CN109370997B

CN109370997B - 一种苯丙氨酸氨基变位酶突变体

Info

Publication number: CN109370997B
Application number: CN201811415904.5A
Authority: CN
Inventors: 周哲敏; 刘辉; 周丽; 崔文璟; 刘中美; 郭军玲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-11-26
Filing date: 2018-11-26
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2038-11-26
Also published as: CN109370997A

Abstract

本发明公开了一种苯丙氨酸氨基变位酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明的苯丙氨酸氨基变位酶的突变体序列如SEQ ID NO.2所示，该突变酶的比酶活相对于野生型提高了1.13倍，在50℃处理1小时仍有50％残留酶活性，温度稳定性相比野生酶有了较大的提高。同时该突变体也具备了更好的pH稳定性，有利于以后的工业生产。

Description

一种苯丙氨酸氨基变位酶突变体

技术领域

本发明涉及一种苯丙氨酸氨基变位酶突变体，属于酶工程技术领域。

背景技术

苯丙氨酸氨基变位酶(PAM)可用于催化苯丙氨酸发生异构化，催化α-苯丙氨酸转氨基变为药用价值更高的β-苯丙氨酸，β-苯丙氨酸是合成抗癌药物紫杉醇的重要前体，具有广阔的市场前景。但是，该反应是一个放热反应，生产过程中高温会影响酶的结构，导致酶活下降，进而产生了大量的能耗，提高了生产成本。此外，该酶在催化过程中酶活相对较低，不利于β苯丙氨酸的生成。在生产催化过程中，提高该的热稳定性以及酶活尤为重要。

目前，苯丙氨酸氨基变位酶主要来源于成团泛菌(Pantoea agglomerans)、海洋链霉菌(Streptomyces maritimus)和中华红豆杉(Taxus chinensis)。中华红豆杉来源的目的基因在原核生物中表达不够理想，海洋链霉菌来源的基因在温度较高时表现出苯丙氨酸裂解酶活性，而野生型成团泛菌来源的苯丙氨酸氨基变位酶活力和热稳定性也有限。因此，获得一种酶活提高、稳定性增强的苯丙氨酸氨基变位酶对于β-苯丙氨酸的工业化生产具有重要的应用价值。在公开号为CN108004225A的专利中，发明人团队构建了成团泛菌来源的苯丙氨酸氨基变位酶突变体K112R，其比酶活相对于野生型提高了10％。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种苯丙氨酸氨基变位酶突变体，含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的载体。

本发明的第四个目的是提供表达所述苯丙氨酸氨基变位酶突变体的细胞。

本发明的第五个目的是提供一种基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达SEQ IDNO,2所示的苯丙氨酸氨基变位酶突变体K340R。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌BL21为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET系列质粒为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET28a。

本发明的第六个目的是提供一种提高苯丙氨酸氨基变位酶稳定性的方法，所述方法是将SEQ ID NO.3所示的苯丙氨酸氨基变位酶第340位赖氨酸突变为精氨酸

本发明的第七个目的是提供一种生产所述苯丙氨酸氨基变位酶突变体的方法，将表达所述苯丙氨酸氨基变位酶突变体的基因工程菌接种于LB培养基中，35-37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG于20-22℃诱导16-18h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述基因工程菌接种于含卡那霉素的LB表达培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至0.1mM，20℃诱导16-18h，表达苯丙氨酸氨基变位酶突变体酶。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括收集所述基因工程菌的菌体，将菌体破碎后收集上清，将上清膜过滤后，用His Trap HP柱分离得到苯丙氨酸氨基变位酶突变体。

本发明还提供所述苯丙氨酸氨基变位酶突变体及所述基因工程菌在制备含有β-苯丙氨酸的产品中的应用。

有益效果：本发明提供的苯丙氨酸氨基变位酶突变体K340R的最适pH为8.5，最适温度为50℃，50℃处理1小时仍有50％残留酶活性，相比野生酶50℃处理1小时剩余20％酶活，提高了约1.5倍；突变体热稳定性有明显提高。同时该突变体也具备了更好的催化活性，比酶活相较于野生酶提高了1.13倍；因此，本发明提供的苯丙氨酸氨基变位酶突变体K340R，具有很好的酶学性质，有利于以后的工业生产。

附图说明

图1：野生酶和突变酶K340R在不同温度下的酶活曲线，Pa(wt)为野生酶。

图2：野生酶和突变酶K340R在50℃下不同pH下的酶活曲线，Pa(wt)为野生酶。

图3：野生酶和突变酶K340R在50℃下保存后的热稳定性曲线，Pa(wt)为野生酶。

图4：野生酶和突变酶K340R在50℃下的酶活柱状图，Pa(wt)为野生酶。

图5：野生酶和突变体酶在50℃下的相对酶活柱状图，Pa(wt)为野生酶。

具体实施方式

酶活的定义(U)：每分钟转化L-α-苯丙氨酸生成1μmol/Lβ-苯丙氨酸所需的酶量定义为1U。

比酶活(U/mg)：每毫克PAM的酶活。

相对(剩余)酶活的定义：将野生酶和突变酶在pH＝8.5的PBS缓冲液中，温度为50℃反应30分钟，测定产物生成量，以野生酶催化的产量为标准定义为100％。

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，NaCl 10g/L。

苯丙氨酸氨基变位酶反应体系：底物为200μL 20mM的L-α-苯丙氨酸，加入100μg纯酶，加入磷酸盐缓冲液200μL在一定温度下反应30min后用100℃高温终止反应，并离心去除沉淀，取上清过0.22μm的膜后作为液相测定的样品。

苯丙氨酸氨基变位酶检测：采用安捷伦1260进行HPLC检测，流动相为水乙腈缓冲液；检测波长254nm，流速为0.5ml/min；色谱柱为C18柱。

最适反应pH的确定：分别在不同pH缓冲液中测定野生酶和突变体的酶活，计算相对酶活，确定最适反应pH。

最适反应温度的确定：分别在不同温度条件下测定野生酶和突变体酶活，确定相对酶活，确定最适反应温度。

温度稳定性的确定：将野生酶和突变体在pH＝8.5的PBS缓冲液中，50℃分别保温30分钟、1小时、2小时后测定残留酶活，得到温度稳定性结果。

实施例1

(1)突变体K340R的构建：

化学合成法合成Pa-PAM基因(如SEQ ID NO.1所示)，并将该基因克隆于pET28a质粒的NdeI和HindIII酶切位点处，由天霖生物技术公司完成，获得pET28a-PAM重组质粒。以pET28a-PAM为模版，用表1所示引物在表2所示条件下PCR，PCR产物转化E.coli JM109后获得携带编码突变体基因的重组质粒pET28a-PAM-K340R。将重组质粒pET28a-PAM-K340R转化E.coli BL21菌株，获得重组菌株BL21/pET28a-PAM-K114R。

表1引物

P1	GCGGATACGCTGAAGAATATTAGACAAACGTTGACT
		P2	CAGCTCGTTAGTCAACGTTTGTCTAATATTCTTCAG

表2全质粒PCR扩增反应体系

试剂	用量
		ddH<sub>2</sub>O	32μL
5×PS Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	10μL
		dNTPMixture(2mmol/L)	4μL
P1(10mmol/L)、P2(10mmol/L)	各1μL
		pET28a-PAM	1μL
Primer STAR HS DNA聚合酶	1μL
		共计	50μL

PCR扩增反应条件为：

PCR产物用琼脂糖凝胶电泳方法鉴定。然后将PCR产物纯化、消化后转入大肠杆菌BL21感受态细胞。

(2)将重组大肠杆菌BL21/pET28a-PAM-K340R接种于4mL卡那霉素浓度为100μg/mL的LB培养基(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L)，37℃、200r/min振荡过夜培养。

将上述过夜培养物按1％(v/v)的接种量接种于含卡那霉素浓度为100μg/mL的100mL LB表达培养基(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L)中，37℃、200r/min振荡培养至OD₆₀₀至0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至0.1mM，20℃诱导16-18h得到菌体，5000g的转速离心收菌。

(3)将重组菌体溶于20mL结合缓冲溶液(50mmol/L Na₂HPO₄、50mmol/L NaH₂PO₄、500mmol/L NaCl、20mmol/L imidazole)，超声破碎，13000g离心25min，上清用0.22μm滤膜过滤。用10倍柱体积的结合缓冲溶液平衡1mL的His Trap HP柱，用15倍柱体积的结合缓冲溶液洗去非特异性吸附的蛋白，分别用8倍柱体积的150、300和500mmol/L咪唑的缓冲液洗脱蛋白，收集样品并用SDS-PAGE分析鉴定。

实施例2

在200μL缓冲反应体系中加入100μg实施例1纯化后的突变酶，加底物L-α-苯丙氨酸200μL，在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下反应30min，确定相应酶活。以未突变的野生酶作为对照，其它条件与突变酶相同。

如图1所示，突变酶在温度为40℃以及45℃，相对酶活分别为45％及67％，55℃和60℃时，突变酶的相对酶活分别为71％和62％，野生酶在温度为40℃以及45℃，相对酶活分别为96％及98％，55℃和60℃时，突变酶的相对酶活分别为88％和78％。

实施例3

配制不同pH的PBS缓冲溶液：pH 8.0-9.0、1/15mM磷酸盐缓冲液，pH＝9.0-9.5，100mMTris-HCL缓冲液。将野生酶和突变体酶分别在不同pH缓冲溶液中50℃下反应30min后，测定酶活。

如图2所示，在pH＝8.5时，酶活最高，定义为100％，在pH为8、9.5时，突变酶酶活都保持在80％以上。

实施例4

将野生酶和突变酶分别取100μg于200μL缓冲液中，保存于50℃金属浴中30min-2h，取样，测定残留酶活。

如图3所示，发现突变体在50℃下处理60min后，突变酶的剩余酶活由野生酶的20％提高到50％；在50℃处理30min和120min后，突变酶的相对酶活由野生酶的49％和18％提高到66％和50％。突变体热稳定性有明显提高。

实施例5

将野生酶和突变酶分别取100μg于200μL缓冲液中，以α苯丙氨酸为底物反应在50℃金属浴中30min，取样100℃灭活，测定野生型酶和突变体酶活。以原酶催化的产物产量为标准，定义为100％。

如图4所示，发现突变体在50℃下反应30min后比酶活上升，突变酶的比酶活比野生型提高了1.13倍，突变体酶活有明显提高，催化效率提升。

实施例6

配置底物浓度为1mM、3mM、5mM、7mM、10mM、12mM、15mM和20mM的α-苯丙氨酸，进行催化反应，检测产物生成速率，利用origin软件进行数据拟合，测出K_m值和K_cat值，并计算比酶活。对野生酶和突变酶的动力学参数进行分析，结果如表3所示，发现K_m值和K_cat值均没有大幅度变化，比酶活提高了1.13倍。

表3野生酶(WT)和突变体动力学参数。

对比例

以SEQ ID NO.3所示的苯丙氨酸氨基变位酶为亲本酶，分别将299、402、501、521位的赖氨酸突变为精氨酸，获得酶突变体K299R、K402R、K501R、K521R。在pH＝8.5的PBS缓冲液中，温度为50℃反应30分钟，测定产物生成量，以野生酶催化的产量为标准定义为100％。K299R、K402R、K501R、K521R、K312R的相对酶活分别为62％、115％、75％、67％、225％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种苯丙氨酸氨基变位酶突变体

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1626

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgagcattg tgaatgaaag cggtagccag ccggttgtta gccgtgatga aaccctgagc 60

cagattgaac gtaccagctt tcatattagc agcggcaaag atattagcct ggaagaaatt 120

gcacgcgcag cacgtgatca tcagccggtt acactgcatg atgaagttgt taatcgtgtt 180

acccgtagcc gtagcattct ggaaagcatg gttagtgatg aacgtgtgat ttatggtgtg 240

aataccagca tgggtggttt cgttaactat attgttccga ttgcaaaagc aagcgaactg 300

cagaataatc tgattaatgc agttgccacc aatgtgggca aatatttcga tgataccacc 360

gttcgtgcaa ccatgctggc acgtattgtt agcctgagcc gtggtaatag cgcaattagc 420

attgtcaact tcaaaaaact gatcgagatc tacaatcagg gtattgtgcc gtgtattccg 480

gaaaaaggta gcctgggcac cagcggtgat ctgggtccgc tggcagcaat tgcactggtt 540

tgtaccggtc agtggaaagc acgttatcag ggtgagcaga tgagcggtgc aatggcactg 600

gaaaaagcag gtattagccc gatggaactg agctttaaag aaggtctggc actgattaac 660

ggtacaagcg caatggttgg tctgggtgtt ctgctgtatg atgaggttaa acgtctgttt 720

gatacctatc tgaccgttac cagcctgagc attgaaggtc tgcatggtaa aaccaaaccg 780

tttgaaccgg cagttcatcg tatgaaaccg catcagggtc agctggaagt tgcaaccacc 840

atttgggaaa ccctggcaga tagcagcctg gcagttaatg aacatgaagt tgagaaactg 900

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cagaccctga ccaatgaact gaatagcagc aatgataatc cgctgattga tcagaccacc 1080

gaagaagttt ttcataacgg tcattttcat ggccagtatg tgagcatggc aatggatcat 1140

ctgaatattg ccctggttac catgatgaat ctggcaaatc gtcgtattga tcgcttcatg 1200

gataaaagca atagcaatgg tctgcctccg tttctgtgtg cagaaaatgc aggtctgcgt 1260

ctgggtctga tgggtggtca gtttatgacc gcaagcatta ccgcagaaag ccgtgcaagc 1320

tgtatgccga tgagcattca gagcctgagt accaccggtg attttcagga tattgtgagc 1380

tttggtctgg ttgcagcacg tcgtgttcgt gaacagctga aaaatctgaa atatgtgttt 1440

agcttcgaac tgctgtgtgc atgtcaggca gttgatattc gtggcaccgc aggtctgagc 1500

aaacgtaccc gtgcactgta tgataaaacc cgtacactgg ttccgtatct ggaagaagat 1560

aaaaccatca gcgattatat cgaaagcatt gcacagaccg ttctgaccaa aaacagcgat 1620

atttaa 1626

<210> 2

<211> 541

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Ser Ile Val Asn Glu Ser Gly Ser Gln Pro Val Val Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Thr Leu Ser Gln Ile Glu Arg Thr Ser Phe His Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Lys Asp Ile Ser Leu Glu Glu Ile Ala Arg Ala Ala Arg Asp His Gln

35 40 45

Pro Val Thr Leu His Asp Glu Val Val Asn Arg Val Thr Arg Ser Arg

50 55 60

Ser Ile Leu Glu Ser Met Val Ser Asp Glu Arg Val Ile Tyr Gly Val

65 70 75 80

Asn Thr Ser Met Gly Gly Phe Val Asn Tyr Ile Val Pro Ile Ala Lys

85 90 95

Ala Ser Glu Leu Gln Asn Asn Leu Ile Asn Ala Val Ala Thr Asn Val

100 105 110

Gly Lys Tyr Phe Asp Asp Thr Thr Val Arg Ala Thr Met Leu Ala Arg

115 120 125

Ile Val Ser Leu Ser Arg Gly Asn Ser Ala Ile Ser Ile Val Asn Phe

130 135 140

Lys Lys Leu Ile Glu Ile Tyr Asn Gln Gly Ile Val Pro Cys Ile Pro

145 150 155 160

Glu Lys Gly Ser Leu Gly Thr Ser Gly Asp Leu Gly Pro Leu Ala Ala

165 170 175

Ile Ala Leu Val Cys Thr Gly Gln Trp Lys Ala Arg Tyr Gln Gly Glu

180 185 190

Gln Met Ser Gly Ala Met Ala Leu Glu Lys Ala Gly Ile Ser Pro Met

195 200 205

Glu Leu Ser Phe Lys Glu Gly Leu Ala Leu Ile Asn Gly Thr Ser Ala

210 215 220

Met Val Gly Leu Gly Val Leu Leu Tyr Asp Glu Val Lys Arg Leu Phe

225 230 235 240

Asp Thr Tyr Leu Thr Val Thr Ser Leu Ser Ile Glu Gly Leu His Gly

245 250 255

Lys Thr Lys Pro Phe Glu Pro Ala Val His Arg Met Lys Pro His Gln

260 265 270

Gly Gln Leu Glu Val Ala Thr Thr Ile Trp Glu Thr Leu Ala Asp Ser

275 280 285

Ser Leu Ala Val Asn Glu His Glu Val Glu Lys Leu Ile Ala Glu Glu

290 295 300

Met Asp Gly Leu Val Lys Ala Ser Asn His Gln Ile Glu Asp Ala Tyr

305 310 315 320

Ser Ile Arg Cys Thr Pro Gln Ile Leu Gly Pro Val Ala Asp Thr Leu

325 330 335

Lys Asn Ile Arg Gln Thr Leu Thr Asn Glu Leu Asn Ser Ser Asn Asp

340 345 350

Asn Pro Leu Ile Asp Gln Thr Thr Glu Glu Val Phe His Asn Gly His

355 360 365

Phe His Gly Gln Tyr Val Ser Met Ala Met Asp His Leu Asn Ile Ala

370 375 380

Leu Val Thr Met Met Asn Leu Ala Asn Arg Arg Ile Asp Arg Phe Met

385 390 395 400

Asp Lys Ser Asn Ser Asn Gly Leu Pro Pro Phe Leu Cys Ala Glu Asn

405 410 415

Ala Gly Leu Arg Leu Gly Leu Met Gly Gly Gln Phe Met Thr Ala Ser

420 425 430

Ile Thr Ala Glu Ser Arg Ala Ser Cys Met Pro Met Ser Ile Gln Ser

435 440 445

Leu Ser Thr Thr Gly Asp Phe Gln Asp Ile Val Ser Phe Gly Leu Val

450 455 460

Ala Ala Arg Arg Val Arg Glu Gln Leu Lys Asn Leu Lys Tyr Val Phe

465 470 475 480

Ser Phe Glu Leu Leu Cys Ala Cys Gln Ala Val Asp Ile Arg Gly Thr

485 490 495

Ala Gly Leu Ser Lys Arg Thr Arg Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Arg Thr

500 505 510

Leu Val Pro Tyr Leu Glu Glu Asp Lys Thr Ile Ser Asp Tyr Ile Glu

515 520 525

Ser Ile Ala Gln Thr Val Leu Thr Lys Asn Ser Asp Ile

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<210> 3

<211> 541

<212> PRT

<213> Pantoea agglomerans

<400> 3

Met Ser Ile Val Asn Glu Ser Gly Ser Gln Pro Val Val Ser Arg Asp

1 5 10 15

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Lys Asp Ile Ser Leu Glu Glu Ile Ala Arg Ala Ala Arg Asp His Gln

35 40 45

Pro Val Thr Leu His Asp Glu Val Val Asn Arg Val Thr Arg Ser Arg

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Ser Ile Leu Glu Ser Met Val Ser Asp Glu Arg Val Ile Tyr Gly Val

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Ile Val Ser Leu Ser Arg Gly Asn Ser Ala Ile Ser Ile Val Asn Phe

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275 280 285

Ser Leu Ala Val Asn Glu His Glu Val Glu Lys Leu Ile Ala Glu Glu

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Ser Phe Glu Leu Leu Cys Ala Cys Gln Ala Val Asp Ile Arg Gly Thr

485 490 495

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Leu Val Pro Tyr Leu Glu Glu Asp Lys Thr Ile Ser Asp Tyr Ile Glu

515 520 525

Ser Ile Ala Gln Thr Val Leu Thr Lys Asn Ser Asp Ile

530 535 540

Claims

1.一种苯丙氨酸氨基变位酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.编码权利要求1所述苯丙氨酸氨基变位酶突变体的基因。

3.含有权利要求2所述基因的载体。

4.表达权利要求1所述苯丙氨酸氨基变位酶突变体的细胞。

5.一种基因工程菌，其特征在于，是以大肠杆菌为宿主，表达SEQ ID NO.2所示的苯丙氨酸氨基变位酶突变体。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21为宿主，以pET系列质粒为载体。

7.一种提高苯丙氨酸氨基变位酶稳定性的方法，其特征在于，将SEQ ID NO.3所示的苯丙氨酸氨基变位酶第340位氨基酸突变为精氨酸。

8.一种生产权利要求1所述苯丙氨酸氨基变位酶突变体的方法，其特征在于，将权利要求5或6所述的基因工程菌接种于LB培养基中，于35-37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入诱导剂IPTG于20-22℃诱导16-18h。

9.权利要求1所述苯丙氨酸氨基变位酶突变体或权利要求5或6所述基因工程菌在制备含有β-苯丙氨酸的产品中的应用。