度较低，只有240g/L。因此，获得一株高效且有机溶剂耐受性较好的腈水合酶对于烟酰胺工业化生产具有重要的应用价值。

发明内容

本发明旨在提供一种产物耐受性和底物耐受性都提高的腈水合酶突变体及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种腈水合酶突变体，含有β亚基、α亚基以及调控蛋白，其分别含SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的载体。

本发明的第四个目的是提供表达所述腈水合酶突变体的细胞。

本发明的第五个目的是提供一种基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达上述的腈水合酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌BL21为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET系列质粒为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET24a(+)。

本发明的第六个目的是提供一种提高腈水合酶酶活力的方法，所述方法是将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的腈水合酶α亚基第20位丙氨酸突变为缬氨酸。

本发明的第七个目的是提供一种重组表达所述腈水合酶突变体的方法，将表达所述腈水合酶突变体的基因工程菌接种于LB培养基中，35-37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG于20-30℃诱导12-18h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述基因工程菌接种于含卡那霉素的LB表达培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至0.1mM，Co²⁺至0.1mg/L，25℃诱导12-18h，表达腈水合酶突变酶。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括收集所述基因工程菌的菌体，将菌体破碎后收集上清，将上清膜过滤后，用Strep Trap HP柱分离得到腈水合酶突变体。

本发明还提供所述腈水合酶突变体及所述基因工程菌在制备含有烟酰胺的产品中的应用。

有益效果：本发明提供的腈水合酶突变体Cal.t Nhase-A20V在70℃的半衰期大约是 10min，相比野生酶热稳定性并未有太大变化，突变体Cal.t Nhase-A20V的比酶活为650

U/mg，是野生酶的128％。同时该突变体也具备了更好的底物耐受性和产物耐受性，全细胞催化生成烟酰胺最终产量达到598g/L；因此，本发明提供的腈水合酶突变体Cal.t Nhase-

A20V，具有很好的酶学性质，有利于以后的工业生产。

附图说明

图1：野生酶和突变酶Cal.t Nhase-A20V 70℃下处理10min的热稳定性。

图2：野生酶和突变酶Cal.t Nhase-A20V在不同浓度底物3-氰基吡啶浓度下的底物耐受性。

图3：野生酶和突变酶Cal.t Nhase-A20V在不同浓度产物烟酰胺浓度下的产物耐受性。

图4：不同反应时间下，产物烟酰胺的浓度变化。

具体实施方式

酶活的定义(U)：每分钟转化3-氰基吡啶生成1μmol/L烟酰胺所需的酶量定义为1U。

比酶活(U/mg)：每毫克NHase的酶活。

相对酶活的定义：突变酶在pH＝7.4，温度为30℃反应10min测得的酶活定义为100％。

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，NaCl 10g/L。

腈水合酶反应体系：底物为490μL 200mM的3-氰基吡啶，加入浓度为0.5mg/mL的纯酶溶液10μL或OD₆₀₀＝8的菌液10μL在30℃的温度下反应10min后用500μL乙腈终止反应，并离心去除沉淀，取上清过0.22μm的膜后作为液相测定的样品。

腈水合酶的检测：用HPLC检测，流动相为水：乙腈＝1:2；检测波长210nm，流速为0.6 mL/min；色谱柱为C18柱。

温度稳定性的确定：将野生酶和突变体在pH＝7.4的KPB缓冲液中，70℃分别处理10min， 30min后测定残留酶活，未处理的酶的酶活定义为100％，得到热稳定性结果。

底物耐受性的确定：将野生酶和突变体稀释在pH＝7.4的KPB缓冲液中成为OD₆₀₀＝8的菌液，30℃分别在0M、1M的3-氰基吡啶的浓度下30℃孵育30分钟后测定残留酶活，得到底物耐受性结果。

产物耐受性的确定：将野生酶和突变体稀释到pH＝7.4的KPB缓冲液中成为OD₆₀₀＝8的菌液，30℃分别在0M、1M、2M的烟酰胺的浓度下孵育30分钟后测定残留酶活，得到产物耐受性结果。

实施例1

将来源于嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)来源的腈水合酶(PtNHase)与来源于温泉热碱芽孢杆菌(Caldalkalibacillus thermarum)Cal.t NHase进行动力学模拟发现，某些氨基酸RMSF值较大，推测这些氨基酸可能影响其热稳定性。因此，构建了以下几个突变体：Cal.t NHase-A20V，Cal.t NHase-H150S(将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β亚基第150位的组氨酸突变为丝氨酸)，Cal.t NHase-T104A(将氨基酸序列如SEQID NO.2所示的β亚基第104位的苏氨酸突变为丙氨酸)，Cal.t NHase-S152K(将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β亚基第152位的丝氨酸突变为赖氨酸)，Cal.t NHase-K185A(将氨基酸序列如 SEQ ID NO.2所示的β亚基第185位的赖氨酸突变为丙氨酸)。

(1)突变体的构建：

合成Cal.t-NHase基因(如SEQ ID NO.1所示)，并将该基因克隆于pET24a质粒的Nde Ⅰ和EcoRⅠ酶切位点处，由苏州金唯智完成，获得pET24a-Cal.t NHase重组质粒。以pET24a- Cal.t NHase为模版，用表1所示引物在表2所示条件下PCR，PCR产物转化E.coliJM109后苏州金唯智测序，将测序结果正确的质粒重新获得携带编码突变体基因的重组质粒pET24a- NHase-A20V，pET24a-Cal.t Nhase-H150S，pET24a-Cal.t Nhase-T104A，pET24a-Cal.t Nhase- S152K，pET24a-Cal.t Nhase-K185A，将重组质粒转化E.coli BL21菌株进行表达，获得重组菌株。

表1引物

表2全质粒PCR扩增反应体系

PCR扩增反应条件为：

PCR产物用琼脂糖凝胶电泳方法鉴定。然后将PCR产物纯化、消化后转入大肠杆菌BL21感受态细胞。

(2)将步骤(1)得到的重组大肠杆菌BL21/pET24a-Cal.t NHase-A20V，BL21/pET24a- Cal.t Nhase-H150S，BL21/pET24a-Cal.t Nhase-T104A，BL21/pET24a-Cal.tNhase-S152K， BL21/pET24a-Cal.t Nhase-K185A接种于5mL卡那霉素浓度为50μg/mL的LB培养基 (蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L)，37℃、200r/min振荡过夜培养。

将上述过夜培养物按1％(v/v)的接种量接种于含卡那霉素浓度为50μg/mL的100mL LB表达培养基(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L)中，37℃、200r/min 振荡培养至OD₆₀₀至0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至0.1mM，Co²⁺至0.1mg/L，25℃诱导 12-18h得到菌体，12000rpm的转速离心收菌。

(3)将重组菌体用结合缓冲溶液(20mmol/L Na₂HPO₄、280mmol/L NaCl、6mmol/LKCl)浓缩5倍，超声破碎，12000rpm离心40min，上清用0.22μm滤膜过滤。用10倍柱体积的结合缓冲溶液平衡1mL的strep Trap HP柱，用15倍柱体积的结合缓冲溶液洗去非特异性吸附的蛋白，用8倍柱体积的20mM Na₂HPO₄，280mM NaCl，6mM KCl，2.5mM 脱硫生物素缓冲液洗脱蛋白，收集样品并用SDS-PAGE分析鉴定。

实施例2

在500μL缓冲反应体系中加入0.5mg/mL实施例1纯化后的突变酶10μL，于70℃金属浴中分别处理0min、10min、20min、30min，测定残留酶活，其中，处理0min的酶活定为100％。

如图1所示，发现突变体在70℃下处理10min，突变酶Cal.t NHase-H150S的酶活急剧下降，其他突变酶相较于野生型并未有太大变化，在后续研究中不研究Cal.t NHase-H150S突变酶的性质。

实施例3

配制不同浓度的产物烟酰胺溶液：0M、2M，将OD₆₀₀＝8野生酶和突变体菌液分别在不同底物浓度的溶液中30℃处理30min后用KPB重悬清洗两次细胞，取10μL测定残余酶活，用0M处理的酶活定义为100％。

如图2所示，不用产物处理时的酶活定义为100％，发现突变体在2M的产物烟酰胺下处理20min后，突变酶Cal.t Nhase-A20V的剩余酶活由野生酶的40％提高到69％，而其余突变酶Cal.t NHase-H150S，Cal.t NHase-T104A，Cal.t NHase-S152K，Cal.t NHase-K185A的剩余酶活，相较于野生酶，均出现了不同程度的下降。突变酶Cal.t Nhase-A20V产物耐受性有明显提高，选定Cal.t Nhase-A20V突变酶做后续研究。

实施例4

配制不同浓度的底物溶液：0M、1M，将OD₆₀₀＝8野生酶和突变体菌液分别在不同底物浓度的溶液中30℃处理30min后用KPB重悬清洗两次细胞，取10μL测定残余酶活，用0 M处理的酶活定义为100％。

如图3所示，0M的底物处理时的酶活定义为100％，发现突变体在1M的底物3-氰基吡啶下30℃处理30min后，突变体的残余酶活由野生酶的52％提高到72％，突变体的底物耐受性有明显的提高。

实施例5

将实施例1步骤(2)中得到的BL21/pET24a-Cal.t NHase-A20V菌液离心收集，水洗后再次离心收集。调整温度为25-28℃，烟腈以0.4mol/L的终浓度加入到OD₆₀₀＝8的菌液中，并不断搅拌，当批底物反应完毕后再加入下一批底物，用HPLC检测反应液中各成分的含量，计算得到烟酰胺的浓度为598g/L，如图4所示。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种温泉热碱芽孢杆菌来源的腈水合酶的突变体

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1708

<212> DNA

<213> Caldalkalibacillus thermarum

<400> 1

atgaatggca ttcatgattt aggtggcatg gatggctttg gcaagatcat ccgcgaagag 60

aacgaaccgc tgttccacaa agactgggag cgcattgcct ttggtttatt aattggtacc 120

gccggtcaag gtctgtacaa tttagatgag ttccgccatg ccattgaacg catgaacccg 180

gtggactatt taaccagcgg ttattatggc cactgggtgg ccagcattgc aactttactg 240

gtggaaaaag gcattttaga tgccagtgaa ctggtgagcc gcacccagac ctatctggcc 300

cagccggata caaaaacccc gcgccgcgaa aacccggaac tggtgaacca tctggagcaa 360

gttattaagg tgggtgttag caccgtgcgc gaagttagta gcgccccgcg ctttaacgtg 420

ggtgaccgcg tgaaaaccaa gaacatccac ccgagtggtc atacccgtct gccgcgctat 480

gcccgcgata agtatggcgt gatcgcaatg taccacggtg cccatgtgtt tccggatgcc 540

aatgcccatg gcaaaggcga aagcccgcag catttatact gcattcgctt cgaagccaac 600

gaactgtggg gcattcaaca aggtgaagcc gtgtacatcg atctgtggga gagctatctg 660

gaaccggtta gccattaaaa ggagatatag atatgaaaga taacaacaaa gtgcatcacc 720

accacccgca tccggagtct ttttggagcg cccgtgcaaa ggctttagag tctttactga 780

ttgagaaagg cattctgagc agcgatgcca ttgatcgcgt tgtgcagcac tatgagcatg 840

aactgggtcc gatgaacggt gccaaagttg tggccaaggc ttggaccgat ccggccttta 900

aacagcgttt actggaagat ccggagaccg ttctgcgtga actgggttat tatggtttac 960

aaggtgaaca tatccgcgtg gtggagaaca ccgataccgt gcacaacgtg gtggtgtgca 1020

ccttatgtag ctgctatccg tggccgctgc tgggtttacc gcccgcttgg tataaagaac 1080

cgacctatcg cagccgcatt gttaaagagc cgcgtaaagt gctgcgcgaa gaatttggtt 1140

tagatttacc ggatacagtt gagattcgcg tgtgggatag cagcagtgaa atgcgctaca 1200

tggtgctgcc gcaacgcccg gaaggtaccg aaggcatgac cgaagaagaa ctggcaaaaa 1260

tcgtgacccg cgacagcatg attggcgtgg caaaagtgca gccgagcagc gtgaccgttc 1320

gctaaaagga gatatagata tggagaaaaa ttgcgtgagc cagagcgtgg atagcaaaat 1380

cgcctatctg ccggaaagcg cagcaccgcc gcgcaaaaac ggcgaactgg tgttcgaaga 1440

accgtgggaa cgccgcagct ttggtatggc tttagcttta tatgaggaaa agcgctatac 1500

cagctgggat gactttcgca cccgtttaat tcaagaaatc gccaaatggg agagcagcga 1560

gaaccaagat aaactggatt ggaactatta tgaacattgg ctggccgctt tagaacagct 1620

ggtggtggaa accggcatga tcgataaaca cgacattgac gcccgcacca aggagttttt 1680

aagcggcgaa cgcgatgagt ttttttaa 1708

<210> 2

<211> 225

<212> PRT

<213> Caldalkalibacillus thermarum

<400> 2

Met Asn Gly Ile His Asp Leu Gly Gly Met Asp Gly Phe Gly Lys Ile

1 5 10 15

Ile Arg Glu Glu Asn Glu Pro Leu Phe His Lys Asp Trp Glu Arg Ile

20 25 30

Ala Phe Gly Leu Leu Ile Gly Thr Ala Gly Gln Gly Leu Tyr Asn Leu

35 40 45

Asp Glu Phe Arg His Ala Ile Glu Arg Met Asn Pro Val Asp Tyr Leu

50 55 60

Thr Ser Gly Tyr Tyr Gly His Trp Val Ala Ser Ile Ala Thr Leu Leu

65 70 75 80

Val Glu Lys Gly Ile Leu Asp Ala Ser Glu Leu Val Ser Arg Thr Gln

85 90 95

Thr Tyr Leu Ala Gln Pro Asp Thr Lys Thr Pro Arg Arg Glu Asn Pro

100 105 110

Glu Leu Val Asn His Leu Glu Gln Val Ile Lys Val Gly Val Ser Thr

115 120 125

Val Arg Glu Val Ser Ser Ala Pro Arg Phe Asn Val Gly Asp Arg Val

130 135 140

Lys Thr Lys Asn Ile His Pro Ser Gly His Thr Arg Leu Pro Arg Tyr

145 150 155 160

Ala Arg Asp Lys Tyr Gly Val Ile Ala Met Tyr His Gly Ala His Val

165 170 175

Phe Pro Asp Ala Asn Ala His Gly Lys Gly Glu Ser Pro Gln His Leu

180 185 190

Tyr Cys Ile Arg Phe Glu Ala Asn Glu Leu Trp Gly Ile Gln Gln Gly

195 200 205

Glu Ala Val Tyr Ile Asp Leu Trp Glu Ser Tyr Leu Glu Pro Val Ser

210 215 220

His

225

<210> 3

<211> 210

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Met Lys Asp Asn Asn Lys Val His His His His Pro His Pro Glu Ser

1 5 10 15

Phe Trp Ser Val Arg Ala Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu Ile Glu Lys

20 25 30

Gly Ile Leu Ser Ser Asp Ala Ile Asp Arg Val Val Gln His Tyr Glu

35 40 45

His Glu Leu Gly Pro Met Asn Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ala Trp

50 55 60

Thr Asp Pro Ala Phe Lys Gln Arg Leu Leu Glu Asp Pro Glu Thr Val

65 70 75 80

Leu Arg Glu Leu Gly Tyr Tyr Gly Leu Gln Gly Glu His Ile Arg Val

85 90 95

Val Glu Asn Thr Asp Thr Val His Asn Val Val Val Cys Thr Leu Cys

100 105 110

Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Leu Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys

115 120 125

Glu Pro Thr Tyr Arg Ser Arg Ile Val Lys Glu Pro Arg Lys Val Leu

130 135 140

Arg Glu Glu Phe Gly Leu Asp Leu Pro Asp Thr Val Glu Ile Arg Val

145 150 155 160

Trp Asp Ser Ser Ser Glu Met Arg Tyr Met Val Leu Pro Gln Arg Pro

165 170 175

Glu Gly Thr Glu Gly Met Thr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Ile Val Thr

180 185 190

Arg Asp Ser Met Ile Gly Val Ala Lys Val Gln Pro Ser Ser Val Thr

195 200 205

Val Arg

210

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<211> 122

<212> PRT

<213> Caldalkalibacillus thermarum

<400> 4

Met Glu Lys Asn Cys Val Ser Gln Ser Val Asp Ser Lys Ile Ala Tyr

1 5 10 15

Leu Pro Glu Ser Ala Ala Pro Pro Arg Lys Asn Gly Glu Leu Val Phe

20 25 30

Glu Glu Pro Trp Glu Arg Arg Ser Phe Gly Met Ala Leu Ala Leu Tyr

35 40 45

Glu Glu Lys Arg Tyr Thr Ser Trp Asp Asp Phe Arg Thr Arg Leu Ile

50 55 60

Gln Glu Ile Ala Lys Trp Glu Ser Ser Glu Asn Gln Asp Lys Leu Asp

65 70 75 80

Trp Asn Tyr Tyr Glu His Trp Leu Ala Ala Leu Glu Gln Leu Val Val

85 90 95

Glu Thr Gly Met Ile Asp Lys His Asp Ile Asp Ala Arg Thr Lys Glu

100 105 110

Phe Leu Ser Gly Glu Arg Asp Glu Phe Phe

115 120

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<211> 210

<212> PRT

<213> Caldalkalibacillus thermarum

<400> 5

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1 5 10 15

Phe Trp Ser Ala Arg Ala Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu Ile Glu Lys

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Gly Ile Leu Ser Ser Asp Ala Ile Asp Arg Val Val Gln His Tyr Glu

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Thr Asp Pro Ala Phe Lys Gln Arg Leu Leu Glu Asp Pro Glu Thr Val

65 70 75 80

Leu Arg Glu Leu Gly Tyr Tyr Gly Leu Gln Gly Glu His Ile Arg Val

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Val Glu Asn Thr Asp Thr Val His Asn Val Val Val Cys Thr Leu Cys

100 105 110

Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Leu Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys

115 120 125

Glu Pro Thr Tyr Arg Ser Arg Ile Val Lys Glu Pro Arg Lys Val Leu

130 135 140

Arg Glu Glu Phe Gly Leu Asp Leu Pro Asp Thr Val Glu Ile Arg Val

145 150 155 160

Trp Asp Ser Ser Ser Glu Met Arg Tyr Met Val Leu Pro Gln Arg Pro

165 170 175

Glu Gly Thr Glu Gly Met Thr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Ile Val Thr

180 185 190

Arg Asp Ser Met Ile Gly Val Ala Lys Val Gln Pro Ser Ser Val Thr

195 200 205

Val Arg

210

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

aagaacatca gcccgagtgg tcataccc 28

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gaccactcgg gctgatgttc ttggttttca c 31

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ccagccggat gccccgaccc cgcgccgcga aaac 34

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ggcgcggggt cggggcatcc ggctgggcca g 31

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

ggcgcggggt cggggcatcc ggctgggcca g 31

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gggtatgacc cttcgggtgg atgttcttg 29

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

gcccatggcg ccggcgaaag cccgcag 27

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

gctttcgccg gcgccatggg cattggcat 29

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

ttttggagcg tgcgtgcaaa ggctttag 28

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

cctttgcacg cacgctccaa aaagactcc 29

Claims

1.一种腈水合酶突变体，其特征在于，含有β亚基、α亚基以及调控蛋白，其分别含SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述腈水合酶突变体的基因。

3.含有权利要求2所述基因的载体。

4.表达权利要求1所述腈水合酶的细胞。

5.一种基因工程菌，其特征在于，是以大肠杆菌为宿主，表达权利要求1所述的腈水合酶突变体。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21为宿主，以pET-24a(+)质粒为载体。

7.一种提高腈水合酶酶活力的方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的腈水合酶α亚基第20位甘丙基酸突变为缬氨酸。

8.权利要求5或6所述基因工程菌在发酵领域的应用。

9.一种生产权利要求1所述腈水合酶突变体的方法，其特征在于，将权利要求5或6所述的基因工程菌接种于LB培养基中，于35-37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入诱导剂IPTG于20-30℃诱导12-18h。

10.权利要求1所述腈水合酶突变体在制备含有烟酰胺或丙烯酰胺的产品中的应用。